, SU Bingqian, WANG Qi, WANG Yi, YU Pengwei, MENG Jiejie, QI Yanli, YANG Guoyu
, CHU Beibei
禽腺病毒(fowl adenovirus, FAdV) 属于腺病毒科Adenovirudae，是一种无囊膜的双链DNA病毒[1]，根据分子生物学标准可将FAdV属分成A~E 5个群，每个群内的病毒株依据血清交叉中和试验又进一步分为不同的血清型[2]。流行病学研究表明，鸡群主要FAdV流行毒株为高致病性血清4型禽腺病毒(fowl adenovirus serotype 4, FAdV-4)，可引起一种高度传染性鸡肝炎心包积液综合征[3] (hepatitis-hydropericardium syndrome, HHS)，该病毒呈世界性分布，危害严重[4]。自2015年以来，由FAdV-4引起的HHS不仅发生于3~4周龄肉鸡，还发生于10~20周龄蛋鸡[5]，主要以垂直传播方式传给下一代，也可通过粪口途径进行水平传播，死亡率高达80%，给国内养鸡业造成了严重的经济损失[6]。此外，测序分析显示，与其他国家和地区的FAdV-4分离株相比，国内近期的FAdV-4分离株具有独特的突变，其基因组存在明显的缺失[7]。然而，关于FAdV-4的感染和发病机制的分子机制却知之甚少，且对全球家禽业造成了严重的影响。
FAdV-4的核衣壳由五邻体(penton)、六邻体(hexon) 和纤突蛋白(Fiber) 等主要结构蛋白构成[8-9]。Fiber蛋白分为一条长纤维(Fiber 1) 和一条短纤维(Fiber 2)，其中Fiber 2蛋白可通过识别宿主细胞上的特异受体而帮助病毒吸附结合在宿主细胞上，在病毒增殖或组装的某些过程中是必需的[10]。此外，Fiber2蛋白还具有型和亚群特异性抗原决定簇，可诱导机体产生主要的型特异性中和抗体[11]。因此，Fiber2对FAdV-4的感染、致病及诊断有重要意义[12]。国内流行的FAdV-4基因型与国外早期的FAdV-4株相比，Fiber2基因发生了较大的变异[13]。流行病学调查显示，相同血清型的不同FAdV株的致病性也存在很大差异[14]。因此，推测FAdV-4在传播过程中的变异导致毒力的变化。此外，有研究表明，Fiber2基因在FAdV-4毒力中起关键作用[14-16]，所以，有必要对其进行分析。目前，国内研究表达的Fiber2蛋白多为包涵体，而且缺乏相关Fiber2单抗的研究[17]。由于缺乏针对FAdV-4纤维蛋白的单克隆抗体(MAb)，此类研究的进展受到严重限制。因此，本研究以国内的1株FAdV-4的Fiber2基因为模板，通过对Fiber2基因密码子优化后进行原核表达，获得可溶性蛋白，并免疫小鼠，制备了一种新的针对Fiber2蛋白的单克隆抗体(命名为MAb 2G5)，并对其表位进行了鉴定。MAb 2G5进行纯化，经检测发现具有良好的反应性和特异性，为研发FAdV-4相关的诊断试剂及疫苗提供基础资料。
1 材料与方法 1.1 试验材料FAdV-4 (分离自河南某养鸡场)、SP2/0骨髓瘤细胞(ATCC)、鸡肝癌细胞(LMH, ATCC)。FAdV-4 Fiber2基因由上海金斯瑞生物科技有限公司进行密码子优化并合成。带有不同促溶标签的原核表达载体pET21b-His6-Grifin-TEV (276-2)、pET21b-His6-GST-TEV (276-3)、pET21b-His6-NusA-TEV (276-5)、pET21b-His6-SUMO-TEV (276-6)、pET21b-His6-Thioredoxin-TEV (276-7)、pET21b-His6-ArsC-TEV (276-9)、pET21b-His6-γ-crystallin-TEV (276-16)、pET21b-His6-PpiB-TEV (276-21) 以及大肠杆菌BL21感受态细胞均由本实验室保存。表达FAdV-4 Fiber2的pCAGGS-HA-Fiber2真核表达质粒为本实验室构建、保存。6~8周龄的雌性SPF级BALB/c小鼠购自郑州大学中心实验室。Ni-NTA Agarose购自QIAGEN；杂交瘤细胞无血清培养基Ⅲ购自上海源培生物有限公司；小鼠抗His单抗购自中杉金桥公司；AEC酶底物显色试剂盒购自北京中杉金桥；FITC标记的山羊抗小鼠IgG以及HAT、HT贮存液、融合剂PEG1450均购自Sigma公司；DAPI染色试剂购自Servicebio (G1012)；小鼠IgG干粉购自Solarbio；小鼠单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购自Sino Biological；Protein G Resin购自TRAN；HRP-偶联试剂盒(过碘盐酸法) 购自酶免生物科技有限公司。
1.2 试验方法1.2.1 重组质粒的构建及验证 基于FAdV-4纤突蛋白Fiber2基因序列，引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，对序列中大肠杆菌稀有密码子进行分析，然后由金斯瑞生物科技有限公司进行优化合成，再亚克隆到带有不同促溶标签的原核表达载体上，经过酶切鉴定，得到带有不同促溶标签的Fiber2重组质粒。
1.2.2 重组蛋白的诱导表达和可溶性分析 通过热激法将鉴定正确的不同重组质粒转化至表达菌株BL21中进行诱导表达，挑取单克隆菌株，在37 ℃、220 r·min-1下振荡培养至OD600 nm为0.6左右，加入终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG于18 ℃、180 r·min-1诱导12 h，收集菌体进行超声破碎，10 000 r·min-1离心10 min后收集上清液和沉淀，通过SDS-PAGE电泳后利用考马斯亮蓝染色检测重组蛋白的表达量及可溶性。
1.2.3 重组蛋白的纯化及Western blot鉴定 选取可溶性最好的重组蛋白NusA-Fiber2，按照“1.2.2”中方法大量诱导表达，参照QIAGEN生物科技有限公司Ni-NTA Agarose操作技术手册纯化Fiber2蛋白，同时以此方法纯化促溶标签NusA蛋白，通过SDS-PAGE电泳后检测蛋白纯度。利用聚氰基丙烯酸正丁酯法(bicinchoninic acid, BCA)测定纯化的蛋白浓度，定量至1 mg·mL-1后于-80 ℃保存。纯化后的NusA-Fiber2蛋白和NusA蛋白经SDS-PAGE电泳后湿转印至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)，室温条件下，用5%脱脂奶封闭2 h，再分别以His单抗(1∶1 000稀释)和FAdV-4鼠源多克隆血清(1∶1 000稀释) 为一抗，于4 ℃孵育12 h，TBST (0.1% Tween-20 phosphate buffer saline) 洗3遍。二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG (1∶5 000稀释)，室温条件下孵育1 h；TBST洗涤3次，显影曝光分析纯化的Fiber2蛋白的免疫原性。
1.2.4 间接ELISA检测方法的建立 采用方阵滴定法确定抗原(NusA-Fiber2蛋白) 最佳包被浓度和阳性血清的最佳稀释度，HRP标记的山羊抗小鼠IgG作1∶5 000稀释。其他步骤按照常规ELISA程序[12, 17-19]，以此确定抗原最佳包被浓度和血清最适稀释度。
1.2.5 免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay, IPMA) 将LMH细胞接种于96孔细胞培养板，待形成约90%细胞单层时，FAdV-4以MOI等于0.01接种细胞，置于37 ℃细胞培养箱中培养24 h, 用含3% H2O2甲醇固定，该板可立即使用也可冻存于-40 ℃备用，用封闭液于37 ℃封闭1 h，PBST洗1次，加入一抗，同时设置不接种病毒的阴性对照和不加一抗的空白对照，37 ℃孵育1.5 h，PBST洗4次，加入酶标二抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗4次，加入AEC显色液，室温避光作用10 min后，于倒置显微镜下观察结果，阴性对照和空白对照均无着色，细胞特异性染色成红棕色即为阳性，否则为阴性。
1.2.6 小鼠免疫 将纯化的NusA-Fiber2蛋白按100 μg·只-1的剂量与弗氏佐剂1∶1乳化后免疫6周龄BALB/c雌鼠，第3次免疫后，对免疫小鼠进行尾静脉采血，用已建立的间接ELISA方法和IPMA方法鉴定其抗体分泌水平，抗体水平高的小鼠加强冲击1次。
1.2.7 细胞融合及阳性杂交瘤细胞筛选 取加强免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合。用间接ELISA及IPMA法筛选分泌抗FAdV-4 Fiber2抗体的阳性杂交瘤细胞，对筛选出的阳性杂交瘤细胞采用有限稀释法进行4次亚克隆以建立稳定细胞株。杂交瘤细胞建株后进行扩大培养、冻存保种。
1.2.8 腹水的制备、MAb的纯化和标记 向12周龄的BALB/c雌鼠腹腔注射0.3 mL不完全弗氏佐剂，1周后，取2×106~5×106个对数増殖期的单克隆细胞2G5进行腹腔注射，当小鼠腹腔明显胀大时，使用注射器收集腹水。收获的腹水用Protein G柱子进行纯化，参照Protein G柱子说明书进行。纯化后的腹水通过SDS-PAGE分析，经考马斯亮蓝染色鉴定其纯度。通过BCA法测定纯化的抗体浓度后，使用HRP-偶联试剂盒(过碘盐酸法) 对抗体进行HRP标记。
1.2.9 单克隆抗体生物学特性分析 单克隆细胞染色体数目分析：取对数增殖期的单克隆细胞以及SP2/0细胞，加入0.3 mg·mL-1的秋水仙素液，37 ℃培养6 h后收集细胞，低渗处理、固定、制片、吉姆萨染色、脱色、镜检并拍照，最后进行染色体计数并分析。单克隆细胞分泌抗体的稳定性分析：将杂交瘤细胞连续传代培养3个月，用“1.2.4”建立的间接ELISA方法和“1.2.5”中IPMA法检测细胞培养液中的抗体分泌水平，分析杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性；MAb的腹水效价测定及亚类鉴定：将“1.2.8”中纯化的腹水进行2倍倍比稀释，按照“1.2.4”建立的间接ELISA方法和“1.2.5”中IPMA检测方法进行效价测定。同时采用Sino Biological小鼠单克隆抗体亚类鉴定试剂盒进行抗体亚类鉴定。
1.2.10 单克隆抗体的间接免疫荧光(IFA) 检测 将鸡肝癌细胞LMH铺于24孔板，待LMH单层生长至80%~90%后，用MOI为0.01的FAdV-4进行感染，同时设立正常细胞为阴性对照。感染24 h后，弃上清液，用预冷的4%多聚甲醛于室温下固定细胞20 min，PBS洗涤3次；用0.1%TritonX-100于室温通透细胞膜10 min，PBS洗涤3次；使用含10%胎牛血清的PBS于室温下封闭1 h，PBS洗涤3次；将适当稀释的小鼠IgG (mouse IgG) 和制备的Fiber2单克隆抗体(mAb 2G5) 与固定的细胞于37 ℃共孵育1 h，PBS洗涤3次，加入稀释后的FITC标记的山羊抗小鼠IgG (1∶1 000)，于37 ℃避光孵育1 h后，PBS洗3次；加入DAPI染色试剂于室温避光孵育10 min，PBS洗涤3次、双蒸水洗涤3次；加入封片剂封片后置于荧光显微镜下观察、分析并采集图像。
1.2.11 单克隆抗体的Western blot鉴定 用MOI为0.01的FAdV-4感染LMH细胞，或转染pCAGGS-HA-Fiber2质粒的LMH细胞，收取细胞蛋白后，经SDS-PAGE电泳后湿转印至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，室温条件下，用5%脱脂奶封闭2 h，PBST洗涤3次后，加入制备的Fiber2单克隆抗体(1∶1 000稀释) 于4 ℃孵育12 h；PBST洗涤3次后，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG (用5%脱脂奶按1∶5 000稀释)；PBST洗涤3次后，显影曝光并分析试验结果。
1.2.12 单克隆抗体的体外中和试验 在96孔板内，将系列稀释的MAb 2G5 50 μL与MOI等于0.001的FAdV-4病毒液等体积混匀，放置37 ℃、5%CO2培养箱孵育1 h。随后接种LMH细胞，100 μL·孔-1，同时设置Mouse IgG阴性对照和LMH细胞空白对照，37 ℃孵育2 h后，用PBS洗涤1次，随即加入含1%胎牛血清的DME/F-12培养基进行培养，3 d后在倒置显微镜下观察病毒的复制情况。
1.2.13 双抗体夹心ELISA检测方法的初步应用 将制备的单抗作为捕获抗体，酶标抗体作为检测抗体进行交叉配对试验，筛选最佳捕获抗体和最佳检测抗体后，用方阵滴定法确定捕获抗体及检测抗体的最佳使用浓度。选择OD450 nm平均值最高的一组作为夹心ELISA抗体组合。按照建立好的夹心ELISA方法，检测20份SPF鸡的泄殖腔棉拭子样品，每份样品重复2孔，进行ELISA测定。计算OD450 nm的x与s，确定建立的ELISA方法的临界值(cut-off)，即小于x+3 s判定为阴性，大于x+3 s判定为阳性。利用建立好的双抗体夹心ELISA检测方法，分别检测感染FAdV-4的鸡肝细胞培养上清，传染性法氏囊病毒(IBDV) 的NF8株以及B87株弱毒疫苗，新城疫病毒(NDV) 的LaSota株、Clone30株以及CS2株弱毒疫苗。将纯化的NusA-Fiber2蛋白(0.5 mg·mL-1)以及FAdV-4细胞毒分别用PBS进行2倍倍比稀释，利用建立好的双抗体夹心ELISA法确定该方法的最低检出浓度。取5块不同批次包被的酶标板，根据OD450 nm的x与s计算批间变异系数CV= (s/x)×100%；用同一批次包被的酶标板进行批内重复，计算批内变异系数CV。
1.2.14 抗原表位筛选 为筛选出MAb 2G5所识别的抗原表位，首先将Fiber2蛋白截为两段，命名为N1、C2，根据Fiber2蛋白的基因序列设计合成引物，并以其为模板进行PCR扩增，PCR产物N1、C2部分重叠，将其分别克隆于pCAGGS-HA载体中，将构建的两个重组质粒转染LMH细胞后分别以MAb Flag (1∶800)和纯化的MAb 2G5 (1∶1 000)作为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG (1∶5 000) 为二抗对获得的MAb 2G5进行Western blot鉴定，初步确定MAb 2G5所识别的抗原区域，根据鉴定结果，再将N1的基因片段从5′端采用逐步截短法分成N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10、N11和N12，以上述Western blot方法进一步鉴定MAb 2G5识别的抗原表位区域。
2 结果 2.1 重组质粒的双酶切鉴定将公司合成大肠杆菌偏好密码子的Fiber2基因序列(1 440 bp) 及带有不同促溶标签的表达载体进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，使用T4连接酶连接双酶切产物。提取重组质粒后进行NdeⅠ和XhoⅠ双酶切验证，酶切结果与预期大小相符，重组质粒命名为276-2-Fiber2、276-3-Fiber2、276-5-Fiber2、276-6-Fiber2、276-7-Fiber2、276-9-Fiber2、276-16-Fiber2、276-21-Fiber2 (图 1)。
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A. 载体BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定；B. 目的片段BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定；C. 重组质粒酶切鉴定；M. DL5000 DNA相对分子质量标准; 1~8. 276-2、276-3、276-5、276-6、276-7、276-9、276-16、276-21双酶切片段；9. FAdV-4 Fiber2双酶切片段(1 440 bp)；10~17. Grifin-Fiber2、GST-Fiber2、NusA-Fiber2、SUMO-Fiber2、Thioredoxin-Fiber2、ArsC-Fiber2、γ-crystallin-Fiber2、PpiB-Fiber2 A. Restriction enzyme digestion of vectors; B. Restriction enzyme digestion of target fragment; C. Restriction enzyme digestion of recombinant plasmids; M. DL5000 DNA marker; 1-8. 276-2, 276-3, 276-5, 276-6, 276-7, 276-9, 276-16, 276-21; 9. FAdV-4 Fiber2 (1 440 bp); 10-17. Grifin-Fiber2, GST-Fiber2, NusA-Fiber2, SUMO-Fiber2, Thioredoxin-Fiber2, ArsC-Fiber2, γ-crystallin-Fiber2, PpiB-Fiber2 图 1 载体、目的片段双酶切及重组质粒酶切鉴定 Fig. 1 Restriction enzyme digestion of vectors and target fragment and restriction enzyme digestion of recombinant plasmids |
将鉴定正确的重组质粒转入表达菌株BL21中进行诱导表达，SDS-PAGE电泳分析表达蛋白，如图 2所示，带有不同促溶标签的重组蛋白经诱导后均出现预期大小的目的蛋白，其中重组蛋白Grifin-Fiber2、GST-Fiber2、NusA-Fiber2、SUMO-Fiber2、ArsC-Fiber2、γ-crystallin-Fiber2、PpiB-Fiber2表达产物以可溶性的形式存在于上清液中，重组蛋白Thioredoxin-Fiber2表达产物以包涵体的形式存在于沉淀中。综合结果，选取可溶性最好的NusA-Fiber2进行后续研究。
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图 2 重组蛋白的可溶性分析 Fig. 2 The solubility analysis of the recombinant protein |
诱导表达的重组蛋白NusA-Fiber2及标签蛋白NusA使用Ni-NTA Agarose纯化，如图 3A、B所示，以不同浓度咪唑洗脱，摸索蛋白纯化最佳条件，各步骤样品分别做SDS-PAGE电泳分析，NusA蛋白和NusA-Fiber2蛋白的咪唑洗脱缓冲液浓度分别为100、500 mmol·L-1，纯化后的蛋白用BCA法测定蛋白浓度分别为1.125、2.364 mg·mL-1，均定量为1 mg·mL-1后保存于-80 ℃备用。将纯化的NusA-Fiber2及NusA蛋白进行Western blot鉴定，如图 4A、B所示，纯化的NusA-Fiber2蛋白和NusA蛋白均能与His单克隆抗体特异性结合，但只有NusA-Fiber2蛋白能与FAdV-4鼠源多克隆血清特异性结合。
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A. 标签蛋白NusA纯化结果；B. 重组蛋白NusA-Fiber2纯化结果；M. PageRuler预染蛋白相对分子质量标准 A. Purification results of label protein NusA; B. Purification of recombinant NusA-Fiber2; M. PageRuler prestaining protein marker 图 3 蛋白纯化结果 Fig. 3 Protein purification results |
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A. His单克隆抗体；B. FAdV-4鼠源多克隆血清；M. PageRuler预染蛋白相对分子质量标准 A. His monoclonal antibody; B. Mouse polyclonal serum to FADV-4; M. PageRuler prestaining protein marker 图 4 Western blot鉴定结果 Fig. 4 Identification of Western blot of NusA and NusA-Fiber2 |
NusA-Fiber2蛋白稀释浓度为100 ng·μL-1，4 ℃过夜或37 ℃ 2 h；封闭条件：5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h；待检血清稀释度为1∶640，37 ℃孵育1.5 h；酶标二抗山羊抗小鼠IgG的稀释度为1∶5 000，37 ℃孵育1 h。阳性判断标准为待检血清OD450 nm大于0.234，小于0.234为阴性。
2.5 间接ELISA、IPMA检测免疫小鼠血清中fiber2抗体将免疫3周后的小鼠经尾静脉取血后进行间接ELISA方法、IPMA方法检测其抗体分泌水平，如图 5A所示ELISA检测结果，2只免疫后小鼠血清中Fiber2抗体分泌水平均较高，且血清稀释1 280倍后仍可以检测到Fiber2抗体，但免疫小鼠血清不与标签蛋白NusA发生特异性反应；IPMA检测结果如图 5B所示，经AEC显色后，免疫后小鼠血清稀释1280倍后，同样可与FAdV-4发生特异性反应，而对照小鼠血清不与FAdV-4发生特异性反应。
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A. 间接ELISA检测免疫3周后Fiber2抗体分泌水平；B. IPMA检测免疫3周后Fiber2抗体分泌水平 A. Indirect ELISA was used to detect Fiber2 antibody secretion 3 weeks after immunization; B. IPMA was used to detect Fiber2 antibody secretion 3 weeks after immunization 图 5 间接ELISA、IPMA检测免疫小鼠血清中fiber2抗体 Fig. 5 Fiber2 antibody in serum of immunized mice was detected by indirect ELISA and IPMA |
取加强免疫后小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合，通过间接ELISA检测获得7株阳性杂交瘤细胞(图 6)，4次亚克隆后，通过IPMA检测，挑选出3株能稳定分泌抗FAdV-4 Fiber2蛋白MAb的杂交瘤细胞株，分别命名为2G5、2G8、4C2 (图 7)。
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图 6 间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株 Fig. 6 Indirect ELISA was used to screen positive hybridomas |
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挑选出3株阳性杂交瘤细胞株2G5、2G8、4C2 (38-3为本实验室制备的PRV N蛋白单克隆抗体，其与阴性对照一样均不能与FAdV-4有特异性反应) Three positive hybridomas 2G5, 2G8 and 4C2 were selected (38-3 was monoclonal antibody of PRV N protein purified in our laboratory, which, like the negative control, cannot react specifically with FAdV-4) 图 7 杂交瘤细胞的IPMA筛选 Fig. 7 Screening of hybridomas by IPMA |
对MAb 2G5腹水进行纯化，SDS-PAGE电泳分析表明，纯化后的单克隆抗体可见1条大小为55 ku的重链，以及1条大小为25 ku轻链，而未见其他杂带(图 8)。
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图 8 SDS-PAGE电泳分析纯化的2G5 Fig. 8 SDA-PAGE analysis of the purified 2G5 |
对所获得的50个2G5、50个2G8以及50个4C2阳性杂交瘤细胞的染色体数目进行计数，平均为104条，是两种亲本细胞的染色体数目之和，染色体核型主要为端着丝粒，少数为中着丝粒(图 9A)。通过IPMA检测杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性，结果显示，3株单克隆细胞株均能稳定的分泌抗Fiber2抗体(图 9B)。利用试剂盒进行亚型检测发现，2G5、2G8、4C2均为典型IgG 1型抗体(图 9C)。制备的MAb 2G5，用间接ELISA方法和IPMA方法进行效价测定，其效价分别大于1∶220和1∶218。
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A. 杂交瘤细胞染色体数目检测；B. 杂交瘤细胞株分泌Fiber2抗体的稳定性检测；C. 单克隆抗体亚型鉴定 A. Check the number of chromosomes in the hybridoma cells; B. The stability of the secretion of Fiber2 antibody by hybrid tumor cell lines was determined; C. Identification of monoclonal antibody subtypes 图 9 单克隆抗体生物学分析 Fig. 9 Biological analysis of monoclonal antibodies |
为进一步验证获得的MAb 2G5的特异性，对感染FAdV-4的鸡肝细胞进行IFA及Western blot分析。检测结果显示，MAb 2G5与感染FAdV-4的鸡肝细胞呈现出特异性免疫反应，荧光显微镜下可见绿色荧光，而Mouse IgG不与感染FAdV-4的鸡肝细胞呈现出特异性免疫反应(图 10A)，Western blot检测结果显示MAb 2G5能特异性检测到FAdV-4(图 10B、C)。结果表明，获得的MAb 2G5具有针对FAdV-4 Fiber2的良好特异性，并且是具有良好IFA和Western blot反应原性的单克隆抗体，为研制针对FAdV-4的快速血清学诊断方法提供一定的试验数据。
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A. IFA检测单克隆抗体特异性；B. 感染FAdV-4 (MOI=0.01) 的LMH细胞后Western blot鉴定MAb 2G5特异性；C. 转染pCAGGS-HA-Fiber2质粒的LMH细胞后Western blot鉴定MAb 2G5特异性 A. IFA identifies the specificity of monoclonal antibodies; B. The specificity of MAb 2G5 was determined by Western blot after infected with FAdV-4 at an MOI of 0.01; C. The specificity of MAb 2G5 was determined by Western blot after transfection of LMH cells with pCAGGS-HA-Fiber2 plasmid 图 10 单克隆抗体的特异性检测 Fig. 10 Test the specificity of monoclonal antibodies |
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图 11 交叉反应性试验 Fig. 11 Cross reaction assay |
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图 12 MAb 2G5对FAdV-4识别抗原表位的鉴定 Fig. 12 Identification of FAdV-4 antigenic epitopes by MAb 2G5 |
由于Fiber2蛋白位于FAdV-4病毒表面，可能在介导病毒感染中发挥重要作用。在中和试验中，通过显微镜观察病变孔，检测到MAb 2G5最高可在1∶ 50稀释条件下有效阻断FAdV-4感染。而在小鼠IgG处理或不进行任何抗体处理的FAdV-4感染细胞中可以看到明显的病毒蚀斑。
2.11 双抗体夹心法ELISA分析捕获抗体与检测抗体进行交叉配对试验，选择OD450 nm平均值最高的一组作为夹心ELISA抗体组合。根据试验结果，选取4C2作为捕获抗体，最佳工作浓度为5 μg·mL-1，酶标抗体2G5-HRP作为检测抗体，最佳稀释比为1∶1 000。通过计算，得出20份SPF鸡的泄殖腔棉拭子样品的平均值为0.13，标准差为0.014。因此，确定该方法的临界值为0.172。利用已建立好的夹心ELISA方法检测IBDV的NF8株以及B87株弱毒疫苗，NDV的LaSota株、Clone30株以及CS2株感染的细胞上清均无交叉反应，可知该方法特异性良好(图 10)。该方法对Fiber2蛋白的最低检出浓度为0.039 μg，对FAdV-4的最低检出量为104个TCID50。该方法的批间、批内的变异系数(CV)均小于10%，证明本试验建立的双抗体夹心ELISA检测方法具有良好的重复性。
2.12 MAb 2G5的抗原表位鉴定将FAdV-4 Fiber2蛋白以及各截短质粒转染到LMH细胞中后，Western blot结果显示MAb 2G5仅与N端的片段N1 (aa1—286)发生特异性结合，不与C端的片段C2 (aa233—480)发生特异性结合；再将N1片段从5′端采用二分之一截短法分成N3 (aa1—150)、N4 (aa124—286)、N5 (aa1—92)、N6 (aa75—150)、N7 (aa1—58)、N8 (aa41—92)、N9 (aa1—39)、N10 (aa22—58)、N11 (aa1—33)和N12 (aa16—39)，结果显示，MAb 2G5能够与N3、N5、N7、N9、N11片段发生特异性反应，而均不与N4、N6、N8、N10、N12片段发生特异性反应(图 10)，表明MAb 2G5识别的氨基酸序列范围是N端aa1-aa33：1MLRAPKRRHSENGKPETEAGPSPAP IKRAKRMV33。
3 讨论自2015年6月起，HHS在全国范围内开始暴发。Niu等[14]对我国2015—2016年期间分离出的105株FAdV进行序列分析发现，其中93%为FAdV-4，说明FAdV-4是引起我国HHS的主要病原。2015年，对河南地区12个规模化养殖场40份疑似HHS感染的组织进行病原检测，FAdV-4阳性率高达87.5%[20]。目前国内对于FAdV-4的研究多集中于病毒的分离鉴定及生物学特性研究，对其蛋白的结构与功能的研究多集中于Hexon[21]。Fiber2作为FAdV-4的结构蛋白，其抗原表位具有主要的型特异性和亚属特异性，能有效刺激中和抗体产生[22]。Zhang等[21]最近报道，Fiber2是中国高致病性流行FAdV-4毒力的关键毒力因子。Schachner等[23]之前的一份报告表明，Fiber2可以对FAdV-4的高致病性感染提供有效的保护。刘超等[16]为了研究Fiber2蛋白免疫保护性，原核表达了FAdV-4 Fiber2和鼠伤寒沙门菌(Salmonellaty phimurium) 鞭毛的融合蛋白，Western blot试验表明重组蛋白能与FAdV-4阳性血清发生特异性反应，具有良好反应原性。
国内文献报道的Fiber2表达蛋白多为包涵体[17]，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象，在进行纯化时需要经过变性与复性后才能变成具有一定活性的蛋白，且纯化操作繁琐。获得可溶性的Fiber2蛋白会增加蛋白的生物学活性，有利于FAdV-4的检测和FAdV-4疫苗的研发[10, 23-28]。本试验构建了带有不同促溶标签的原核表达载体，通过低温诱导大大降低蛋白错误折叠的概率，提高了蛋白的可溶性表达效率，利用镍柱进行纯化，得到大量且纯度较高的具有生物学活性的Fiber2蛋白，制备了针对该单抗的MAb，并初步建立了具有较好特异性、敏感性和重复性的双抗体夹心ELISA检测方法，为FAdV-4的临床诊断提供了检测工具。
本试验中通过构建截短的Fiber2真核表达载体，鉴定出MAb 2G5识别的表位位于FAdV-4的Fiber2蛋白N端aa1—33之间。通过中和试验，检测到该抗体具有一定的中和活性。Wang等[11]制备的针对Fiber2蛋白的MAb 3C2识别的表位可能是构象表位，进一步研究中发现MAb 3C2识别的是具有较高中和活性的表位，位于FAdV-4的Fiber2蛋白aa416—448之间。在本研究中，制备的MAb 2G5能与Fiber2原核表达蛋白特异性反应，说明该蛋白至少有一个能被该抗体试体识别的线性表位[29-31]。同时，利用IFA和Western blot方法均可检测到MAb 2G5与FAdV-4特异性反应，证明该抗体既针对Fiber2蛋白的线性表位又针对其构象表位，可用于IFA和Western blot研究Fiber2在鸡细胞中的分布定位、表达变化等，为进一步研究Fiber2在禽疫病发病机制中的作用提供了一定基础。本研究鉴定出该单抗的表位，也为针对FAdV-4的表位疫苗的研制提供了基础。
4 结论本研究成功制备了可溶性的FAdV-4 Fiber2蛋白，且制备的MAb 2G5具有良好IFA和Western blot反应原性，同时具有一定的中和活性。初步建立了双抗体夹心ELISA检测方法，该方法具有较好特异性、敏感性和重复性，可以用于FAdV-4的检测。成功筛选出MAb 2G5在FAdV-4 Fiber2上的抗原表位识别区域：aa1—33，为进一步研究Fiber2在禽疫病发病机制中的作用提供了一定基础，也为针对FAdV-4的表位疫苗的研制提供了基础。
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