2. 杭州海关技术中心, 杭州 310012;
3. 中国检验检疫科学研究院动物检疫所, 北京 100029;
4. 呼和浩特海关技术中心, 呼和浩特 010020
, WANG Zhongcai1, HUANG Lingzhe1, MO Hongfei2, WU Shaoqiang3, LÜ Jizhou3, ZHAO Zhiguo4, SHUAI Jiangbing2
2. Technology Center of Hangzhou Customs, Hangzhou 310012, China;
3. Institute of Animal Quarantine, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100029, China;
4. Technology Center of Hohhot Customs, Hohhot 010020, China
反刍动物埃立克体(Ehrlichia ruminantium)是一类专性细胞内寄生的革兰阴性细菌[1]。由反刍动物埃立克体引起的疾病统称心水病，是一种人畜共患的自然疫源性疾病[2]，这种疾病几乎分布在撒哈拉沙漠以南非洲的所有地区和加勒比海的一些岛屿上，并传播至其他国家，其传播者主要是钝眼蜱属的希伯来钝眼蜱和美洲钝眼蜱[3-5]。该病是牛、绵羊、山羊及其他反刍动物最重要的传染病之一，临床症状包括发热、食欲不振、呼吸困难和猝死，死亡率高达80%[2, 6-7]。心水病的流行与传播媒介蜱的消长和活动规律相一致，具有明显的地方性和季节性[1-7]。心水病不仅威胁农牧业健康发展和食品安全，对流行国家造成了巨大的经济损失，而且被认为是一种潜在的新出现的人畜共患病[8-9]。
早期诊断可以有效控制反刍动物心水病。心水病传统的诊断方法是基于临床症状的血液涂片镜检和血清学检测，这些检测方法耗时较长，难以适应快速诊断和控制疫情的需要，也不适合蜱样本内的Ehrlichia ruminantium检测[10]。随着分子检测技术的快速发展，常规PCR、套式PCR、LAMP和荧光定量PCR等检测技术已应用于反刍动物血液和蜱体内Ehrlichia ruminantium的检测[11-13]。这些检测方法各有优缺点，常规PCR方法特异性和敏感性较低，扩增时容易产生假阳性；LAMP技术污染的可能性较大，条件控制要求比PCR更严格；套式PCR方法耗时、污染风险高。为了解决这些问题并满足定量结果的需要，本研究将TaqMan和Eva Green荧光定量PCR技术应用于反刍动物埃立克体的检测和定量分析。因其特异性强、敏感性高、安全省时，该技术已在医学检测和其他各个领域广泛应用。反刍动物埃立克体的分子检测主要集中在pCS20、16S RNA和map1等基因序列或基因家族[14-15]，本研究针对pCS20高度保守和特异的基因片段设计特异性引物和探针，建立pCS20TqM和pCS20EG qPCR检测方法，以便快速、准确地检测反刍动物埃立克体，为心水病的防控及分子流行病学研究提供技术支持和试验依据。
1 材料与方法 1.1 病原核酸及临床样品反刍动物埃立克体(E. ruminantium)、牛巴贝斯虫(B. bovis)、牛双芽巴贝斯虫(B. bigemina)、环形泰勒虫(Theileria annulata)、犬埃立克体(E. Canis)、牛埃立克体(E. bovis)、马埃立克体(E. equi)和立氏埃立克体(E. risticii)的基因组DNA由温州海关综合技术服务中心动植物检疫实验室提取、合成和保存。钝眼蜱采自温州口岸进境盐渍牛皮，-80 ℃保存于温州海关综合技术服务中心动植物检疫实验室。
1.2 主要试剂和仪器Quick-DNATM提取和纯化试剂盒购自ZYMO RESEARCH公司；2×TaqMan® Universal Master Mix Ⅱ购自美国ABI公司；2×SsoFast Eva Green Supermix预混液购自美国Bio-Rad公司；Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)、dNTPs(10.0 mmol·L-1)、MgCl2(25 mmol·L-1)、DL5000 DNA Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司。qTOWER3G touch荧光定量PCR仪购自德国椰拿公司；Kingfisher Duo Prime全自动核酸提取纯化仪、NanoDrop2000核酸蛋白分析仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.3 引物探针设计pCS20是反刍动物埃立克体特异性鉴定基因，根据GenBank中登录的反刍动物埃立克体pCS20基因(AY236058~AY236069)，用软件Primer 5.0分别设计TaqMan和Eva Green荧光定量PCR引物和探针，使用FAM荧光素标记TaqMan荧光定量PCR检测探针；在pCS20基因相对保守区域设计3对引物，选择最佳引物序列用于Eva Green荧光定量PCR扩增。TaqMan荧光定量PCR引物和探针序列见表 1，Eva Green荧光定量PCR引物序列见表 2。引物和探针由上海华大基因科技有限公司合成。
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表 1 pCS20TqM荧光定量PCR引物和探针序列 Table 1 Primers and probe for pCS20TqM qPCRs |
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表 2 pCS20EG荧光定量PCR引物序列 Table 2 Primers for pCS20EG qPCRs |
根据NCBI中Ehrlichia ruminantium Kwanyanga株pCS20基因序列(GenBank登录号：AY236063)合成基因片段共1 050 bp，全基因由上海华大基因科技有限公司合成。选择EcoRⅤ和NdeⅠ两个酶切位点，将目的基因克隆于pUC57载体中构建重组质粒pUC57-pCS20，重组质粒经鉴定正确后，质粒浓度稀释为20 ng·μL-1，按照公式(6.02×1023拷贝·mol-1)×质粒浓度(ng·μL-1)×10-9/(DNA长度×660)=1.74 ×109拷贝·μL-1，作为pUC57-pCS20质粒标准品备用。
1.5 优化TaqMan和Eva Green荧光定量PCR反应条件1.5.1 优化退火温度 试验使用qTOWER3G touch荧光定量PCR仪进行扩增和分析，分别以TaqMan® Universal Master Mix Ⅱ(4440038，ABI, USA)和SsoFast Eva Green® Supermix(1725200，BIO-RAD, USA)作为反应缓冲液。在缓冲液试剂盒推荐的反应体系下进行退火温度优化，TaqMan和Eva Green荧光定量PCR分别设置51~60 ℃ 10个整数值梯度退火温度，反应条件为50 ℃ 2 min去除UNG，95 ℃预变性10 min，然后95 ℃ 15 s变性，51~60 ℃退火延伸1 min并收集荧光，共40个循环。
1.5.2 优化反应体系 分别在确定退火温度后对引物和探针反应浓度进行优化。以20 pmol·μL-1的引物和10 pmol·μL-1的探针各0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0 μL进行反应，选取最佳引物和探针浓度。TaqMan荧光定量PCR 25 μL反应体系：TaqMan® Universal Master Mix Ⅱ(2×)12.5 μL，正、反向引物和探针(pCS20 F、pCS20 R和pCS20 probe)各0.25~2.0 μL(6个浓度梯度)，pUC57-pCS20的质粒标准品DNA2.0 μL，加灭菌去离子水补至25 μL。Eva Green荧光定量PCR 25 μL反应体系：SsoFast Eva Green® Supermix(2×)12.5 μL，正、反向引物(pCS20 F1~F3和pCS20 R1~R3)各0.25~2.0 μL(6个浓度梯度)，pUC57-pCS20的质粒标准品DNA2.0 μL，加灭菌去离子水补至25 μL。
1.6 特异性试验利用建立的TaqMan和Eva Green荧光定量PCR方法对反刍动物埃立克体、牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、环形泰勒虫、犬埃立克体、牛埃立克体、马埃立克体和立氏埃立克体的基因组DNA进行检测，并以pUC57-pCS20质粒标准品作为阳性对照，以灭菌去离子水作为阴性对照，按照“1.5”确定的方法进行实时荧光定量PCR，评价此方法的特异性。
1.7 敏感性试验将pUC57-pCS20质粒进行10倍梯度稀释，用已建立的反应条件进行TaqMan和Eva Green荧光定量PCR扩增，评价此方法的敏感性。
1.8 重复性试验将“1.4”制备的质粒标准品10倍倍比稀释，使用4个浓度梯度进行重复试验，将同一批不同稀释度的标准品按建立的方法重复3次进行组内重复试验，对3次不同时间段稀释的同一浓度的标准品进行组间重复试验，对试验结果进行统计，分析此方法的重复性。同时设置灭菌去离子水为阴性对照。
1.9 临床样品检测从美国、乌拉圭、苏丹和南非等不同国家盐渍牛皮上采集的硬蜱中选取420只钝眼蜱，其中美国20只、乌拉圭100只、苏丹和南非各150只，分别用建立的TaqMan、Eva Green荧光定量PCR方法和OIE推荐的套式PCP方法对420只钝眼蜱样本进行检测。反应时用pUC57-pCS20质粒作阳性对照，用灭菌去离子水作阴性对照。TaqMan和Eva Green荧光定量PCR以出现典型扩增曲线为阳性；套式PCR以电泳检测时出现目的片段，且基因测序及比对正确为阳性。
2 结果 2.1 TaqMan和Eva Green荧光定量PCR最优反应条件经退火温度和引物、探针反应浓度优化，最终确定了TaqMan和Eva Green荧光定量PCR方法的最佳退火温度分别为58 ℃和52 ℃，Eva Green荧光定量PCR的最佳引物序列为pCS20 F3和pCS20 R3，稀释的引物、探针的最佳使用量为0.75 μL。
TaqMan荧光定量PCR反应体系：TaqMan® Universal Master Mix Ⅱ(2×)12.5 μL，正、反向引物和探针(pCS20 F、pCS20 R和pCS20 probe)各0.75 μL，DNA模板2.0 μL，加灭菌去离子水至25 μL。最终确定该反应的循环参数：50 ℃ 2 min去除UNG，95 ℃ 10 min预变性；然后95 ℃变性15 s，58 ℃延伸1 min并收集荧光，共40个循环。
Eva Green荧光定量PCR反应体系：SsoFast Eva Green® Supermix(2×)12.5 μL，正、反向引物(pCS20 F3和pCS20 R3)各0.75 μL，DNA模板2.0 μL，加灭菌去离子水至25 μL。最终确定该反应的循环参数：50 ℃ 2 min去除UNG，95 ℃ 10 min预变性；然后95 ℃变性15 s，52 ℃延伸1 min并收集荧光，共40个循环。
2.2 TaqMan和Eva Green荧光定量PCR标准曲线的建立将质粒标准品pUC57-pCS20 10倍梯度稀释后，以7个稀释度进行荧光定量PCR扩增，通过系统自动分析软件分析，可以得到以Ct值为纵坐标，质粒标准品浓度对数为横坐标绘制的荧光定量PCR标准曲线(图 1)。由图 1可知，在102~108拷贝·μL-1的范围内，两种荧光定量PCR方法的标准曲线均呈现良好的线性关系，TaqMan和Eva Green荧光定量PCR线性关系表达式分别为：y=-1.273 lnx+39.307和y=-1.587 lnx+36.932，相关系数R2在0.99以上，扩增效率均高于90%。标准曲线比较理想。
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图 1 质粒标准品DNA的标准曲线图 Fig. 1 TaqMan and Eva Green Real-time PCR standard curves for pCS20 gene |
利用建立的TaqMan和Eva Green荧光定量PCR方法分别对反刍动物埃立克体、牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、环形泰勒虫、犬埃立克体、牛埃立克体、马埃立克体和立氏埃立克体的基因组DNA进行检测，并以pUC57-pCS20质粒标准品作为阳性对照，以灭菌去离子水作为阴性对照，仅反刍动物埃立克体基因组DNA和pUC57-pCS20质粒标准品出现特异性扩增曲线(图 2)，表明该检测方法的特异性较好。
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1. pUC57-pCS20质粒；2.反刍动物埃立克体；3~10. 牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、环形泰勒虫、犬埃立克体、牛埃立克体、马埃立克体、立氏埃立克体和阴性对照 1. pUC57-pCS20 plasmid; 2. Ehrlichia ruminantium; 3-9. B. bovis, B. bigemina, Theileria annulata, E. Canis, E. bovis, E. equi, E. risticii and Negative control 图 2 特异性试验结果 Fig. 2 Specific test of TaqMan and Eva Green Real-time PCR assays |
将浓度为1.74 ×105拷贝·μL-1的pUC57-pCS20质粒标准品进行10倍梯度稀释，按照所建立的条件，分别进行TaqMan和Eva Green荧光定量PCR扩增。结果表明，TaqMan荧光定量PCR最低可以检出1.74×101拷贝·μL-1的pUC57-pCS20质粒，Eva Green荧光定量PCR最低可以检出1.74拷贝·μL-1的pUC57-pCS20质粒(图 3)。
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1~6. 1.74×105~1.74×100拷贝·μL-1 pUC57-pCS20质粒；7.阴性对照 1-6. 1.74×105-1.74×100 copies·μL-1 pUC57-pCS20 plasmid; 7. Negative control 图 3 敏感性试验结果 Fig. 3 Sensitivity analysis of TaqMan and Eva Green Real-time PCR assays |
为验证所建立检测方法的重复性，对同一批稀释的标准品按照建立的方法重复3次进行组内重复试验，并对3次不同时间稀释的同一浓度的标准品进行组间重复试验，结果显示(表 3、4)，TaqMan和Eva Green荧光定量PCR组内检测的变异系数为0.00~ 1.46，组间检测的变异系数为0.49~1.29，表明该方法具有较高的可重复性。
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表 3 TaqMan荧光定量PCR的组内、组间重复性试验结果 Table 3 Intra-assay and Inter-assay reproducibility test of the TaqMan Real-time PCR |
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表 4 Eva Green荧光定量PCR的组内、组间重复性试验结果 Table 4 Intra-assay and Inter-assay reproducibility test of the Eva Green Real-time PCR |
分别采用TaqMan、Eva Green荧光定量PCR和套式PCR对420只钝眼蜱进行检测，结果如表 5所示，上述3种检测方法对钝眼蜱体内埃立克体的检出率分别为25.48%(107/420)、29.29%(123/420)和24.76%(104/420)。套式PCR检测的阳性样品，TaqMan和Eva Green荧光定量PCR检测都为阳性；TaqMan荧光定量PCR检测的阳性样品，Eva Green荧光定量PCR检测也都为阳性。对3种检测方法的敏感性进行分析，Eva Green荧光定量PCR能检出单个拷贝数的质粒标准品，TaqMan荧光定量PCR和套式PCR能检出101拷贝·μL-1的质粒标准品，Eva Green荧光定量PCR的敏感性更高，能够检出痕量的埃立克体DNA。
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表 5 TaqMan、Eva Green荧光定量PCR和套式PCR对420个钝眼蜱样品的检测结果 Table 5 Results of TaqMan qPCR、EvaGreen qPCR and Nested PCR for 420 Amblyomma samples |
心水病是一种致命的细菌性疾病，20世纪在美国首次发现[16]，由反刍动物埃立克次体引起，经钝眼蜱传播，在世界范围内严重威胁人和动物健康，曾给人类带来严重灾难[8-15]。该病目前主要发生在发展中国家，当前美国反对生物恐怖主义已将埃立克体列入生物战剂名单[17]。心水病是牛、绵羊、山羊和其他反刍动物最重要的传染病之一，急性病例死亡率高，一旦出现症状则预后不良。随着“一带一路”等国家经济发展战略的实施与深入推进，我国进出境动物、动物产品和运输工具不断增加，外来动物疫病跨境传入风险逐年加大。反刍动物埃立克体相对于其他微生物而言，繁殖、传播快，能够形成气溶胶，对我国牛羊等反刍动物主要养殖区的威胁随着进口贸易的发展日益突出，一旦侵入将会给我国牛羊养殖业带来严重经济损失。因此，迫切需要研发和建立快速简便、精准有效的检测方法作为技术储备。pCS20是一个高度保守和特异的基因，世界动物卫生组织(OIE)推荐的pCS20套式PCR已应用于多种反刍动物血液和蜱样本反刍动物埃立克体的检测[11, 18-19]，但套式PCR耗时且污染风险高，为了解决这些问题并满足定量检测的需要，qPCRs已用于反刍动物埃立克体的检测和定量分析。Steyn等[14]利用pCS20基因的qPCRs方法对心水病疫区的牛、绵羊和山羊血液及采集的蜱样本同时进行反刍动物埃立克体DNA检测，血液样本的阳性检出率为3.57%(85/2 381)，蜱样本的阳性检出率为24.52%(344/1 403)，作者分析认为有可能是在动物发热反应之前采集的蜱样本，血液中病原体含量较低，而饱血蜱体内埃立克体的浓度高于感染动物的血液，因此，以饱血蜱为研究对象的pCS20基因扩增可能更适合于确定反刍动物的埃立克体携带状况。
本研究选取pCS20基因上高度保守的区域，建立了反刍动物埃立克体TaqMan和Eva Green荧光定量PCR，对来自非洲和美洲不同国家的420只蜱进行检测，以验证两种检测方法的敏感性，并评估心水病疫区媒介蜱感染反刍动物埃立克体的情况。TaqMan荧光定量PCR在PCR扩增体系中加入TaqMan探针，其特异性有引物和探针双重保证，进一步增加了结果的可信度；Eva Green是一种新型染料，具有更强的荧光信号，Eva Green荧光定量PCR在扩增反应中不易受PCR抑制剂的影响，大大增加了扩增和延伸效率[20-21]。临床试验结果表明，本研究建立的TaqMan和Eva Green荧光定量PCR方法敏感性均高于OIE推荐的套式PCR方法，Eva Green荧光定量PCR的敏感度高出TaqMan荧光定量PCR一个数量级。
4 结论建立了两种快速检测反刍动物埃立克体的荧光定量PCR检测方法，TaqMan和Eva Green荧光定量PCR对pCS20基因的最低检测限分别为17.4和1.74拷贝·μL-1，与牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、环形泰勒虫、犬埃立克体、牛埃立克体、马埃立克体和立氏埃立克体等无交叉反应，特异性好。此方法适合大量临床样品的检测，可应用于心水病临床诊断和疫情监测，为诊断和防控心水病提供技术支持。
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