2. 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心, 扬州 225009;
3. 南通市动物疫病预防控制中心, 南通 226011
, CHEN Jie1,3, WEN Shuangquan1,2, ZOU Hui1,2, GU Jianhong1,2, LIU Xuezhong1,2, BIAN Jianchun1,2, LIU Zongping1,2, YUAN Yan1,2
2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China;
3. Nantong Animal Disease Prevention and Control Center, Nantong 226011, China
镉(cadmium，Cd)是一种存在于环境中的重金属，与许多重金属不同，Cd具有良好的水溶性，可经水体在土壤中富集并被植物吸收，通过食物链进入人和动物体内[1]。呼吸系统和消化系统是Cd进入机体的主要途径[2]，Cd可通过Ca2+通道和金属离子转运蛋白进入细胞，并紊乱细胞内环境，引起细胞凋亡[3-4]。凋亡是细胞程序性死亡的方式之一，细胞凋亡的有序进行在维持细胞新陈代谢中发挥重要调控作用。诱导细胞凋亡是Cd的毒性作用机制之一。大脑是Cd富集和损伤的重要靶器官之一，Cd可以改变血脑屏障通透性，透过血脑屏障进入神经细胞，引起神经细胞凋亡[2, 5]。
凋亡由不同的信号通路触发，主要包括死亡受体通路和线粒体通路，其中，Fas/FasL通路是最为经典的死亡受体通路，参与调控多种细胞的凋亡[6]。Fas形成三聚体与配体FasL结合，再与具有死亡结构域的Fas相关死亡域蛋白(Fas-associated death domain，FADD)结合，进一步激活caspase-8引起细胞凋亡[7]。此外，由细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular-signal regulated protein kinases，ERKs)、Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal kinases，JNKs)和p38/应激激活蛋白激酶(stress-activated protein kinases，SAPKs)3个家族组成的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路是介导细胞凋亡的另一重要通路[8]。研究表明，镉可通过Fas/FasL通路[6]、线粒体通路[9]和MAPK通路[10]诱导神经细胞凋亡。此外，凋亡信号通路之间存在密切的串扰关系。MAPK信号通路可作为Fas/FasL信号通路的上游信号参与调控细胞凋亡。研究发现，抑制MAPK通路可抑制Fas/FasL通路的激活减轻磷脂酶A2(PLA2)诱导的人白血病U937细胞凋亡[11]。此外，Fas/FasL信号通路也可作为上游信号调控MAPK信号通路参与调控细胞凋亡。研究表明，抑制Fas/FasL通路可抑制MAPK通路的激活，缓解急性胰腺炎诱导的肝细胞凋亡[12]。本课题组前期研究发现，Fas/FasL通路可激活线粒体通路参与镉致PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)凋亡[13]。然而，在镉诱导PC12细胞凋亡过程中，Fas/FasL通路对镉激活MAPK通路的影响尚不明确。
本研究通过10 μmol·L-1醋酸镉(cadmium acetate，CdAc2)分别处理插入非特异性序列PC12细胞与Fas基因沉默PC12细胞12 h；用10 μmol·L-1 CdAc2与40 μmol·L-1 Z-IETD-FMK(caspase-8特异性抑制剂)单独或联合处理PC12细胞12 h，通过流式细胞术检测细胞凋亡率，Hoechst33258荧光染色法检测细胞凋亡形态学变化，Western blot法检测Fas/FasL通路相关蛋白Fas、FasL、FADD、Cleaved caspase-8、死亡结构域相关蛋白(death domain associated protein，Daxx)、凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)与MAPK通路相关蛋白ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表达情况，旨在探讨Fas/FasL通路对镉激活PC12细胞MAPK通路的影响。
1 材料与方法 1.1 试验细胞株PC12细胞(rat pheochromocytoma cell)购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库(ATCC Number：CRL-1721)；Fas基因沉默PC12细胞株由本课题组前期构建。
1.2 主要试剂RPMI 1640和胎牛血清(Life Technologies，USA)，L-谷氨酰胺和青链霉素(BBI，USA)，Fas、FasL、FADD、Cleaved caspase-8兔多克隆抗体(Abcam，UK)，Daxx、ASK1、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2、p-JNK1/2兔单克隆抗体(CST，USA)，β-actin和辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔二抗(CST，USA)，嘌呤霉素(Invitrogen，USA)，Fas shRNA慢病毒和NC shRNA慢病毒(山东维真生物科技有限公司)，L-多聚赖氨酸、Hoechst 33258、醋酸镉(Sigma-Aldrich，USA)，Z-IETD-FMK(Abcam，UK)，别藻蛋白(APC)和7-氨基放线菌素D(7-AAD)细胞凋亡双染试剂(BD，USA)，其余试剂均为国产分析纯。
1.3 主要仪器DMI3000B型倒置显微镜(Leica，Germany)，EPOCH型酶标仪(BioTek，USA)，蛋白质电泳设备、转膜设备及GIS-1000凝胶成像处理系统(BIO-RAD，USA)，Tanon化学发光成像分析系统(上海天能科技有限公司)，激光共聚焦显微镜(Leica，Germany)，FACS Aria型流式细胞仪(BD，USA)。
1.4 1640培养液配制RPMI 1640培养基一袋(10.4 g)，碳酸氢钠1.5 g，丙酮酸钠0.1 g，葡萄糖2.5 g，完全溶解于800 mL超纯水中，调节pH至7.2~7.4，定容至1 L。0.22 μm正压滤膜器过滤除菌，分装，4 ℃保存备用。使用前加入10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1链霉素，2 mL谷氨酰胺。
1.5 细胞培养将PC12细胞、插入非特异性序列PC12细胞(NC组细胞)或Fas基因沉默PC12细胞(Fas shRNA组细胞)用RPMI 1640完全培养液于37 ℃、50 mL·L-1CO2培养箱中培养，当细胞融合率达到80%，进行传代(1∶2~1∶4)培养。
1.6 Hoechst 33258染色观察细胞核形态的变化将NC组和Fas shRNA组细胞以每孔1.0×105个细胞密度分别接种于加有玻璃爬片并用L-多聚赖氨酸包被的的24孔板中培养24 h(细胞处于对数生长期)，根据本课题组前期研究结果[13]，本研究选择10 μmol·L-1 CdAc2分别处理NC组细胞(Cd组)和Fas shRNA组细胞(Fas shRNA+Cd组)12 h，弃培养基，4%多聚甲醛4 ℃固定30 min，PBS漂洗2次，加入5 mg·L-1 Hoechst 33258荧光染色液室温避光孵育10 min，PBS漂洗2次，封片，激光共聚焦显微镜观察拍照。
1.7 流式细胞术检测细胞凋亡率将NC组和Fas shRNA组细胞以每孔1.0×106个细胞密度分别接种于6孔培养板上培养24 h(细胞处于对数生长期)，用10 μmol·L-1 CdAc2处理NC组细胞(Cd组)和Fas shRNA组细胞(Fas shRNA+Cd组)12 h。处理完成后，收集细胞，离心弃上清，用1 mL PBS洗涤细胞2次。加入200 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，200目筛网过滤细胞至流式管中，别藻蛋白(APC)和7-氨基放线菌素D(7-AAD)各5 μL单独或联合处理，室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞占总细胞比例和即为细胞凋亡率。
1.8 免疫印迹法检测相关蛋白表达10 μmol·L-1 CdAc2分别处理NC组(Cd组)与Fas shRNA组(Fas shRNA+Cd组)PC12细胞12 h；或根据本课题组前期研究结果[13]，用40 μmol·L-1 Z-IETD-FMK与10 μmol·L-1 CdAc2单独或联合处理PC12细胞12 h。离心收集细胞，添加含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液(1∶100)，超声破碎细胞，于冰上裂解20 min，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，收集上清，BCA法测定蛋白浓度并将浓度调成一致，加入5×SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上样缓冲液，隔水煮沸8 min，于超低温冰箱保存备用。蛋白样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离后，转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入相应一抗，4 ℃孵育过夜，含吐温20的三羟甲氨基甲烷缓冲液(TBST)洗涤6次，5 min·次-1，根据一抗来源孵育对应的HRP标记的二抗，室温孵育2 h；含吐温20的三羟甲氨基甲烷缓冲液(TBST)洗涤6次，5 min·次-1。利用Tanon化学发光成像系统进行增强性化学发光法(ECL)显影检测蛋白表达情况，Image Lab软件分析灰度值，目的蛋白条带灰度值与β-actin蛋白条带灰度值的比值，即为目的蛋白的相对表达量。
1.9 统计学分析所有组别试验至少重复3次，采用SPASS 22.0统计软件进行单因素方差(ANOVA)分析，再经LSD(Least significant difference)及Dunnett法进行组间多重比较，统计结果以“x±s”表示。P < 0.01为差异极显著，P < 0.05为差异显著，P>0.05为无显著差异。
2 结果 2.1 PC12细胞Fas蛋白沉默的鉴定Western blot检测Fas蛋白表达量的变化，结果如图 1所示，NC组与Control组相比，Fas蛋白的表达量无显著差异(P>0.05)；与NC组相比，Fas shRNA组Fas蛋白的表达量极显著下降(P < 0.01)。
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不同大写字母表示组间差异极显著(P < 0.01)；相同字母表示组间差异不显著(P>0.05)，下同 Different capital letters show significant difference between groups (P < 0.01);no significant differences in the same letters (P>0.05), The same as below 图 1 PC12细胞Fas蛋白沉默的鉴定 Fig. 1 Identification of the silence of Fas protein in PC12 cells |
10 μmol·L-1 CdAc2分别处理NC组与Fas shRNA组细胞12 h，Hoechst 33258染色，激光共聚焦显微镜观察细胞核形态变化。结果如图 2所示，与NC组相比，Cd组中细胞核固缩浓染，呈典型凋亡形态变化的细胞核数量上升，细胞凋亡率极显著升高(P < 0.01)，Fas shRNA组与Fas shRNA+Cd组细胞呈凋亡典型变化的细胞极少，细胞凋亡率无显著差异(P>0.05)；与Fas shRNA组相比，Cd组细胞呈典型凋亡形态变化的细胞核数量上升，细胞凋亡率极显著升高(P < 0.01)，Fas shRNA+Cd组细胞凋亡率无显著差异(P>0.05)；与Cd组相比，Fas shRNA+Cd组细胞核固缩浓染，呈凋亡典型形态变化的细胞数量下降，细胞凋亡率极显著降低(P < 0.01)。
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白色箭头所示为受损细胞核 The damaged nuclei were marked by white arrows 图 2 Fas shRNA对镉致PC12细胞核形态变化的影响(1 000×) Fig. 2 Effects of Fas shRNA on nuclear morphological changes in PC12 cells caused by cadmium(1 000×) |
10 μmol·L-1 CdAc2分别处理NC组与Fas shRNA组细胞12 h，流式细胞术检测细胞凋亡率。结果如图 3所示，Q1象限为机械损伤细胞，Q2象限为晚期凋亡细胞，Q3象限为早期凋亡细胞，Q4象限为正常细胞。统计结果显示，与NC组相比，Cd组细胞凋亡率极显著升高(P < 0.01)，Fas shRNA组与Fas shRNA+Cd组细胞凋亡率无显著差异(P>0.05)；与Fas shRNA组相比，Cd组细胞凋亡率极显著升高(P < 0.01)，Fas shRNA+Cd组细胞凋亡率无显著差异(P>0.05)；与Cd组相比，Fas shRNA+Cd组细胞凋亡率极显著降低(P < 0.01)。
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图 3 Fas shRNA对镉致PC12细胞凋亡率变化的影响 Fig. 3 Effects of Fas shRNA on the change of apoptosis rate in PC12 cells caused by cadmium |
10 μmol·L-1 CdAc2分别处理NC组与Fas shRNA组细胞12 h，Western blot检测Fas/FasL信号通路相关蛋白的表达情况。结果如图 4、图 5所示，与NC组相比，Cd组Fas、FasL、FADD、Cleaved caspase-8、Daxx、ASK1蛋白表达量均极显著升高(P < 0.01)，Fas shRNA组与Fas shRNA+Cd组Fas蛋白的表达量极显著降低(P < 0.01)；与Fas shRNA组相比，Cd组Fas、FasL、FADD、Cleaved caspase-8、Daxx、ASK1蛋白表达量均极显著升高(P < 0.01)，Fas shRNA+Cd组Fas、FasL、FADD、ASK1蛋白表达量差异不显著(P>0.05)，Cleaved caspase-8蛋白表达量极显著降低(P < 0.01)，DAXX蛋白表达量极显著升高(P < 0.01)；与Cd组相比，Fas shRNA+Cd组Fas、FasL、FADD、Cleaved caspase-8、Daxx、ASK1蛋白表达量均极显著降低(P < 0.01)。
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不同小写字母表示组间差异显著(P < 0.05)；下同 Different lowercase letters indicate significant differences between groups (P < 0.05);The same as below 图 4 Fas shRNA对镉致PC12细胞Fas、FasL、FADD和Cleaved caspase-8蛋白表达变化的影响 Fig. 4 Effects of Fas shRNA on the changes of Fas, FasL, FADD and Cleaved caspase-8 protein expression in PC12 cells caused by cadmium |
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图 5 Fas shRNA对镉致PC12细胞Daxx和ASK1蛋白表达变化的影响 Fig. 5 Effects of Fas shRNA on the changes of Daxx and ASK1 protein expression in PC12 cells caused by cadmium |
10 μmol·L-1 CdAc2分别处理NC组与Fas shRNA组细胞12 h，Western blot法检测ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2和p-JNK1/2蛋白表达情况。结果如图 6所示，与NC组相比，Cd组p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK1/2/JNK1/2比值均极显著升高(P < 0.01)，Fas shRNA组与Fas shRNA+Cd组p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK1/2/JNK1/2比值均无显著差异(P>0.05)；与Fas shRNA组相比，Cd组p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK1/2/JNK1/2比值均极显著升高(P < 0.01)，Fas shRNA+Cd组p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK1/2/JNK1/2比值均无显著差异(P>0.05)；与Cd组相比，Fas shRNA+Cd组p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK1/2/JNK1/2比值均极显著降低(P < 0.01)。
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图 6 Fas shRNA对镉致PC12细胞ERK1/2和JNK1/2磷酸化的影响 Fig. 6 Effects of Fas shRNA on the phosphorylation of ERK1/2 and JNK1/2 in PC12 cells caused by cadmium |
10 μmol·L-1 CdAc2与40 μmol·L-1 Z-IETD-FMK单独或联合处理PC12细胞12 h，Western blot法检测ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2和p-JNK1/2蛋白表达情况。结果如图 7所示，与Control组相比，Cd组p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK1/2/JNK1/2比值均极显著升高(P < 0.01)，Z-IETD-FMK组p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK1/2/JNK1/2比值均无显著差异(P>0.05)，Z-IETD-FMK+Cd组p-ERK1/2/ERK1/2比值极显著升高(P < 0.01)，p-JNK1/2/JNK1/2比值无显著差异(P>0.05)；与Z-IETD-FMK组相比，Cd组p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK1/2/JNK1/2比值均极显著升高(P < 0.01)，Z-IETD-FMK+Cd组p-ERK1/2/ERK1/2比值显著升高(P < 0.05)，p-JNK1/2/JNK1/2比值无显著差异(P>0.05)；与Cd组相比，Z-IETD-FMK+Cd组p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK1/2/JNK1/2比值均极显著降低(P < 0.01)。
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图 7 Z-IETD-FMK对镉致PC12细胞ERK1/2和JNK1/2磷酸化的影响 Fig. 7 Effects of Z-IETD-FMK on the phosphorylation of ERK1/2 and JNK1/2 in PC12 cells caused by cadmium |
细胞凋亡是由死亡信号触发或内外环境变化，以及在基因调控下所引发的细胞主动死亡过程，是多细胞生物调控机体发育、维持内环境稳定、控制细胞衰老的重要机制。细胞凋亡的发生和进行受精确调控，具有独特而复杂的信号转导系统[14-15]。线粒体通路、死亡受体通路和内质网应激是细胞凋亡的3大经典通路，各通路之间相互交叉，共同调控细胞凋亡。镉是诱导细胞凋亡的典型诱导因子之一。体内外研究结果表明，镉可通过多种途径诱导神经元[16]、星形胶质细胞[17]、小胶质细胞[18]、PC12细胞[19]等神经细胞发生凋亡。本课题组前期研究发现，镉可引起神经细胞凋亡，上调Fas/FasL通路相关蛋白的表达量[20]，因此抑制Fas/FasL可能成为阻断细胞凋亡的途径。Wang等[21]研究发现，通过Fas siRNA沉默肝细胞Fas表达可以减少细胞凋亡，提高同种异体移植肝细胞的存活率。本试验通过NC shRNA或Fas shRNA慢病毒干扰PC12细胞Fas蛋白表达。结果表明，NC shRNA慢病毒不影响PC12细胞Fas蛋白表达，可做为阴性对照进行后续试验；Fas shRNA慢病毒可有效抑制PC12细胞Fas蛋白表达，减少镉引起的细胞核固缩浓染或变形等细胞凋亡典型变化，显著抑制镉引起的PC12细胞凋亡率的升高，说明Fas/FasL在镉致PC12细胞凋亡过程中具有重要作用。
死亡受体通路是靶细胞表面的死亡受体与配体结合导致死亡结构域(DD)与Fas相关死亡域(FADD)碳末端的DD结合，从而激活下游凋亡蛋白执行细胞凋亡的一种途径[22]。Fas/FasL、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和肿瘤坏死因子受体(TNFR)3大主要死亡受体通路中Fas/FasL通路是最主要的死亡受体通路之一，在神经细胞凋亡过程中扮演着重要角色。Fas/FasL通路由Fas/FADD/caspase-8和Fas/Daxx/ASK1两条相对独立的通路构成[23, 24]。当细胞受到刺激物诱导发生凋亡时，Fas/FADD/caspase-8途径被激活，参与细胞凋亡[25]。在此过程中，FADD作为纽带将凋亡信号传递至细胞质[26]。Daxx是一种可以与Fas死亡结构域结合的蛋白，Daxx是Fas下游的一种促凋亡蛋白，与FADD平行，位于细胞核内，当细胞受到凋亡刺激时，Daxx可以与Fas结合，并依次激活ASK1和JNK，介导细胞发生凋亡，在此过程中ASK1在Fas介导的死亡受体通路和JNK通路之间发挥桥梁作用[22]。本试验发现，镉能够激活PC12细胞Fas/FADD/caspase-8通路和Fas/Daxx/ASK1通路，引起Fas、FasL、FADD、Cleaved caspase-8、Daxx和ASK1蛋白表达量的升高；同时通过Fas shRNA抑制Fas的表达，能显著抑制镉引起的Fas、FasL、FADD、Cleaved caspase-8、Daxx和ASK1蛋白表达量的升高。说明抑制Fas的表达能够阻断镉引起的PC12细胞Fas/FasL信号通路的激活。
MAPK通路的各亚族可被不同的外界刺激物激活，形成不同的信号转导通路，激活不同的转录因子，介导不同的生物效应。MAPK通路的激活因细胞种类和诱导因子的不同存在很大差异。镉可以引起大鼠胶质瘤细胞(C6)JNK和p38 MAPK激活，并通过p38 MAPK途径调节丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)的表达[27]。此外，MAPK通路与线粒体通路和Fas/FasL通路之间存在密切的串扰关系。MAPK通路可作为线粒体通路和Fas/FasL通路的上游信号参与细胞凋亡的诱导。本课题组前期研究发现，镉可通过ERK和JNK介导的线粒体通路诱导PC12细胞凋亡[28]。Liu等[11]研究发现，磷脂酶A2(PLA2)诱导人白血病U937细胞凋亡过程中，p38 MAPK与Fas/FasL通路被激活，p38 MAPK抑制剂SB202190抑制p38 MAPK的激活后，抑制了PLA2对Fas/FasL通路的激活。然而，Fas/FasL通路也可作为MAPK通路的上游信号参与细胞凋亡的诱导。TNF(肿瘤坏死因子)能够诱导FADD和ERK激活，在FADD缺失的成纤维细胞中，TNF(肿瘤坏死因子)诱导的ERK磷酸化水平极显著降低[29]。在Fas和FasL基因敲除的胰腺炎小鼠模型中，肝细胞凋亡水平显著降低，同时p38 MAPK磷酸化水平也降低[12]。此外，Khelifi等[30]研究发现，通过RNA干扰(RNAi)技术抑制Daxx的表达，可显著降低JNK的活性，提高成纤维细胞对紫外线和氧化应激的耐受性，降低细胞的凋亡率。本研究结果表明，Fas shRNA与40 μmol·L-1 Z-IETD-FMK可抑制Fas/FasL通路的激活进而抑制镉激活MAPK通路诱导的PC12细胞凋亡。说明Fas/FasL通路作为上游信号调控下游的MAPK通路参与镉诱导PC12细胞凋亡。
4 结论通过Fas shRNA和Z-IETD-FMK抑制Fas/FasL通路的激活研究了镉诱导PC12细胞凋亡过程中Fas/FasL通路对MAPK通路激活的影响。结果表明，抑制Fas/FasL通路可抑制镉激活MAPK通路诱导的PC12细胞凋亡，如图 8所示。
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图 8 Fas/FasL通路对镉激活PC12细胞MAPK通路的影响 Fig. 8 Effect of Fas/FasL pathway on MAPK pathway activated by cadmium in PC12 cells |
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