2. 宁夏大学农学院, 银川 750000;
3. 昆明海关技术中心, 昆明 650228
2. Agricultural College, Ningxia University, Yingchuan 750000, China;
3. Kunming Customs Technology Center, Kunming 650228, China
猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)为尼多病毒(Nidovirales)目、冠状病毒(Coronaviridae)科、α-冠状病毒(Alphacoronavirus)属成员[1]，是一种可引起猪急性腹泻、呕吐、脱水和仔猪高死亡率的传染性肠道病毒。PEDV最初20世纪70年代出现在英国，随后迅速传至西班牙等其他欧洲国家。PEDV于2013年5月首次在美国发现，并迅速传播，导致美国养猪业损失严重[2]。PEDV感染对猪健康危害极大，虽然其对人的感染和直接危害尚未报道，但单就PEDV病毒遗传基因序列与在蝙蝠体内发现的冠状病毒具有高度相似性[3-6]以及实际生活场景中人-猪生态界面的多重重复性、深度交叉性和互动性而言，提示该病毒对公共卫生安全具有特殊意义，随着2020年新型冠状病毒Sars-CoV-2(COVID-19)在全球大流行以来，这种不确定性风险越来越被广泛关注。冠状病毒科由4个属组成：α冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒和δ冠状病毒[7-8]。α属的冠状病毒和β属冠状病毒对哺乳类动物危害极大，α属的冠状病毒对哺乳动物致病的代表性成员有HCoV-229E、HCoV-NL63、PEDV、传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、猪呼吸道冠状病毒(porcine respiratory coronavirus, PRCV)以及近些年发现的由蝙蝠中一种新型的HKU2冠状病毒外溢到猪群的高致死性猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhoea syndrome coronavirus, SADS-CoV)等[9-10]。β冠状病毒包括HCoV-OC43、HCoV-HKU1、severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus (SARS-CoV)、Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV)以及目前全球流行的SARS-CoV2(COVID-19) 等[7]。γ冠状病毒和δ冠状病毒主要对禽类等危害严重，但也会对哺乳动物有严重危害，如δ属的成员有猪δ冠状病毒(porcine delta-coronavirus, PDCoV)[7-8]。养殖家畜及野生哺乳动物猪、牛、蝙蝠等在Sars-CoV-1、Mers-CoV以及Sars-CoV-2等人间冠状病毒的几次大流行中都被认为具有某种特殊的流行病学意义，蝙蝠体内冠状病毒与PEDV高度相似的基因序列[3-6]，提示养殖家畜和人群的生态界面的互动可能会加速病毒的种间变异。PEDV作为一种感染可导致猪高死亡率的冠状病毒，目前虽无直接证据表明其和目前全球流行的新型冠状病毒COVID-19的直接关联，但其作为RNA病毒的冠状病毒科、α-冠状病毒亚属成员，在遗传变异、致病力、传播扩散以及宿主危害选择等方面存在极大的不确定性和可变性，同时其也是国际贸易，尤其是当前中美生猪及猪肉贸易中具有重要检疫性意义的病原微生物。为此，本文在对PEDV的病原学、流行病学、传播途径结合近年来美国PEDV流行株发生和监测等方面信息挖掘基础上，基于2019年美国生猪入境我国西南地区陆路口岸利用抗体检测筛查结果，结合贝叶斯统计推断，依托Poptools在Excel的插件作为量化平台，开展对美国猪群中的PEDV真流行率的分布推断研究，以期为当前美国生猪及猪肉制品入境我国口岸的风险管理及其检疫监测和抽样技术提供技术支持。
1 材料与方法 1.1 数据来源本研究中美国养殖猪群PEDV先验信息表观流行率的咨询主要包括来自2019年11和12月美国猪病报告系统对育肥猪(wean to market)、母猪(sow)和无法确定生长阶段和身份的猪(unknown status)的监测结果(检测数和阳性数)的报告[Domestic Disease Monitoring Reports-Swine Health Information Center & Swine Disease Reporting System(SDRS) | College of Veterinary Medicine | Iowa State University (iastate.edu)]，美国猪病研究平台系统(SDRS)[11]是一个可以公开访问的监测报告系统，游走的不确定身份猪PEDV监测信息[12]来自PubMed国际科技网络平台文献资料查新。2019年度来自美国进口生猪入境中国口岸监测和检测信息，来自国家出入境检验检疫局昆明海关技术中心实验室。
1.2 PEDV入境我国口岸筛查与检测目前PEDV诊断试剂可分为病毒学和血清学方法的试剂两类。病毒学的试剂主要针对病原、核酸和蛋白，而血清学的试剂主要是针对由于感染引起的免疫应答的抗体检测。2019年，美国入境中国西南陆路昆明海关的活猪的口岸筛查使用ID Screen PEDV Indirect ELISA抗体检测试剂盒(ID Screen® PEDV Indirect Screening test (IDvet, Grabels, France)。按照ID Screen® PEDV Indirect Screening test试剂盒判定标准的说明，S/P%≥60%被认为是抗体阳性，而 < 60%被认为是阴性。
1.3 贝叶斯统计推断贝叶斯理论和方法是知识学习、统计决策以及风险优化过程[13]，同时也是人工智能(artificial intelligence-AI)技术和机器学习的统计理论基础，其广泛应用于进化医学和生物学、医疗诊断[10, 14-17]、人口调查与统计评估、监测与抽样[18-29]等多个方面。贝叶斯统计的表达公式：
| $ p\left( {\theta |X} \right) = \frac{{p\left( {X|\theta } \right)p\left( \theta \right)}}{{{\smallint _\varTheta }p\left( {X|\theta } \right)p\left( \theta \right)d\left( \theta \right)}} $ | (①) |
其中，Pr(θ)为“先验分布”，它表达了观察和认知X事件前对X事件相关因素的认识程度或经验的描述，为处理问题实际需要，它通常可以用统计分布函数来简化，用以表达对事件X事件的一种确认度不高的, 或者不确定性的认识。X在本文中为美国猪群中的PEDV感染状况分布。动物个体对特定病源微生物的感染状态函数通常用二项分布函数(Binomial distribution) 或者伯努利分布(Burnell distribution) 函数来描述[25, 30-31]，但畜群感染特定病源微生物流行率推断要复杂得多，临床症状或者可靠的实验室检测可以为该参数的估计和推断提供先验认知。先验分布代表了在探究、探索和查询目标事件发生前，人们已经存在的对目标事件的一种经验分布和认识，对该概念及其参数化的认识是贝叶斯统计与传统的基于频率分布的数值统计的最本质区别。本研究的先验分布函数定义为在开展美国生猪入境昆明口岸开展抗体检测筛查前的PEDV在美国的发生状况的认识。本文中美国猪群中携带PEDV的先验分布信息主要是通过查询美国猪病研究平台(SDRS)咨询，以2019年11—12月监测报告中的阳性检测数及其表观流行率分布为基数，选择利用二项分布模型的共轭分布函数模型Beta(α，β)来描述美国猪群PEDV在开展本研究之前的未知患病率，以其作为统计推断真流行率的先验信息，其中，α=阳性检测数量+1，β =阴性检测数量+1[10, 25]，Beta分布：
| $\begin{array}{l} \;\;\;{\rm{Prior}}\;{\rm{P}}\left( \rho \right) \sim {\rm{Beta}}\left( {\alpha , \beta } \right) = > \rho |\alpha , \beta = {\rm{B}}(\alpha , {\rm{ }}\\ \beta ){\rho ^{\alpha - 1}}{\left( {1 - \rho } \right)^{\beta - 1}} \end{array} $ | (②) |
Pr(X|θ)“似然函数”(likelihood function)，Pr(X|θ)表达为在给定先验分布Pr (θ)的条件下随机观察到事件X的概率分布。二项分布的X(xi)的概率质量函数-Binomial distribution probability mass function (pmf)的计算表达式
| $f\left( x \right) = \left( \begin{array}{l} n\\ x \end{array} \right){p^x}{\left( {1 - p} \right)^{n - x}} $ | (③) |
Pr(θ|X)为“后验分布”，它用来描述观察x事件后先验认知和综合了新咨询后认知到的X，它也是贝叶斯推断的最终目标。在本文中指代美国猪群PEDV真流行率分布函数，该分布函数的真实数值分布可以通过系统监测和大样本抽样来获取，更大的样本抽样监测可以为获取真实流行率提供更加有把握的统计认知和确认，但大样本的监测和抽样对应的是大的人力、物力和财力投入。统计抽样提供了解决此问题的思路，通常通过一定数量小样本抽样可以获取近似准确的认识。基于此认识作为假设，以入境我国西南陆路昆明口岸的美国生猪作为美国养殖猪群中的一个小样本抽样，该入境猪群样本可以在一定程度上反映美国猪群的统计特征，但不同样本数量大小(N)所附带的统计特征的不确定性会有较大差异。基于该美国入境生猪小样本在昆明口岸利用IDVetScreen® PEDV Indirect Screening test试剂盒开展的PEDV实验室抗体筛查检测为进一步从统计上更新了对美国猪群的PEDV实际流行率的认识。
2 结果 2.1 口岸PEDV抗体检测及其参数分布PEDV基因组是单股正链RNA，基因组全长约28 kb, 其主要由3个部分组成，包括5′端非编码区(5′-UTR)，3′非编码区(3′-UTR)，7个开放阅读框(ORF1a、ORF1b、ORF2~6)，其中ORF编码12种非结构蛋白与4种结构蛋白[spike (S)、envelope (E)、membrane (M)、nucleocapsid (N)]和1种ORF3编码的NS3B辅助蛋白[32]。目前，在美国猪群中至少存在两种遗传上不同的PEDV菌株，即PEDV原型菌株(U.S. PEDV prototype strain)和S-INDEL变异菌株(S-INDEL-variant strain)[33-36]。此外新近分离到的PEDV PC177和Minnesota188被认为是原型菌株的变种[37]。目前，对PEDV的血清学检测试剂包括间接荧光抗体(indirect fluorescent antibody，IFA)、病毒中和试验(virus neutralization，VN)、基于全病毒(whole virus，WV)酶联免疫ELISA抗体试剂，基于重组的S1蛋白ELISA和基于N (nucleocapsid) 蛋白的ELISA等[37], 其都是基于原型毒株(U.S. PEDV prototype), 但Chen等[37]2016的研究显示，目前基于原型株- U.S. PEDV prototype的血清学检测试剂都可以检出变异株- S-INDEL-variant strain的抗体。
2019—2020年，美国入境的生猪在西南陆路口岸实验室利用IDVet ELISA开展抗体筛查，该试剂盒主要是针对PEDV G2b基因组的N蛋白。Gerber等[38]2016年度在美国开展的针对IDVetScreen® PEDV Indirect Screening test试剂盒的验证试验显示，该试剂盒的检测敏感性(diagnostic sensitivity, DSe)为73.7% (95% CI=71.5%~79.6%)，检测的特异性(diagnostic specificity, DSp)为98.4% (95% CI=96.6%~99.5%)。从Gerber等[38]的验证试验看，基于重组N蛋白的IDVet- ELISA抗体试剂盒监测PEDV感染后生猪的免疫球蛋白的敏感性和特异性数值区域分布与其他参评试验的4个剂盒差异并不明显。5个试剂盒都具有相对较低的敏感性和表现一般的特异性，从侧面说明猪群感染PEDV隐秘性和准确探测的难度，同时也指示出目前应用的商用试剂盒开展的对PEDV监测检测准确性都存在一定的不确定性。要准确推导发病状况，利用具有明确验证参数的检测试剂和方法的监测，才可以用以有效推断特定病原微生物在特定群体中的真实流行状况。Gerber等[38]研究已经为推断PEDV流行率提供了非常有价值的参数，为较好地描述该试剂盒探测PEDV抗体数值准确程度的变化性和不确定性，基于Gerber等参数验证的研究和实验室测试的感染数据，利用Pert (Min, Median, Max) 统计分布来随机表达该试剂盒的检测准确性(diagnostic sensitivity-DSe、Diagnostic specificity-DSp)参数分布，此分布参数涵盖的数值区间的变化性将参与后续的真流行率的分布估计和推断。该试剂盒的Dse和DSp的数值区间的统计分布如图 1所示。
|
图 1 2019—2020年美国入境中国西南陆路口岸猪只的抗体筛查方法的检测敏感性与检测特异性分布 Fig. 1 Distribution of the diagnostic sensitivity & diagnostic specificity of antibody screening test used for PEDV detection in Kunming entry port |
美国猪病监测包括养殖猪群的SDRS (swine disease reporting system)监测和对游走的不确定身份猪的监视。美国无身份游荡猪群的监视主要由美国动植物检疫局(US Department of Agriculture Animal & Plant Health Inspection Services)野生动物研究中心(Wildlife Services National Wildlife Research Center, WSNWR)负责系统实施和开展。Bowman等[39]和Scott等[40]的研究认为美国PEDV的发生是养殖猪群的感染发生在先，然后传播扩散到了游走的不确定身份猪等其他猪的群体，这一结论的证据是游走的不确定身份猪等监测的PEDV阳性核酸要比养殖猪群的PEDV阳性核酸的出现晚一年以上。针对现阶段美国游走的不确定身份猪群PEDV的感染状况，Bevins等[12]采集了大量野猪的血清，并对其进行了PEDV暴露风险和两次抗体检测筛查，结果推断美国游走的不确定身份猪的PEDV血清患病率为0.1% (95%CI= 0.03%~0.16%)。美国猪病监测报告系统基于PEDV核酸PCR分析[11]显示，2017—2019年，美国养殖猪群的PEDV RNA核酸阳性检出随月份和不同抽检群体间都具有较明显差异，其中育肥(wean to market)阶段猪群体中的阳性检出最高，能繁母猪(adult/sow)次之，而其他不确定生长阶段类型猪的样品(unknown)的检出率最低。2019年9月份为12.98%，母猪场的PEDV检测水平为5.24%，11月份为14.19% (415/2 129), 12月份阳性检出比例升至15.64% (483/3 089)。2020年1月份PEDV阳性病例的百分比较2019年12月份有较大幅度提高，其中明尼苏达州和北卡罗来纳州的阳性检出率升幅较为显著，最高可以达到25.3%。2020年2—5月，PEDV感染呈现下降态势，考虑到2020年COVID-19在美国流行状况的影响，此阶段的PEDV阳性检出率下降可能和这段区间内猪群监测的范围、取样频率、样本选择和取样数量等有一定关联。此外，PEDV阳性检出率还受监测方案中的检测方法和试剂选择的影响。基于免疫应答的间接免疫抗体检测方法更能有效反映病原感染的真实发病率，而PCR的检测超高敏感性由于样品在猪场采集以及实验室质量控制的不确定性可能导致出现的大量假阳性问题也被广为关注[41-45]。
2.3 美国猪群PEDV后验流行率分布推断美国猪群2019年PEDV监测的先验发生率显示，美国猪群中PEDV感染发病状况分布上随着生猪生产不同阶段感染状况具有时间差异性和不同地理区域的空间异质性，PEDV在美国猪群中的感染面广，且其分布有极大的区间不确定性，这给区间生猪移动和猪肉贸易带来了巨大的挑战和安全威胁。根据中华人民共和国海关与出入境检验检疫局的统计数据显示：2016—2020年，来自美国入境我国口岸的活猪数量巨大，特别是自2018年8月我国非洲猪瘟疫情发生后，国内猪的存栏和种质资源减小，猪肉市场受到极大冲击，美国入境的猪及其产品数量会在近几年呈现大幅度增加的态势。2019年，来自美国South Dakota(Mound City)、Kentucky(Adolphus)、Missouri(Washburn, Montgomery City)等地入境中国西南陆路口岸的生猪1 930头份，其中利用ID Screen PEDV Indirect ELISA抗体检测试剂盒(ID Screen® PEDV Indirect Screening test (IDvet, Grabels, France)随机抽检开展检疫筛查的184头份样品，结果显示无抗体阳性样品检出。基于这一批次样品利用抗体检测试剂盒的检测结果，作为对美国猪群PEDV的贝叶斯认知更新，利用贝叶斯推断模型①-②-③来优化美国猪群PEDV真流行率，推断结果显示PEDV在美国猪群中的真流行率分布中位值(Median)为0.005 22(95% CI=0.000 424~0.022 5)，如图 2概率密度高度右偏(Positively Skewed & Right Skew)红色曲线所示，而基于PubMed及美国猪病检测平台等科技咨询的检出率作为先验信息的流行率中位值为0.065 4(95% CI=0.06~0.07)(图 2蓝色曲线所示)。在对美国猪群PEDV发生率先验分布和口岸实验室的抗体检测方法参数分布认识的基础上，利用贝叶斯推断模型①-②-③，在基于2019年度口岸实验室对美国South Dakota、Kentucky、Missouri等三地入境猪的血清样品的抗体检测结果更新优化基础上，利用概率密度统计分布特性可以推断：美国猪群的PEDV真流行率最大可能分布主要集中在2.5%百分位数(P2.5% =0.000 19)与中位数(P50%=0.005 22)之间(图 2)。概率密度高度正偏的数据统计分布的趋势显示，美国PEDV真流行率大于0.02的可能性相对较低，虽然随机抽样群体的PEDV分布值可能会有小概率(P≤2.5%)溢出分布大于0.03的可能(图 2)。基于贝叶斯统计推断和口岸实验室抗体检测结果优化的美国PEDV真流行率最大可能分布区间这一统计特征值将会作为美国PEDV疫情发生状况更新前，我国口岸针对PEDV检验检疫抽样样品计算量的最主要依据。
|
图 2 贝叶斯推断的美国猪群PEDV感染的先验流行率与后验流行率分布 Fig. 2 Distribution of Bayesian inference on posterior prevalence and prior prevalence of PEDV in US swine population |
2013年，PEDV传入美国(US PEDV isolate，USA/NC35140/2013)[12], 给美国养猪业带来巨大危害和损失。作为冠状病毒的PEDV属于RNA病毒，具有可变性强、易于发生突变等的特点。目前研究显示在美国猪群中至少存在两种遗传上不同的PEDV毒株，即PEDV原型株(U.S. PEDV prototype strain) 和S-INDEL变异株(S-INDEL-variant strain)[33-36]。
美国猪群PEDV先验分布的数据挖掘显示，美国养殖猪群和游走的不确定身份猪的PEDV表观流行率分布具有极大区间差异和群间差异。SDRS应用PCR的监测显示[11]：育肥猪的阳性率明显高于能繁母猪和其他猪群，而利用基于N蛋白和S1重组蛋白的免疫抗体ELISA方法筛查的游走猪的PEDV感染率(IgG)较PCR检测的养殖猪群的PEDV显著的低。常规PCR和实时逆转录聚合酶链反应(rRT-PCR)等分子诊断方法与传统的其他方法相比被认为具有更高的分析敏感性和分析特异性。不同PEDV rRT-PCR的敏感性和特异性虽有差异，但Miller等[41]研究显示，PEDV rRT-PCR分析敏感性通常可以达到1个拷贝的RNA。极高的分析敏感性也就意味着极高概率的污染风险，对实验室生物安全水平、污染控制、样品处理及其实验室检测等提出了极高的要求, 同时证据也显示，大量rRT-PCR阳性样品在动物回归试验和攻毒试验中不显示感染性。特别是在用消毒剂处理的PEDV样品用PCR处理后依然呈现阳性，故而研究认为对PCR阳性或者弱阳性的实验室结果的需要谨慎的解释[41-45]。从这个角度解释，养殖猪群的PEDV核酸检测结果可能会存在有部分阳性样品为假阳性结果。
2019年，来自美国South Dakota等三州入境中国西南陆路口岸的生猪，利用IDVet抗体检测试剂盒(ID Screen® PEDV Indirect Screening test (IDvet, Grabels, France)检疫筛查的184头份样品，无抗体阳性样品检出。基于这一批次样品抗体检测结果，作为对美国猪群PEDV流行率的贝叶斯认知更新，利用贝叶斯推断模型①-②-③来优化美国猪群PEDV真流行率，推断结果显示PEDV在美国猪群中的真流行率中位值(Median)为0.005 22(95% CI= 0.000 424~0.022 5)(图 2)。基于后验分布流行率的概率密度呈现高度右偏(Positive Skew)的统计特征，推断美国猪群的PEDV真流行率最大可能分布值主要集中在2.5%百分位数(P2.5% =0.000 19)与中位数(P50%=0.005 22)之间区域，95%的高置信上限(UCL)的流行率分布为3%。统计概率密度高度正偏(图 2)的分布数据也提示：美国PEDV真流行率大于0.02的可能性相对较低，虽然局部地区随机抽样群体的PEDV分布值可能会有小概率溢出分布大于0.03的可能(P≤2.5%)。这一估计值与美国WSNWR Bevins等[12]基于2012—2015年度间大样本(n=7 997) 利用高特异性(DSp=100%)和高敏感性(DSe=88%)的基于S1重组蛋白ELISA方法监测结果推断的PEDV在游走猪群体中95% UCL-高置信上限保持一致(online Technical Appendix Tables 1, 2, https://wwwnc.cdc.gov/EID/article/24/7/17-2077-Techapp1.pdf)。
利用贝叶斯统计方法推断，在先验信息挖掘的基础上，结合口岸实验室抗体检测结果，优化对美国PEDV真流行率的估计，对认识和了解美国猪群感染PEDV状况及对来自美国的生猪入境我国口岸的检疫监管、风险管控和风险决策具有突破性的技术意义。流行率是公共卫生和动物卫生健康应对传染病流行认知最为基本和关键的指标，同时其也是后续风险干预、风险管理和风险监测的基础指标。流行率通常有表观流行率和真流行率之分。表观流行率最为常见，是检测阳性数量与检测样本量的比率，其以假定检测方法为金标准，以100%准确性(100% DSe, 100% DSp, 100% 重复率等)为假设。但在实际场景中，金标的方法虽然可能存在，但其适用范围和场景非常有限，或者仅在试剂比对和验证中应用。在常规监测检测中所应用的方法很少可以或者基本无法达到金标的要求。检测总是会有错误率和不确定性，假阴性和假阳性结果总是会与检测结果相伴随。故而在很多情景下，表观流行率给我们提供的咨询虽然有一定意义，但也可能是一种直观的误导。如以口岸实验室检测结果的表观流行率来比较，口岸利用抗体检测试剂盒的阳性检出数量为0，其表观流行率为0，直观的解释是此次入境的动物100%不存在PEDV感染或者不携带PEDV病原微生物。但考虑到检测方法的检测敏感性和检测特异性不可能同时达到100%[10, 25, 27]，这种推断显然是不符合常识和实际。
与表观流行率相对应的是真流行率，对真流行率的认识是传染病控制和预防的基础。真流行率表达的是在特定测试条件下对某种疫病在群体中流行状况的认识。由于生物机体、致病微生物及健康的复杂性，群体中特定疫病发生的真流行率数值通常很难获取，但贝叶斯统计推断为人们提供了一种思路和解决方案，即后验分布可以无限逼近这一分布。基于对先验信息的认知，在后验信息如最新实验室检测数据和结果更新的基础上，利用统计推断方法不断提高和优化对真实发病率的认识，这就是本文推导美国PEDV真实发病率的思路。在本研究如图 2的概率密度分布显示，贝叶斯优化后的后验概率分布的中位值(红色曲线)，即美国PEDV真流行率最可能值0.005 22(95% CI=0.000 424~0.022 5) 与先验分布的统计中位值(蓝色曲线)0.065 4(95% CI=0.06~0.07)存在多达十多倍以上的数值差距。可以明显看出，先验分布的流行率认识要明显高于后验分布的流行率，其基本假设是检测所用试剂的完全理想化以及假定检测方法具有100%的临床检测敏感性DSe和100%临床检测特异性DSp的准确度。PEDV自2013年在美国出现US PEDV分离株USA/NC35140/2013后，很快鉴定出原型毒株(US PEDV Protoype) 和变异毒株(S INDEL)，此后报道的PC177以及2014年Marthaler等[36-37]分离到的可能的第三毒株Minnesota188。考虑到目前的血清学方法和检测试剂如IFA、VN、WV-ELISA、S1-ELISA、N-ELISA等都是基于美国原型毒株(US PEDV Protoype)设计[37]的，故而在美国猪群中PEDV毒株分布存在多样性的条件下，利用现有试剂达到100%准确性，在理论上是不具有操作性和可能性的。
PEDV真流行率分布受到PEDV病原微生物学特性、流行毒株分布类型、样品抽检类型与方法、样品处理技术、实验室检测、试剂盒检测准确性等一系列环境和质量控制等因素综合决定的，故而具有一定的不确定性。由于生物遗传多样性和环境变量控制的难度，特定疫病在特定群体中的流行率分布具有不确定性是一种客观存在。对于PEDV，其流行毒株多、进化变异快、且其宿主数量分布广，加之小样本监测、抽样检测及实验室等环境控制的随机性和不确定性，其真流行率具有较大的区间变化和时间变化，为降低这种不确定性，其真流行率分布可以通过大量先验信息的挖掘和基于更新数据的实验室基于N蛋白ELISA的抗体检测筛查，以优化和统计迫近我们对美国猪群的PEDV真流行率统计分布的认识，特别是更新信息的大样本数量可以为统计置信分布和决策提供大概率的统计认知和确信度，从而降低对美国猪群PEDV流行率分布估计的不确定性认识。
真流行率分布的认识对口岸检测检疫和风险决策管理具有重要意义，可以为实现口岸风险量化管理和风险决策，减小和降低特定病原微生物传入的风险不确定性提供操作的可能性和可行性。如以此次PEDV口岸筛查为例，如以先验分布的流行率为基准，计算检测检疫抽样量，会存在显著的缺陷。其一是基于先验分布流行率模拟计算出的抽取至少一头份阳性动物的抽样量会显著的降低十多倍以上。其二是以错误的流行率抽取的动物数量的降低，也会显著的增加该种病毒越过国界和检疫口岸，导致传入内地的风险不确定显著增加。而基于后验贝叶斯推断的流行率估计的最大可能值计算的口岸抽样数量，将会在现有研究认知基础上最大程度确定需要随机抽检的数量和存在的可能入境不确定性，从而降低在特定阶段来自美国入境的活猪携带PEDV病原的可能性。
此外，在口岸检疫筛查的方法、试剂选择和鉴别准确性方面，因为目前PEDV ELISA抗体检测的方法是基于美国PEDV分离株(USA/NC35140/2013)设计，其可以探测样品中是否有当前美国PEDV流行毒株(PEDV Protoype & S INDEL)的IgA和IgG的存在，但其对同属于α冠状病毒的TGEV没有有效的鉴别筛查能力，因为证据显示TGEV会对PEDV的ELISA抗体检测有较为明显的干扰和交叉反应，而对猪的其他冠状病毒如PRCoV和DeltaCoV不产生干扰[12]。Bevins等[12]对美国野猪的PEDV初筛试验和利用基于S1蛋白的ELISA复核试验验证了这一点，其中在7 997份野猪样本中，253份经PEDV-ELISA初筛呈抗体阳性，然后对这253份样本利用基于特异性S1重组蛋白ELISA方法进行复筛，发现其中8份被确认为PEDV抗体阳性，另外两个样本被认为是疑似阳性，而其余243份阳性样本被认为是TGEV。PEDV和TGEV同属α冠状病毒(图 3)，其对我国动物卫生健康和公共卫生安全都具有潜在威胁，为进一步明确和降低来自美国的α冠状病毒入境我国风险，故而建议目前口岸首先使用基于N蛋白的ELISA抗体作为初筛，然后以基于S1重组蛋白ELISA抗体筛查作为复筛，来提高口岸对来自美国猪的α冠状病毒入境我国的风险认知、管控和鉴别能力。
|
该亚科的病毒分为4个属：α冠状病毒(紫色)、β冠状病毒(粉色)、γ冠状病毒(绿色)和δ冠状病毒(蓝色), 系统发育树是基于已发表的管状病毒进化树[7, 46-48] The viruses in this subfamily group into four genera (prototype or representative strains shown): Alphacoronavirus (purple), Betacoronavirus (pink), Gammacoronavirus (green) and Deltacoronavirus (blue). Classic subgroup clusters are labelled 1a and 1b for the alphacoronaviruses and 2a-2d for the betacoronaviruses. The tree is based on published trees of Coronavirinae [7, 46-48] 图 3 冠状病毒亚科系统发育关系 Fig. 3 Phylogenetic relationships in the Coronavirinae subfamily |
冠状病毒科4个属(图 3)中的α冠状病毒和β冠状病毒对哺乳动物危害极大。猪感染冠状病毒对公共卫生的不确定性风险随着近期Sars-CoV-2(COVID-19) 全球流行越来越被广泛关注。作为归属于猪的冠状病毒，虽然PEDV、TGEV、PRCV、SADS-CoV和PDCoV等引起猪的传染性肠道和呼吸道感染并导致大量死亡，但其在人群流行的冠状病毒的形成和病毒演化中的影响和风险尚不明确[7]。口岸检疫检测是抵御外来入侵疫病传入的最后一道防线，故而来自异域可能出现的新的冠状病毒毒株给我国口岸监测、检疫监管带来了巨大技术挑战，利用贝叶斯统计推断，结合选择具有高度特异性和敏感性的口岸筛查试剂和方法，以实时更新的实验室检测咨询为知识更新，适时优化口岸检测抽样，对强化我国动物卫生和公共卫生安全，降低潜在入侵畜禽疫病传入风险具有突破性的意义。
4 结论PEDV可引起仔猪的高死亡率，对猪的健康生长以及动物卫生和公共卫生的暴露风险不确定性高，潜在危害大。目前，美国猪群中至少存在两种遗传上不同的PEDV毒株——PEDV原型株U.S. PEDV prototype strain和S-INDEL变异株S-INDEL-variant strain。本文基于对美国PEDV流行毒株监测及先验信息挖掘，利用贝叶斯统计推断，结合选择具有高度特异性和敏感性的口岸筛查试剂和方法，以更新的实验室筛查检测咨询为知识更新，推断美国猪群PEDV发生的真流行率，以期为现阶段美国生猪入境我国的口岸检验检疫、监测抽样提供基于科学证据的风险决策技术支撑。分析结果显示，PEDV在美国猪群中的真流行率分布中位值为0.005 22(95% CI=0.000 424~0.022 5)，95%的高置信上限的流行率分布为3%，高度右偏的统计分布推断美国猪群当前的PEDV真流行率最大可能分布主要集中在2.5%百分位数(P2.5% =0.000 2) 与中位数(P50%=0.005 22)之间。概率密度高度正偏的数据分布趋势显示，美国PEDV真流行率大于0.02的可能性相对较低, 虽然在美国不同地理空间中，随机猪群PEDV真流行率分布值可能会存在有小概率溢出分布大于0.03(P≤2.5%)的可能。口岸检疫与监测是抵御外来入侵疫病传入的最后一道防线，在现阶段口岸筛查的试剂选择方面，建议口岸首先使用基于N蛋白的ELISA抗体作为初筛方法，然后以基于S1重组蛋白ELISA抗体筛查作为复筛方法，来提高口岸对来自美国入境生猪的α冠状病毒潜在侵入我国的风险认知、管控和鉴别能力。基于口岸实验室检测结果优化的贝叶斯统计推断方法可以为在现有知识和认知基础上，最大程度阻断来自异域病原微生物入侵提供监测技术支持，对口岸检验检疫、抽样监测、风险管控和通关决策具有现实和突破性的意义。
| [1] | LEE C. Porcine epidemic diarrhea virus: an emerging and re-emerging epizootic swine virus[J]. Virol J, 2015, 12: 193. DOI: 10.1186/s12985-015-0421-2 |
| [2] | PENSAERT M B, DE BOUCK P. A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine[J]. Arch Virol, 1978, 58(3): 243–247. DOI: 10.1007/BF01317606 |
| [3] | HUANG Y W, DICKERMAN A W, PIÑEYRO P, et al. Origin, evolution, and genotyping of emergent porcine epidemic diarrhea virus strains in the united states[J]. mBio, 2013, 4(5): e00737–13. |
| [4] | LIU C, TANG J, MA Y M, et al. Receptor usage and cell entry of porcine epidemic diarrhea coronavirus[J]. J Virol, 2015, 89(11): 6121–6125. DOI: 10.1128/JVI.00430-15 |
| [5] | SIMAS P V M, DE SOUZA BARNABÉ A C, DURÃES-CARVALHO R, et al. Bat coronavirus in brazil related to appalachian ridge and porcine epidemic diarrhea viruses[J]. Emerg Infect Dis, 2015, 21(4): 729–731. DOI: 10.3201/eid2104.141783 |
| [6] | LACROIX A, DUONG V, HUL V, et al. Genetic diversity of coronaviruses in bats in Lao PDR and Cambodia[J]. Infect Genet Evol, 2017, 48: 10–18. DOI: 10.1016/j.meegid.2016.11.029 |
| [7] | CUI J, LI F, SHI Z L. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses[J]. Nat Rev Microbiol, 2019, 17(3): 181–192. DOI: 10.1038/s41579-018-0118-9 |
| [8] | WOO P C Y, LAU S K P, LAM C S F, et al. Discovery of seven novel Mammalian and avian coronaviruses in the genus Deltacoronavirus supports bat coronaviruses as the gene source of Alphacoronavirus and Betacoronavirus and avian coronaviruses as the gene source of Gammacoronavirus and Deltacoronavirus[J]. J Virol, 2012, 86(7): 3995–4008. DOI: 10.1128/JVI.06540-11 |
| [9] | ZHOU P, FAN H, LAN T, et al. Fatal swine acute diarrhoea syndrome caused by an HKU2-related coronavirus of bat origin[J]. Nature, 2018, 556(7700): 255–258. DOI: 10.1038/s41586-018-0010-9 |
| [10] | ZHANG Z C, DU X H. Bayesian inference and simulation on true prevalence of the coronavirus disease (COVID-19) in China and its screening diagnostic evaluation[J]. SSRN Electronic Journal, 2020. DOI: 10.2139/ssrn.3569885 |
| [11] | Domestic Disease Monitoring Reports. Swine disease reporting: report #23[Z]. Available: https://lib.dr.iastate.edu/cgi/viewcontent.cgi?article=1022&context=swinedisease_reports, 2020. |
| [12] | BEVINS S N, LUTMAN M, PEDERSEN K, et al. Spillover of swine coronaviruses, United States[J]. Emerg Infect Dis, 2018, 24(7): 1390–1392. DOI: 10.3201/eid2407.172077 |
| [13] | BAYES T. LⅡ. an essay towards solving a problem in the doctrine of chances. By the late Rev. Mr. Bayes, F. R. S. communicated by Mr. Price, in a letter to John Canton, A. M. F. R. S[J]. Phil Trans R Soc, 1763, 53: 370–418. DOI: 10.1098/rstl.1763.0053 |
| [14] | HUELSENBECK J P, RANNALA B, MASLY J P. Accommodating phylogenetic uncertainty in evolutionary studies[J]. Science, 2000, 288(5475): 2349–2350. DOI: 10.1126/science.288.5475.2349 |
| [15] | HUELSENBECK J P, RONQUIST F. MRBAYES: Bayesian inference of phylogenetic trees[J]. Bioinformatics, 2001, 17(8): 754–755. DOI: 10.1093/bioinformatics/17.8.754 |
| [16] | HUELSENBECK J P, RONQUIST F, NIELSEN R, et al. Bayesian inference of phylogeny and its impact on evolutionary biology[J]. Science, 2001, 294(5550): 2310–2314. DOI: 10.1126/science.1065889 |
| [17] |
张志诚, 李继东, 孙明军, 等. 比利时输入中国牛精液携带的施马伦贝格病毒潜在入侵风险评估[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(6): 1110–1117.
ZHANG Z C, LI J D, SUN M J, et al. Bayesian inference on the introduced schmallenberg virus (SBV) risk derived from importation of belgium bovine semen[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2017, 48(6): 1110–1117. (in Chinese) |
| [18] | BERRY D A. Bayesian statistics and the efficiency and ethics of clinical trials[J]. Statist Sci, 2004, 19(1): 175–187. |
| [19] | CASELLA G. Empirical Bayes Gibbs sampling[J]. Biostatistics, 2001, 2(4): 485–500. DOI: 10.1093/biostatistics/2.4.485 |
| [20] | DEMPSTER A P, SELWYN M R, WEEKS B J. Combining historical and randomized controls for assessing trends in proportions[J]. J Am Stat Assoc, 1983, 78(382): 221–227. DOI: 10.1080/01621459.1983.10477953 |
| [21] | DICKEY J M, JIANG J M, KADANE J B. Bayesian methods for censored categorical data[J]. J Am Stat Assoc, 1987, 82(399): 773–781. DOI: 10.1080/01621459.1987.10478498 |
| [22] | KING R, BROOKS S P. On the Bayesian analysis of population size[J]. Biometrika, 2001, 88(2): 317–336. DOI: 10.1093/biomet/88.2.317 |
| [23] | MADIGAN D, YORK J C. Bayesian methods for estimation of the size of a closed population[J]. Biometrika, 1997, 84(1): 19–31. DOI: 10.1093/biomet/84.1.19 |
| [24] | GLICKMAN M E, VAN DYK DA. Basic Bayesian methods[M]//AMBROSIUS W T. Topics in Biostatistics. Methods in Molecular BiologyTM. Humana Press, 2007: 319-338. |
| [25] | VOSE D. Risk analysis: a quantitative guide[M]. Chichester: Wiley, 2000. |
| [26] | BERTEKAS D P, JOHN N T, Introduction to probability. ISBN: 978-1-886529-23-6, 2008(Athena Scientific). |
| [27] | JOSEPH L, GYORKOS T W, COUPAL L. Bayesian estimation of disease prevalence and the parameters of diagnostic tests in the absence of a gold standard[J]. Am J Epidemiol, 1995, 141(3): 263–272. DOI: 10.1093/oxfordjournals.aje.a117428 |
| [28] | BERKVENS D, SPEYBROECK N, PRAET N, et al. Estimating disease prevalence in a Bayesian framework using probabilistic constraints[J]. Epidemiology, 2006, 17(2): 145–153. DOI: 10.1097/01.ede.0000198422.64801.8d |
| [29] | EVANS M, SWARTZ T. Methods for approximating integrals in statistics with special emphasis on Bayesian integration problems[J]. Statist Sci, 1995, 10(3): 254–272. |
| [30] |
张志诚, 刘拥军, 黄保续, 等. 基于Bernoulli分布的全球疯牛病发生风险研究[J]. 畜牧兽医学报, 2010, 41(7): 866–872.
ZHANG Z C, LIU Y J, HUANG B X, et al. The study on the global BSE developing risk based on Bernoulli distribution[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2010, 41(7): 866–872. (in Chinese) |
| [31] |
李兴元, 张志诚, 鲁富有, 等. 中缅边境勐阿渡口边贸传入口蹄疫风险不确定性研究[J]. 畜牧与兽医, 2016, 48(10): 22–27.
LI X Y, ZHANG Z C, LU F Y, et al. Study on the uncertainty of introducedfoot-and-mouth disease risk derived from illegally imported cattle at Menga Ferry between China & Myanmar[J]. Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2016, 48(10): 22–27. (in Chinese) |
| [32] | PARK S J, KIM H K, SONG D S, et al. Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) field isolates in Korea[J]. Arch Virol, 2011, 156(4): 577–585. DOI: 10.1007/s00705-010-0892-9 |
| [33] | VLASOVA A N, MARTHALER D, WANG Q H, et al. Distinct characteristics and complex evolution of PEDV strains, North America, May 2013-February 2014[J]. Emerg Infect Dis, 2014, 20(10): 1620–1628. |
| [34] | WANG L, BEVERLY B, YAN Z. New variant of porcine epidemic diarrhea virus, United States, 2014[J]. Emerging Infect Dis, 2014, 20(5): 917–919. DOI: 10.3201/eid2005.140195 |
| [35] | ZHANG J Q, CHEN Q, GAUGER P C, et al. Reply to "Classification of emergent U. S. strains of porcine epidemic diarrhea virus by phylogenetic analysis of nucleocapsid and ORF3 genes"[J]. J Clin Microbiol, 2014, 52(9): 3511–3514. DOI: 10.1128/JCM.01747-14 |
| [36] | MARTHALER D, BRUNER L, COLLINS J, et al. Third strain of porcine epidemic diarrhea virus, United States[J]. Emerg Infect Dis, 2014, 20(12): 2162–2163. DOI: 10.3201/eid2014.140908 |
| [37] | CHEN Q, THOMAS J T, GIMENEZ-LIROLA L G, et al. Evaluation of serological cross-reactivity and cross-neutralization between the United States porcine epidemic diarrhea virus prototype and S-INDEL-variant strains[J]. BMC Vet Res, 2016, 12: 70. DOI: 10.1186/s12917-016-0697-5 |
| [38] | GERBER P F, LELLI D, ZHANG J Q, et al. Diagnostic evaluation of assays for detection of antibodies against porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in pigs exposed to different PEDV strains[J]. Prev Vet Med, 2016, 135: 87–94. DOI: 10.1016/j.prevetmed.2016.11.005 |
| [39] | BOWMAN A S, KROGWOLD R A, PRICE T, et al. Investigating the introduction of porcine epidemic diarrhea virus into an Ohio swine operation[J]. BMC Vet Res, 2015, 11: 38. DOI: 10.1186/s12917-015-0348-2 |
| [40] | SCOTT A, MCCLUSKEY B, BROWN-REID M, et al. Porcine epidemic diarrhea virus introduction into the United States: root cause investigation[J]. Prev Vet Med, 2016, 123: 192–201. DOI: 10.1016/j.prevetmed.2015.11.013 |
| [41] | MILLER L C, CRAWFORD K K, LAGER K M, et al. Evaluation of two real-time polymerase chain reaction assays for Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) to assess PEDV transmission in growing pigs[J]. J Vet Diagn Invest, 2016, 28(1): 20–29. DOI: 10.1177/1040638715621949 |
| [42] | OPRIESSNIG T, XIAO C T, GERBER P F, et al. Porcine epidemic diarrhea virus RNA present in commercial spray-dried porcine plasma is not infectious to naive pigs[J]. PLoS One, 2014, 9(8): e104766. DOI: 10.1371/journal.pone.0104766 |
| [43] | PILLATZKI A E, GAUGER P C, MADSON D M, et al. Experimental inoculation of neonatal piglets with feed naturally contaminated with porcine epidemic diarrhea virus[J]. J Swine Health Prod, 2015, 23(6): 317–320. |
| [44] | THOMAS J T, CHEN Q, GAUGER P C, et al. Effect of porcine epidemic diarrhea virus infectious doses on infection outcomes in naive conventional neonatal and weaned pigs[J]. PLoS One, 2015, 10(10): e0139266. DOI: 10.1371/journal.pone.0139266 |
| [45] | BOWMAN A S, NOLTING J M, NELSON S W, et al. Effects of disinfection on the molecular detection of porcine epidemic diarrhea virus[J]. Vet Microbiol, 2015, 179(3-4): 213–218. DOI: 10.1016/j.vetmic.2015.05.027 |
| [46] | GRAHAM R L, DONALDSON E F, BARIC R S. A decade after SARS: strategies for controlling emerging coronaviruses[J]. Nat Rev Microbiol, 2013, 11(12): 836–848. DOI: 10.1038/nrmicro3143 |
| [47] | DREXLER J F, CORMAN V M, DROSTEN C. Ecology, evolution and classification of bat coronaviruses in the aftermath of SARS[J]. Antiviral Res, 2014, 101: 45–56. DOI: 10.1016/j.antiviral.2013.10.013 |
| [48] | GUINDON S, DUFAYARD J F, LEFORT V, et al. New algorithms and methods to estimate maximum-likelihood phylogenies: assessing the performance of PhyML 3.0[J]. Syst Biol, 2010, 59(3): 307–321. DOI: 10.1093/sysbio/syq010 |