2. 俄罗斯滨海国立农学院, 乌苏里斯克市 692506;
3. 俄罗斯南乌拉尔国立大学食品技术与生物系, 车里雅宾斯克州 454080
, LI Yufu1, WU Shangze1, JIN Shengqi1, WANG Jiaqing1,3, Короткова Ирина Павловна2, GUO Wenjie1
2. Russian Coastal State Agricultural College, Usulissk 692506, Russia;
3. Department of Food and Biotechnology, South Ural State University, Chelyabinsk 454080, Russia
急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是胰腺的一种外分泌功能障碍，氧化自由基和促炎因子在该病的发生发展过程中扮演着重要的角色[1]，因此，除了抗炎以外，抗氧化也是治疗急性胰腺炎的手段之一。目前，已有研究发现，柚皮素通过调节炎症反应和氧化应激能够有效保护雨蛙素和L-精氨酸诱导的胰腺炎小鼠[2]，相关研究结果在异甘草素上也得到证实，其主要机制是调控Nrf2/HO-1信号通路[3]。核转录因子Nrf2是细胞抗氧化反应的中枢调节者，Nrf2通过与抗氧化原件HO-1相互作用调节抗氧化酶的表达，发挥抗氧化作用[4]。丹皮酚(C9H10O3，paeonol，PAE)是从毛茛科植物牡丹根皮中提取，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤以及保护神经等药理作用[5]。丹皮酚及其衍生物的化学结构中具有酚羟基官能团，在抗氧化、去除氧自由基[6]方面效果显著。因此，本课题组在前期丹皮酚体外抗氧化研究的基础上，进一步探讨其体内抗氧化能力，并深入探究丹皮酚在急性胰腺炎小鼠中的抗氧化机制，希望从分子水平证明丹皮酚的体内抗氧化能力。近年来，尽管急性胰腺炎的相关研究成果颇多，但临床治疗方法及药物较为单一。因此，研究治疗急性胰腺炎的有效药物对临床治疗此症具有十分重要的现实意义。
1 材料与方法 1.1 试验动物昆明系雄性小鼠50只，体质量18~22 g，SPF级，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物许可证号：SCXK(辽)2020-0001。
1.2 试剂丹皮酚(纯度>98.5%)和L-精氨酸(纯度≥98%)均购自大连美仑生物技术有限公司；血清丙二醛(MDA)检测试剂盒(A003-1)和总超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(A001-3)均购自南京建成生物科技有限公司；MPO一抗、二抗、组化试剂盒、DAB显色剂、苏木素染液、苏木素分化液等均购自Servicebio公司；Nrf2(稀释度1∶600)、Keap1(稀释度1∶600)抗体均购自美国ImmunoWay生物公司；HO-1(稀释度1∶600)和β-actin(稀释度1∶4 000)抗体均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；BCA蛋白质检测试剂盒购自南京建成生物有限公司。其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
1.3 试验分组与设计试验将小鼠随机分成5组，每组10只，分别为空白对照组、AP模型组和丹皮酚高、中、低剂量组。按小鼠体重，丹皮酚高、中、低剂量组每组小鼠分别灌胃剂量为100、50、25 mg·kg－1丹皮酚，每天灌胃1次，连续灌胃5 d，每次0.5 mL，同时空白对照组和AP模型组给予等体积生理盐水。试验最后一天对高、中、低剂量组小鼠灌胃丹皮酚30 min后，再对AP模型组和丹皮酚高、中、低剂量组小鼠腹腔注射4 g·kg－1的20%L-精氨酸，建立小鼠AP模型。空白对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水。6 h后检测各组小鼠血清中MDA含量和SOD活力。与此同时，取各组小鼠胰腺组织分别用于相关基因、蛋白表达检测和MPO免疫组化切片制作。
1.4 测定指标与方法1.4.1 剖检肉眼观察胰腺组织的病理变化 肉眼观察各组小鼠胰腺组织的病理变化。主要对胰腺的大小、形状以及颜色变化，胰腺组织有无出血点、出血斑，是否有坏死灶等进行观察，并用照相机拍照记录。
1.4.2 胰腺组织MPO免疫组化染色 制作胰腺组织的MPO免疫组化切片，观察胰腺组织中MPO的分布及表达。切片、封闭、洗片、一抗孵育、洗片、二抗孵育、洗片、DAB显色操作后，显微镜下观察，阳性表达产物会被染成棕褐色。比较各试验组中MPO的分布及表达。
1.4.3 小鼠氧化指标检测 按照试剂盒检测方法，测定各组小鼠血清的MAD含量和SOD活力。
1.4.4 小鼠胰腺组织目的基因mRNA表达量测定 测定小鼠胰腺组织中HO-1、Keap1和Nrf2的mRNA表达量变化。取小鼠胰腺组织制备胰腺组织裂解液，提取胰腺组织总RNA，通过反转录，获得cDNA，以cDNA为模板，采用HO-1、Keap1和Nrf2基因引物(详见表 1)，按照课题组前期摸索的试验条件，以cDNA模板1 μL，上游和下游引物(10 μmol·L－1)各0.5 μL，SYBR GREEN mastermix 10 μL，用dd H2O补足至20 μL的体系，进行Real-time PCR检测，并利用2 -△△CT方法分析结果。
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表 1 RT-PCR引物序列 Table 1 The primer sequences used in the real-time PCR |
1.4.5 小鼠胰腺组织目的蛋白表达量测定 按照总蛋白提取试剂盒说明书操作提取小鼠胰腺组织总蛋白，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒定量蛋白样本，蛋白定量后按照每孔20 μL蛋白上样液上样并进行SDS-PAGE电泳，电泳条件为电压80 V，恒压电泳2.5 h，电泳完成后进行转膜，之后采用5%的脱脂奶粉进行膜的封闭，分别用HO-1、Keap1和Nrf2一抗4 ℃过夜孵育，相应二抗37 ℃孵育45 min。加入ECL进行底物发光后，扫描胶片，分析蛋白条带的灰度值。
1.5 试验数据统计与分析所有数据需要进行统计学分析，使用SPSS Statistics 17.0软件对数据进行一维方差分析，经过分析之后的各组试验数据结果均列入三线表中。
2 结果 2.1 胰腺组织病理变化观察腹腔注射20%L-精氨酸6 h后，各组小鼠胰腺组织病理变化见图 1。图 1B为AP型组，与空白对照组相比，小鼠胰腺组织出现明显的红肿、出血、水肿等病理变化。不同剂量丹皮酚组对急性胰腺炎小鼠胰腺组织均有改善作用，其中，中剂量组和高剂量组效果较明显。
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A.空白对照组；B.急性胰腺炎模型组；C.丹皮酚低剂量组；D.丹皮酚中剂量组；E.丹皮酚高剂量组 A.Blank control group; B.AP model group; C.Paeonol low-dose group; D.Paeonol medium-dose group; E.Paeonol high-dose group 图 1 肉眼观察小鼠胰腺组织病理变化 Fig. 1 The pathological changes of pancreatic tissue in mice were observed by naked eyes |
髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)又称过氧化物酶，是血红素辅基的血红素蛋白酶，存在于中性粒细胞和单核细胞的嗜苯胺蓝颗粒中，是髓细胞的特异性标志[7]。为了进一步了解20%L-精氨酸对小鼠胰腺组织造成的损伤程度，考察不同剂量丹皮酚对急性胰腺炎胰腺组织的改善情况，本试验制作MPO免疫组化切片，观察MPO的分布及表达。如图 2所示，图 2B为AP模型组，与空白对照组相比，胰腺组织发生严重的崩解现象，组织间隙增宽，如箭头所示出现大量单核细胞、中性粒细胞浸润，其中，中性粒细胞被染成棕黄色，说明出现明显的氧化损伤及炎症反应。不同剂量组丹皮酚有不同程度的MPO分布，随着剂量的增加，如图 2C~E所示，MPO表达及分布明显减少。不仅如此，随着丹皮酚剂量的增加，胰腺组织病理损伤也得到明显的改善，尤其是高剂量组丹皮酚，接近于空白对照组。
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A.空白对照组；B.急性胰腺炎模型组；C.丹皮酚低剂量组；D.丹皮酚中剂量组；E.丹皮酚高剂量组 A.Blank control group; B.AP model group; C.Paeonol low-dose group; D.Paeonol medium dose-group; E.Paeonol high-dose group 图 2 小鼠胰腺组织MPO免疫组化结果(400×) Fig. 2 MPO immunohistochemical results of pancreatic tissue in mice (400×) |
如表 2所示，与空白对照相比，AP模型组MDA含量和SOD活力极显著上升(P < 0.01)，说明小鼠AP模型构建成功。而经过丹皮酚预处理的药物组与AP模型组相比，丹皮酚不同剂量组小鼠血清MDA含量均极显著下降且具有剂量依赖性；丹皮酚不同剂量组小鼠血清SOD的活力均极显著上升且具有剂量依赖性。
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表 2 丹皮酚对急性胰腺炎小鼠血清中SOD活力和MDA含量的影响(x±s，n=6) Table 2 Effect of paeonol on SOD activity and MDA content in serum of mice with acute pancreatitis (x±s, n=6) |
2.4.1 丹皮酚对急性胰腺炎小鼠Nrf2/HO-1通路中相关基因表达的影响 采用Real-time PCR检测小鼠胰腺组织HO-1、Keap1和Nrf2基因mRNA相对表达量，如图 3所示，与空白对照组相比，AP模型组HO-1、Keap1和Nrf2 mRNA表达量极显著升高。与AP模型组相比，不同剂量丹皮酚组Nrf2 mRNA表达量极显著升高(P < 0.01)，Keap1 mRNA表达量极显著降低(P < 0.01)，中、高剂量丹皮酚组HO-1 mRNA表达量极显著升高(P < 0.01)，低剂量组无显著变化。
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图 3 小鼠胰腺组织HO-1、Keap1以及Nrf2 mRNA表达结果 Fig. 3 mRNA expression of HO-1, Keap1 and Nrf2 in mouse pancreatic tissue |
2.4.2 丹皮酚对急性胰腺炎小鼠Nrf2/HO-1通路中相关蛋白表达的影响 采用Western blot法得到HO-1、Keap1、Nrf2及内参蛋白条带，如图 4所示，与空白对照组相比，AP模型组HO-1、Keap1和Nrf2蛋白表达量极显著升高(P < 0.01)。与AP模型组相比，不同剂量丹皮酚组HO-1、Nrf2蛋白表达量极显著升高(P < 0.01)，Keap1蛋白表达量极显著降低(P < 0.01)。不同剂量丹皮酚组各蛋白表达量呈现剂量依赖关系。
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图 4 小鼠胰腺组织HO-1、Keap1以及Nrf2蛋白表达结果 Fig. 4 Expression of HO-1, Keap1 and Nrf2 protein in mouse pancreatic tissue |
小鼠AP模型建立方法有很多，20%L-精氨酸溶液为常见诱导药物之一，其具有操作简单、重复性好、对模型动物应激较小等优点，有学者比较牛黄胆酸钠、雨蛙肽、L-精氨酸诱导急性胰腺炎效果时发现，L-精氨酸诱导AP动物模型更具重复性[8-9]。本课题组前期已完成该模型的建立，试验证明，20%L-精氨酸诱导的小鼠急性胰腺炎模型具有可重复性、临床症状明显以及病理变化典型等优点。因此，本研究采用4 g·kg－1的20%L-精氨酸腹腔注射构建小鼠AP模型。在正常情况下，机体处于氧化与抗氧化的动态平衡中，当机体受到外来因素刺激时，往往会打破此平衡。研究发现，剧烈的炎症反应是引起氧化应激的主要因素之一[10]。因此，本试验通过构建小鼠AP模型，考察胰腺炎中的氧化应激反应，探究抗氧化在保护胰腺炎中的作用，为急性胰腺炎的发病机制、治疗方案以及相关药物的研发提供理论依据。
临床调查发现，氧化应激给畜牧业生产带来极大损害，除造成免疫失败和诱发家畜传染病以外，亦会造成奶牛、肉牛、蛋鸡和猪生产性能下降，严重时会造成动物大面积死亡[11]。当机体抗氧化能力减弱甚至消失时，机体会产生大量自由基，进而发生氧化损伤，自由基的过量产生会导致脂质过氧化，这是细胞损伤的重要原因之一，MDA是脂质过氧化的主要产物[12]。因此，本试验考察不同剂量丹皮酚对AP小鼠血清MDA含量的影响，从而评估丹皮酚抗氧化能力。SOD具有专一清除氧自由基的能力，在自由基引起的炎性疾病中发挥着不可替代的作用。据研究报道，SOD可有效缓解关节炎、急性气管炎、胸膜炎等炎性疾病中的氧化损伤[13]。因此，本试验通过检测各组小鼠血清SOD活力，阐明丹皮酚体内抗氧化能力。
炎性疾病中MPO往往会催化机体各种化学反应，生成过量的氧化剂，造成机体氧化损伤[14]。因此，本文利用MPO免疫组化试验，考察丹皮酚对MPO表达的影响。为了进一步探究丹皮酚对20%L-精氨酸诱导的小鼠胰腺氧化应激的保护机制，本试验对抗氧化相关基因mRNA表达量以及蛋白含量进行了测定。核因子NF-E2相关因子2(Nrf2)是一种重要的氧化还原敏感性转录因子，对维持机体抗氧化及防御氧化损伤有重要作用[15]。有研究认为，Nrf2通过与抗氧化元件HO-1相互作用调节抗氧酶的表达发挥抗氧化作用[16]。Song等[17]在研究丹皮酚对载脂蛋白E(ApoE)缺乏小鼠动脉粥样硬化发展全过程的保护作用时发现，丹皮酚能够通过提高SOD活性及降低MDA含量进而发挥抗氧化的作用。Li等[18]在探讨丹皮酚对结扎性牙周炎大鼠的保护作用时发现，丹皮酚能通过增强Nrf2活性，从而减轻氧化应激反应，以达到有效的保护作用。此外，还有多项研究显示，丹皮酚可通过激活Nrf2/HO-1通路缓解糖尿病肾纤维化及急性酒精诱发的肝损伤[19-20]。本研究发现，丹皮酚可激活Nrf2/HO-1通路，极显著升高Nrf2/HO-1，降低Keap1 mRNA和蛋白表达，有效减少胰腺MDA含量及MPO的表达，同时提高SOD活性。
4 结论本研究根据课题组前期研究成果，进一步将丹皮酚应用于急性胰腺炎小鼠，探讨基于Nrf2/HO-1信号通路下丹皮酚对20%L-精氨酸诱导的小鼠急性胰腺炎氧化损伤的保护作用。研究发现，不同剂量丹皮酚通过激活Nrf2/HO-1信号通路可以有效阻止自身氧化损伤。本试验结果为临床急性胰腺炎的治疗提供有效替代药物，同时也为急性胰腺炎发病机制的研究提供新思路。
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