2. 全国畜牧总站, 北京 100125;
3. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193
2. National Animal Husbandry Service, Beijing 100125, China;
3. Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
双磺酸基烷化剂白消安(1, 4-丁二醇二甲磺酸酯)可用于造血干细胞移植患者移植前调理，也是慢性粒细胞白血病慢性期治疗药物，能有效减轻粒细胞总负荷，缓解症状，改善患者状态[1-2]；还经常被用于制备精原干细胞移植受体，并进行精子发生机理研究[3]。但利用白消安长期治疗，会损害患者睾丸，甚至导致不育现象[4]。
睾丸内生精小管上皮中，支持细胞(sertoli cells, SCs)间及支持细胞和生精细胞间形成了外质特化(ectoplasmic specializations, ES)、紧密连接(tight junction, TJ)、间隙连接(gap junctions, GJ)和桥粒连接(anchoring junction, AJ)等各种连接复合体，它们相互链接共同构成血睾屏障(blood testis barrier, BTB)[5-7]，这种特殊的血液-组织屏障阻挡了血液中各种来源生物大分子的通过[8]，可保护机体自身免受免疫反应伤害，使睾丸成为机体重要的免疫豁免区[9]。然而，越来越多的研究表明，睾丸炎症是诱发雄性生殖障碍甚至不育的重要因素，这一免疫豁免区的炎症反应，特别是炎症因子对睾丸机能的调节作用逐渐成为研究的焦点[10-12]。研究表明，动物体内IL-1、IL-6、和TNF-α等炎性因子含量升高，可引发睾丸炎症，损害到BTB结构[13-15]。而对小鼠的研究表明，以25 mg·kg-1的剂量腹腔注射白消安后会导致小鼠不育，并在注射21 d后，在不育小鼠体内检测到TNF-α的mRNA水平显著增加[16]。然而，目前白消安处理对睾丸的毒性机理尚不明确，白消安是否通过了BTB并诱导了睾丸损伤？
为此，本研究对白消安处理小鼠进行睾丸生物素示踪试验，采用液质联用靶向测定其附睾尾精液，并对小鼠血清进行炎性因子ELISA检测，以深入揭示白消安对睾丸的毒性机理，为降低白消安毒性损伤，提高制备精原干细胞移植受体的效率及安全性提供理论基础，为探讨白消安作用下雄性生精机能的科学防护与恢复治疗提供科学指导。
1 材料与方法 1.1 试验动物及饲养管理选取96只7~8周龄健康、繁殖性能正常的ICR品系雄性小白鼠，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。整个试验过程中，试验鼠在20~25 ℃、自然光照条件下饲养，自由采食、饮水，每周更换1次垫料。试验鼠及试验方法均符合中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物实验福利伦理审查(No.IAS2019-13)要求。
1.2 主要试剂及药品配制白消安(busulfan)、氯化钠(NaCl)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；酒精、二甲苯购自北京化学试剂公司；戊巴比妥钠购自德国Merck公司；石蜡购自上海华灵康复器械厂；甲醛溶液购自汕头市西陇化工厂；多聚甲醛购自天津市光复精细化工研究所；双氧水(H2O2)、苏木素购自武汉赛维尔生物有限公司；EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin和Streptavidin-Alexa Fluor® 555 conjugate购自美国APExBIO公司；炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的ELISA试剂盒购自江苏酶免生物科技有限公司。
白消安溶液配制：将12 mg白消安粉末溶解在1 mL DMSO中，并加入1 mL生理盐水，最终白消安浓度为6 mg·mL-1。
DMSO溶液配制：向1 mL DMSO中加入1 mL生理盐水，混匀，即为DMSO溶液。
1.3 试验鼠的白消安处理以睾丸注射白消安作为试验组、睾丸注射DMSO溶液为对照组，进行白消安睾丸注射试验，注射方法为单点注射，共有96只试验鼠。小鼠睾丸注射白消安的浓度参考文献[16]，即6 mg·mL-1白消安为试验组注射浓度。
白消安试验组：以60 mg·kg-1体重剂量腹腔注射2%戊巴比妥钠进行小鼠全身麻醉，使麻醉鼠保持仰卧姿势，把睾丸从腹腔轻揉地挤入阴囊，然后用75%医用酒精对阴囊部位消毒，用左手食指与拇指固定单侧睾丸，右手持无菌静脉输液针(针头另一侧连接1 mL注射器，内含白消安注射液)，根据睾丸表面血管分布情况，避开睾丸白膜上的血管直接穿透阴囊进入睾丸，用力推注射器将白消安注入睾丸，白消安注射浓度为每侧6 mg·mL-1，根据小鼠体重决定注射剂量，计算方法为注射白消安体积等于小鼠体重(V=M，V：注射体积，单位μL；M：小鼠体重，单位g)。对侧睾丸采用同样处理后，处理鼠单笼饲养，观察表现。
对照组：雄性ICR小鼠双侧睾丸分别注射与处理组等体积的DMSO溶液，注射步骤参考白消安试验组。
1.4 白消安处理鼠睾丸的生物素示踪1.4.1 白消安处理鼠的生物素示踪处理 分别于白消安处理后0、12、24、36 h，按照注射白消安的方法，将25 μL生物示踪素EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin(溶于PBS中，达到10 mg·mL-1的浓度)注入小鼠睾丸，同样处理对侧睾丸。每个时间点注射3只鼠，共12只。
1.4.2 切片染色 注射生物示踪素30 min后，脱颈处死小鼠，用剪刀从阴囊取出睾丸，组织OCT包埋剂包埋，置于液氮中快速冷冻后，-20 ℃冷冻切片机中切割为5 μm厚睾丸切片，载玻片贴片后室温干燥10 min，待组织切片完全贴合在载玻片上，室温下，用1 mL 4%PFA(多聚甲醛)固定10 min，固定后PBS重复洗涤，然后用移液枪吸取6 μL Streptavidin-Alexa Fluor® 555 conjugate，用PBS稀释到1.5 mL，再用移液枪滴在切片上，室温下避光染色30 min。
1.4.3 细胞核染色及封片处理 切片染色结束后，PBS重复洗涤，去除残余的Streptavidin-Alexa Fluor® 555 conjugate，再取4′, 6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)室温下避光染细胞核5 min。染色结束后，用中性树脂分别滴于载玻片四角，盖上盖玻片。封片后，避光干燥30 min，然后置于荧光显微镜下观察切片。
1.5 液质联用靶向测定附睾尾精液白消安含量1.5.1 样本采集 分别于睾丸注射白消安后第0.5、1、2、3、4、5、6、9、12、24、36、48、60、72 h，脱颈处死试验鼠，用剪刀从阴囊中取出附睾，用镊子挤出精液，收集至1.5 mL离心管中，以备后续液质联用靶向测定白消安含量。每个时间点注射3只鼠，共42只。
1.5.2 样品前处理 向附睾精液样品加入1 mL乙腈，超声5 min后，20 000×g离心5 min，取0.5 mL上清液至上样小瓶，进行液质联用靶向测定。
1.5.3 液质联用靶向测定实验参数设置 高效液相色谱使用的色谱柱为ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 Column, 130Å, 1.7 μm, 2.1 mm * 100 mm；流动相为10 mmol·L-1甲酸铵(A相)-甲醇(B相)，流速为0.3 mL·min-1，洗脱的设置见表 1，质谱定量离子对的质量见表 2。
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表 1 洗脱程序的设置 Table 1 Setting of the elution program |
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表 2 质谱定量离子对的设置 Table 2 Setting of mass spectrometry ion pair |
1.6.1 样本采集 分别于睾丸注射白消安后第0、12、24、36、48、60、72 h以及4、5、6、7、14、21和28 d，抓取试验鼠，使其眼球突出，用镊子拽出一侧眼球，然后用1.5 mL离心管收集血液。每个时间点注射3只鼠，共42只。静置2 h后，3 000 r·min-1离心15 min分离血清，于-20 ℃冰箱中保存，以备后续炎性因子检测研究。
1.6.2 ELISA试验操作步骤 设置酶标包被板的标准品孔和样本孔，向各标准品孔分别加入标准品50 μL，加样时采用浓度由低到高的顺序顺次加入，样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁。其中，TNF-α标准品浓度依次为0、40、80、160、320、640 pg·mL-1，IL-1β和IL-6标准品浓度依次为0、7.5、15、30、60、120 pg·mL-1；样品孔分为空白对照孔、待测样品孔，向待测样品孔加入样品稀释液40 μL，然后再加待测样品10 μL(即将样品做5倍稀释)，空白孔不加样品及样品稀释液，加样后轻轻晃动酶标板混匀，然后，除空白孔外，每孔加入酶标试剂100 μL，再用封板膜封板后37 ℃温育60 min；将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干；每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min；每孔加终止液50 μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。使用酶标仪检测各孔吸光度(OD值)，以空白孔调零，450 nm波长下依序测量，测定应在加终止液后15 min内进行。
1.7 数据分析使用Excel和SPSS 20.0软件对数据进行整理和统计分析，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)以及t检验进行组间差异显著性检验，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 睾丸注射白消安24 h后BTB被破坏小鼠睾丸生物素示踪结果显示，对照组小鼠睾丸曲细精管中，Biotin的红色荧光只存在于睾丸间质中，并未进入曲细精管中，表明对照组睾丸的BTB功能完好，能够阻挡Biotin由曲细精管外向曲细精管内渗漏(图 1A、B)；试验组中，在注射白消安12 h后，曲细精管内也未检测到Biotin的红色荧光(图 1C、D)，但在注射24 h后，在曲细精管内部检测到了红色荧光，表明Biotin已经渗漏进曲细精管内部(图 1E、F)，BTB已经被破坏，在注射36 h后，曲细精管内部的Biotin红色荧光更为清晰，分布更广泛(图 1G、H)。
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A、B.对照组；C、D.注射白消安12 h；E、F.注射白消安24 h；G、H.注射白消安36 h。A、C、E、G.EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin；B、D、F、H.EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin+DAPI。其中，EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin染色后呈红色荧光，细胞核DAPI染色后呈蓝色荧光，黄色箭头指的是EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin的渗透范围 A, B. Control group; C, D. Busulfan injection for 12 hours; E, F. Busulfan injection for 24 hours; G, H. Busulfan injection for 36 hours. A, C, E, G. EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin; B, D, F, H. EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin+DAPI. Among them, EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin is stained with red fluorescence, and nucleus DAPI is stained with blue fluorescence. The yellow arrow refers to the penetration range of EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin 图 1 小鼠睾丸注射白消安后的生物素(EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin)示踪结果 Fig. 1 Results of EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin tracing in mouse testis after injected with busulfan |
液质联用检测结果表明，睾丸注射白消安30 min后，附睾精液中就可检测到最高比例的白消安(0.038 3±0.001 1)%；随时间推移，附睾精液白消安含量逐渐递减(图 2)，这种扩散速度表明，白消安分子可直接穿越BTB，自由进出曲细精管，并随曲细精管液流，经附睾头进入附睾尾，并以较快的速度衰减。
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图 2 小鼠睾丸注射白消安后附睾精液中白消安的相对含量 Fig. 2 The relative content of busulfan in epididymal semen after injection of busulfan into mouse testis |
图 3显示，睾丸注射白消安后，血清TNF-α、IL-1β和IL-6浓度均逐渐增加，注射36 h后均显著高于对照组，21 d后达峰值水平，最大浓度分别为TNF-α：(1 855.51±10.32)pg·mL-1、IL-1β：(293.59±3.34)pg·mL-1、IL-6：(340.30±12.55)pg·mL-1，随后，均逐渐降低。结果表明，小鼠睾丸注射白消安后，血清中TNF-α、IL-1β和IL-6浓度显著上升。
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*. P＜0.05; **. P＜0.01 图 3 小鼠睾丸注射白消安后血清炎性因子ELISA检测结果 Fig. 3 ELISA test results of serum inflammatory factors after injection of busulfan into mouse testis |
目前，使用白消安治疗癌症以及制备SSCs移植受体已经越来越普遍，且白消安的癌症治疗成功率及SSCs移植受体制备效果逐渐改善。但由于白消安毒性较强，导致雄性生育能力受到损害，SSCs移植受体制备面临安全隐患[17-18]。近年来，为深入探索精子发生与成熟的生理基础，提升种公畜繁殖效率，实现繁殖控制，SSCs移植受体制备越来越受关注[19]。如何缓解或避免白消安毒性已引起高度重视。本研究首次通过生物素示踪、液质联用靶向测定和炎性因子ELISA测定，深入探索了白消安处理导致小鼠雄性不育的毒性机理。
对大鼠腹腔注射CdCl2(3 mg·kg-1)的研究表明，通过大鼠睾丸注射生物素(EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin)示踪，最早在注射CdCl2 3 d后，在曲细精管内部观察到了生物素示踪的红色荧光，推断在注射CdCl2 3 d后BTB结构被破坏[20-21]。借鉴这一试验方法，本研究观察到小鼠睾丸注射白消安24 h后，在曲细精管检测到了生物素的红色荧光，并且随时间推移，曲细精管中的红色荧光越来越强，分布越来越广。所以推断，本研究中，小鼠睾丸白消安注射24 h左右，BTB被破坏，这一时间比CdCl2研究结果提前了48 h。分析原因，可能是腹腔注射的CdCl2需要通过腹腔血液循环运输到大鼠睾丸，一方面推迟了对BTB的作用时间，另一方面，腹腔注射后药物的自由扩散影响了其靶向性，结果只有少部分药物抵达睾丸，增加了对机体的毒副作用，也影响了作用效果。
白消安突破睾丸BTB进入曲细精管，是其发挥毒害作用的前提，但目前尚未见到关于白消安突破并通过选择性屏障BTB的研究报道。本研究的检测结果表明，小鼠睾丸注射白消安30 min后，白消安即扩散到了附睾精液中，随时间推移，在附睾精液中的含量逐渐消减，并在注射12 h后，很快由痕量检出到无法测出。本研究的这一检测结果与白消安平均半衰期2.5 h的理论值基本相符[22]。同时，研究表明，BTB复合体可选择性地允许代谢物、第二信使和其他分子量小于1 ku的分子通过[23-24]，而白消安分子量为246.29 u，远小于这个分子量阈值[25]，由此推断，白消安小分子可通过扩散自由进出BTB，并随曲细精管液流，进入附睾尾。而自由出入BTB的白消安对睾丸造成的伤害，可能是从内外多个方向、多个位点同时进行的。
早期研究表明，小鼠腹腔注射白消安(25 mg·kg-1) 21 d后，其体内TNF-α的mRNA水平显著增加[16, 26]，但是，未见关于其他炎性因子mRNA水平的研究报道，也未见白消安处理后相关因子蛋白水平的研究结果，无法推知白消安处理是否通过诱发睾丸炎症，影响了雄性生殖能力。本研究在白消安处理后，检测到炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6浓度逐渐增加，并且在处理36 h后，达到显著水平。研究表明，小鼠各炎性因子的生理范围分别为TNF-α: 365.4~533 pg·mL-1[27-28]、IL-1β: 74.45~120 pg·mL-1[29]、IL-6:62.56~115.5 pg·mL-1[30]。本研究中白消安处理72 h后，小鼠体内IL-1β浓度超过生理上限，达到(121.83±0.80)pg·mL-1，IL-6浓度超过生理上限，达到(120.99±1.09)pg·mL-1，4 d后，小鼠体内TNF-α浓度超过生理上限，达到(572.26±15.39)pg·mL-1，这3种炎性因子突破生理浓度上限，标志了睾丸炎的发生，随时间推移，各炎症因子水平进一步提高，到21 d后达到峰值，随后逐渐下降，各炎性因子水平变化过程，标志了睾丸炎症反应发生、发展及逐渐恢复的过程。由此推断，长时间的炎症反应对睾丸生精机能产生了毒害，影响到了雄性个体的生育机能，甚至导致雄性不育。
研究表明，褪黑素(melatonin)、维生素等被用于缓解白消安处理导致的氧化应激，这些药物通过抗氧化作用，可有效地降低白消安处理后产生的ROS[31-32]。同时，研究表明，炎症反应过程中也会激活p38 MAPK信号转导通路，形成大量ROS[33]，所以，氧化应激和炎症反应是白消安毒害的两种表现，也可能是导致睾丸毒害的两个相互影响、互为因果的过程，所以推测，这些药物在抑制氧化应激的同时，也抑制了炎症反应，最终缓解了白消安毒性。本团队后续将会设计试验，探索最合适有效的缓解白消安毒性的抗炎药物，以降低白消安处理的毒副作用，并研究炎症相关信号通路在减轻或预防雄性不育中的作用，为有效防控白消安处理引起雄性繁殖机能损伤甚至不育提供新思路。
4 结论白消安可自由穿越血睾屏障，在小鼠睾丸注射白消安24 h左右，生物示踪素突破BTB，且引起血清中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6浓度升高，并逐渐达显著水平，于21 d后达到最高浓度，随后逐渐下降。
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