大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)在环境和动物体内外广泛存在，可通过饮水、食物以及密切接触等途径传播[1]。粪便是E. coli的“储存库”[2]，可向外界散播病原菌，污染饮水、饲草、农作物[3]，也可改变黏膜屏障破坏体内菌群平衡或感染局部组织[4]，最终危害人类和动物健康。养殖场通常添加干燥土壤和秸秆维持运动场的干燥和洁净，同时也为微生物提供了繁殖场所，对动物健康存在潜在危险。粪便作为有机肥料，用于农作物生产[5]，可增加动植物间的传播和食物链污染的风险[6]。
目前动物感染和动物产品污染致病性E. coli在动物健康和公共卫生安全上是一个严重的问题。2019年4月在美国10个州暴发的牛肉污染E. coli O103事件强调了流行病学调查和寻找简便高效的微生物溯源技术及分型方法的重要性[7]。因此，准确、快速地比较菌株间亲缘关系和精细分型，对流行病学调查、控制和预防具有重要意义。本试验选择奶牛养殖环境分离E. coli进行亲缘关系和系统进化分群分析，以期为健康养殖提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 样品来源2017—2019年，在新疆某大型奶牛场(养殖规模2.5万头)相对固定位置采集样品209份，见表 1。粪(土)样用五点混合采样法采集，在运动场或粪池四周的中点及中心采样(粪土五个点的样同样由五点采样法所得)，每点均采500 g或500 mL左右，装入自封袋或灭菌瓶，同一运动场或粪池的样混匀为1份。采奶样时，将乳房擦拭消毒，弃去前2把，收集8~10 mL于无菌离心管。水样则随机选择3个使用水的出水口，各采集500 mL。空白土壤和苜蓿地样品采集同粪(土)。
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表 1 样品来源 Table 1 Sample source |
PCR仪、凝胶成像仪(美国Applied Biosystems)、电泳仪(北京六一)、移液器和高速离心机(Eppendorf)。细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；Premix Taq TM、10×Taq Buffer(Mg2+)、dNTP(2.5 mmol·L-1 each)、Taq酶(5 U·μL-1)、DNA Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司；培养基购自广东环凯微生物科技有限公司。
1.3 引物设计 1.4 大肠杆菌的分离纯化称取除奶及水外的样品100 g或100 mL，加入400 mL灭菌LB液体培养基，混匀，吸上清液5 mL接于100 mL灭菌LB液体培养，37 ℃，160 r·min-1条件下增菌15 h。吸取1 mL奶样或水样，加到9 mL LB灭菌液体培养基中，增菌。无菌条件下蘸取增菌液，在麦康凯培养基上接种，37 ℃倒置培养18 h，挑取疑似单菌落2~5个，直至纯化；将纯化后的菌接于伊红美蓝培养基，37 ℃培养16 h，观察菌落是否为黑色带金属光泽，若是则保留，否则舍弃。
1.5 分离菌株的鉴定、去重及同源性分析用纯化菌株DNA为模板，扩增16S rRNA序列。反应体系25 μL：2×Taq Primer Mix 12.5 μL，通用上下游引物、DNA模板各1 μL，ddH2O 9.5 μL。反应退火条件为53 ℃ 45 s。扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，拍照记录。把符合预期大小的产物送上海派森诺生物有限公司测序，将测序结果进行比对，按相似性≥99%判定。对分离E. coli用ERIC-PCR扩增、电泳，来自同一样品中条带数目及大小一致的菌株视为重复，仅留1株。用MEGA7.0软件对保留E. coli序列与参考株16S rRNA基因序列构建遗传进化树，进行同源性分析。
1.6 大肠杆菌的ERIC-PCR基因分型以非重复E. coli的DNA做模板，用Eric引物扩增，体系20 μL：10×Taq Buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、Taq酶1 μL、ERIC引物各0.5 μL，模板DNA1.5 μL；ddH2O 12 μL。反应退火条件为52 ℃ 1 min。扩增产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，并拍照记录，把≥2条带的菌株用Bio Numerics软件绘制UPGMA聚类图，条件位置差异容许度和优化值为1.5%。按相似度≥75%为同一型判定多态性。
1.7 大肠杆菌的系统进化分群参考Clermont[8]的方法，进行系统发育分群试验。
2 结果 2.1 细菌分离鉴定、去重及同源性分析经增菌、特异性培养基分离纯化、16S rRNA PCR检测、测序、Blast比对及ERIC去重，141份分离出338株E.coli，2017—2019年分别为104、118和116株。分离率为67.46%(141/209)；粪(土)样品分离率最高，为100%；2017—2019年奶样分离率分别为46.67%、56.67%和73.33%；2017年空白土壤和苜蓿地样品分离率为25%，其余样品未分离出E. coli。经16S rRNA相似性分析，较多粪(土)样分离菌株与MN208150.1(尿液或环境分离，条件致病性)的相似性达100%。
2.2 ERIC-PCR基因分型ERIC-PCR分型的条带数为2~9，大小500~5 000 bp，将E. coli分为Ⅰ~ⅩⅣ共14型。Ⅳ型为优势型，196株，相似度77.7%~100%，29组菌株条带相同，包括空白土壤分离E. coli；其次为Ⅰ型(59株)、Ⅴ(31株)、Ⅹ(11株)；剩余41株分布在其他10种型，部分聚类图见图 1。2株苜蓿地样品分离E. coli在Ⅳ和ⅩⅢ型，与同年粪(土)样分离菌株基因型相同。奶样分离E. coli的86.90%(73/84)聚在Ⅳ、Ⅰ、Ⅴ型，Ⅵ、Ⅷ、ⅩⅣ型无分布；90.48%与同年的粪(土)分离菌株同聚一型。
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图 1 大肠杆菌ERIC-PCR基因分型的部分聚类树状图 Fig. 1 Part of the cluster tree of ERIC-PCR typing of E. coli |
338株E. coli被分为6个群，B1群占比最大，为75.45%(255/338)，其次是A、C、D或E和F群，分别为18.34%(62/338)、2.96%(10/338)、1.18%(4/338)和0.30%(1/338)。2018和2019年奶源分离菌各1株未分型。不同来源E. coli均B1群占主导。大育成牛运动场粪土源E. coli只有B1群；病牛粪土源E. coli系统进化群最丰富，详情见图 2。
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A.原粪样品；B.奶样；C.运动场粪土样品。ND. 未分类的；占比(Y轴)=某种样品某群菌株数/本样品总菌株数×100% A. dung samples; B. milk samples; C. manure samples. ND. Unclassified; Percentage (Y-axis) = number of certain type bacteria in a sample/total bacteria in the sample×100% 图 2 不同样品分离E. coli的系统进化分群类型分布及占比 Fig. 2 Distribution and proportion of phylogenetic groups of E. coli isolated from different samples |
自然界E. coli广泛分布，可通过粪便和废水排入环境，通过食物链进入人体，一些致病性E. coli不仅给畜牧业发展造成危害，还威胁人类健康[10]。因此，了解养殖环境E. coli流行情况及遗传进化分群关系对预防疾病和维护健康至关重要，故本试验以养殖场环境E. coli为研究对象。本研究67.46%的分离率，与山东地区牛粪便和场污水78.6%和71.4%的分离率不同[11]；粪样分离率与新疆不同日龄犊牛粪源E. coli的分离率[12]相同。受地理位置、管理方式、粪便处理方法、采样因素的影响，分离率存在差异。
ERIC-PCR分型是高效、便捷、低成本的分子分型方法，是基于基因间重复共有序列进行PCR扩增，由条带数目及大小进行分型，用于评估菌株的遗传多样性和亲缘关系。Staji等[13]发现，同一来源分离菌株基因存在差异，不同来源也可有较近的亲缘关系。郑晓风等[14]用ERIC-PCR方法发现菌株间存在交叉传播。本研究将E. coli分为14种型，可见其广泛的DNA多样性。90.48%奶样分离菌株与粪(土)分离菌株亲缘关系较近，表明E. coli会通过多途径水平传播。基于ERIC-PCR，27株O157：H7 E. coli分为8种型[15]；我国华东地区的103株临床乳腺炎E. coli被分为10个型[16]。本试验ERIC基因多样性与上述报道存在差异，可能因地理位置、血清型不同造成。
E. coli致病力与系统发育群有关[17]。胃肠道黏膜上的共生E. coli无致病性，通常为A和B1群；引起肠道感染的大都为A、B1或D群；引起肠外感染的分布于B2和D群[18]，说明A和B1群为条件致病性，B2和D群致病性较强。本研究分离E. coli大都是条件致病性的，分阶段管理、提高饲养水平、及时并合理处理粪便可减少动物发病。张星星等[19]报道新疆腹泻犊牛粪源E. coli主要为A群，其次是D、B1、B2群；佟盼盼等[20]报道新疆地区牛源产志贺毒素E. coli(STEC)以A群为主(94.74%)，E群2.39%，B1、D和F群较少；张德显[21]调查发现A群是辽宁地区临床乳腺炎E. coli优势群；本研究显示，奶牛养殖环境中E. coli主要为B1群，其次为A群，还有5.62%的C+D+E+F群；与上述两报道不一致，一方面可能是早期的方法将C群归入A群，而本文采用了最新的方法；另一方面样品来源不同，可能影响试验结果。本研究未检测到B2群，与马帅等的研究[22]相比多出分离自病牛运动场粪土的F群；Sarowska等[23]报道F群与B2群相关，本研究结果与Sarowska等的报道相吻合。Rehman等[24]和Bessalah等[25]用最新方法分别研究腹泻牦牛源和不同健康状况骆驼源E. coli，结果显示分别以A(79.5%)和B1群(53%)为主。本结果与其结果存在不同，这些差异可能与动物种类、健康状况及地理位置有关，需进一步研究证实。
4 结论通过对E. coli的分离鉴定，共获得非重复菌株338株；ERIC-PCR将其分为Ⅰ~ⅩⅣ共14种型，Ⅳ型为优势型；不同时间、生长阶段及来源E. coli的系统进化分群以B1群为主。
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