2. 农业部猪遗传育种重点开放实验室, 武汉 430070;
3. 农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室, 武汉 430070
2. Key Laboratory of Pig Genetics and Breeding of Ministry of Agriculture, Wuhan 430070, China;
3. Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics, Breeding and Reproduction (Huazhong Agricultural University) of Ministry of Education, Wuhan 430070, China
褪黑素(melatonin，MT)首次提取自牛的松果腺，其主要由色氨酸在酶催化作用下形成。MT微量存在于多种生物体内，细菌、单细胞真核生物、藻类、植物、无脊椎动物和脊椎动物都要由它参与维持正常生物活动，主要影响糖和脂质的代谢、氧化应激防御、活性氧(reactive oxygen species，ROS)清除、防止癌变及免疫调节等[1-2]。MT对干细胞具有多种调控作用，其中，脑组织中松果腺分泌的MT含量很高，有改善组织损伤，预防神经退行性疾病发生的作用[3]。方佳[4]通过添加MT处理犬间充质干细胞，发现MT可有效缓解细胞衰老，激活抗氧化基因NRF2表达，并在异种移植后取得良好成效。Gao等[5]发现，MT能显著提高诱导多能干细胞的重编程效率，下调凋亡基因P21和P53的表达，诱导后的干细胞可表达OCT4、SOX2、NANOG等标志基因。MT还可在癌症治疗过程中充当生殖细胞的保护剂，能有效缓解白消安等抗癌药物对精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)的损害，但对SSCs本身会有何种影响仍有待研究[6]。
SSCs是雄性动物体内精子发生的基础，也是唯一能将遗传信息传递给下一代的成体干细胞[7-8]。随着SSCs移植技术的出现，人们开始逐渐关注SSCs对精子品质的影响作用。猪作为一种重要的经济牲畜，利用SSCs来提高公猪的繁殖能力是新的研究方向。而猪SSCs的敏感性使其易受外界物质的影响，因此，找寻可以促进SSCs增殖分化的有益物质，或研究有害物质对SSCs损伤机制以制定保护方案，对提高公猪的生产性能有着重要的意义。本研究以分离自7日龄大白公猪的SSCs作为试验材料，希望通过研究MT对公猪SSCs的影响及作用机制，进而应用到生产中达到提高公猪繁殖性能的目的。
1 材料与方法 1.1 试验材料1.1.1 试验动物组织采集 睾丸组织采集于华中农业大学精品猪场提供的3头7日龄健康大白公猪，酒精擦拭消毒并切开阴囊进行睾丸摘取手术，获取的睾丸用酒精冲洗消毒后放置在冰盒中于30 min内带回实验室用于细胞分离。
1.1.2 主要药品试剂及仪器 RIPA裂解液、BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒、ROS检测试剂盒、脂质氧化MDA检测试剂盒、总谷胱甘肽检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；褪黑素购自北京百灵威科技有限公司；胎牛血清(FBS)、DMEM/F12培养基购自Gibco代理公司；胶质细胞神经源性因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)购自武汉汇宇诚生物科技有限公司；TRIzol、PVDF膜及荧光定量板购自莫纳生物科技有限公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix购自Bimake公司；Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液(PBS)、青链霉素购自Hyclon公司；Western blot试剂盒购自武汉赛维尔生物技术有限公司；β-tubulin、Bax、总Caspase3、Bcl-2、UCHL1抗体购自ABclonal公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自碧云天公司；SOD2抗体购自Bioswamp公司；CCK-8试剂盒(cell counting kit-8, Cat No.40203)购自上海翊圣生物科技有限公司；猪ST细胞购自武汉大学细胞库。
荧光定量RT-qPCR仪LightCycler480型(Roche公司)；CO2细胞培养箱(德国MEMMERT公司)；凝胶成像系统(美国IBM公司)；Western blot电泳仪(武汉赛维尔生物技术有限公司)；PerkimELmer 2030酶标仪(联想生物有限公司)。
1.2 饲养层细胞制备传代培养猪支持细胞(sertoli cells，ST)，当细胞密度长至80%左右加入15 μg·mg-1的丝裂霉素C，在37 ℃培养箱内孵育1 h。孵育完成后使用PBS冲洗3次ST细胞以清除残留的丝裂霉素C。获得的ST细胞即成为饲养层细胞，可按需求使用或冻存。
1.3 猪睾丸细胞分离纯化1.3.1 细胞悬液制备 采集7日龄大白猪睾丸，酒精消毒后于30 min内带回进行细胞分离。用无菌手术刀切开睾丸外侧浆膜白膜并剥离睾丸实质，滴加PBS冲洗3次，剪碎成2~3 mm3大小组织块。剪碎的组织加入3倍体积胶原酶Ⅳ于37 ℃消化25 min，如观察到生精小管则表示消化完全。加入3倍体积胰蛋白酶与DNAseI于37 ℃消化20 min，如消观察到生精小管被消化则表示消化完全，加入含血清培养液终止消化。依次经200和400目细胞筛过滤，过滤后的液体即为睾丸细胞悬液。
1.3.2 差速贴壁法纯化细胞 将0.1%明胶溶液覆盖于培养皿底层在37 ℃环境中包被30 min，包被完成后，在使用前PBS冲洗3次以去除多余明胶。过筛后的细胞悬液加入培养皿中，在37 ℃培养箱中进行差速贴壁。其中，第一次差速贴壁过程持续2 h，将漂浮在培养液中的未贴壁细胞移至新培养皿中。第二次差速贴壁过程4 h，漂浮在培养液中的未贴壁细胞转移至饲养层细胞上培养。
1.4 SSCs的碱性磷酸酶染色弃去细胞培养液，PBS清洗细胞去除残留血清成分。加入4%多聚甲醛固定细胞30 min，固定期间配制碱性磷酸酶染色液，染色液需现用现配，避光4 ℃保存。弃去4%多聚甲醛，PBS清洗2~3遍以除去残留，加入染色液避光孵育10~20 min。弃去染色液，PBS清洗后在显微镜下观察染色情况。
1.5 SSCs的免疫荧光染色挑SSCs克隆至细胞爬片上培养，待细胞长至合适状态使用PBS清洗3次去除血清成分。加入4%多聚甲醛没过细胞，固定30 min后PBS清洗残留的多聚甲醛。加入0.1% Triton X-100透化细胞10 min，PBS清洗细胞爬片。加入10% 胎牛血清、1% 牛血清白蛋白的封闭液缓冲液，封闭细胞30 min。在封闭液中稀释抗体，4 ℃一抗孵育过夜、37 ℃二抗孵育1 h，树脂封片后观察。由武汉赛维尔生物技术有限公司负责制作。
1.6 引物设计在NCBI数据库查中下载基因蛋白编码(CDS)区序列作为模板，通过Oligo 7软件设计引物后，将引物序列发至上海生工生物有限公司进行合成。引物序列见表 1。
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表 1 基因引物序列 Table 1 The sequences of gene primers |
将MT粉末溶于DMSO中配制母液于－20℃避光保存，使用时提前解冻并用细胞培养液稀释。SSCs传代至细胞平板中培养，待细胞长至90%汇合度左右加入含添加物的细胞培养液进行处理。设置MT浓度梯度(0、50、250、500、1 000 μmol·mL-1) 组处理SSCs，每组设3个试验重复，空白对照组加入0.1% DMSO处理。
1.8 SSCs的总RNA提取及cDNA合成细胞总RNA利用TRIzol法提取，经核酸浓度测定仪测定浓度，1.5%琼脂糖凝胶电泳检验RNA质量。使用反转录试剂盒合成cDNA。
1.9 实时定量PCR检测依据定量PCR试剂盒配制反应体系，使用LightCycler 480 Real-Time PCR Detection System进行实时定量PCR扩增，LightCycler® 480 Software1.5软件收集定量PCR数据。定量体系(2×SYBR Green qPCR Master Mix 5 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O补足至10 μL)于95 ℃预变性3 min。40个循环：95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。
数据分析以β-actin为内参基因，按照2-△△Ct方法计算各基因相对表达丰度。每个样品设有3个独立生物学重复，每个重复进行3个技术重复。
1.10 CCK8检测SSCs的细胞活力将SSCs传至96孔细胞板中培养，每孔加入100 μL含添加物的细胞培养液培养，进行检测前先用PBS清洗2~3次去除添加物残留。各处理组设6个生物学重复，同时建立不含细胞的空白对照组，在每孔中加入100 μL常规细胞培养液和10 μL CCK 8。37 ℃温箱中孵育30~60 min，放入酶标仪内检测并记录450 nm波长吸光度。计算各孔细胞的细胞活力，计算公式为：细胞活力(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(对照)-A(空白)]×100。其中，A(加药)为具有细胞、CCK8溶液、药物溶液孔的吸光度；A(对照)为具有细胞、CCK8溶液而不含药物孔的吸光度；A(空白)为只含有培养液、CCK8溶液孔的吸光度。
1.11 SSCs的总ROS检测按1∶1 000比例添加Rousp处理30 min设置阳性对照，用无血清培养液稀释DCFH-DA浓度为10 μmol·L-1，对于6孔板每孔加入稀释液不能少于1 mL。37 ℃细胞培养箱内孵育20 min后，用无血清培养液洗涤细胞3次，荧光显微镜下观察。
1.12 SSCs的总GSH含量检测离心收集细胞，加入细胞沉淀体积3倍量的蛋白去除试剂S溶液并充分震荡。然后利用液氮和37 ℃水浴对样品进行两次快速的冻融，4 ℃或冰浴放置5 min后，4 ℃ 10 000×g离心10 min，取上清用于总谷胱甘肽(glutathione，GSH)的测定。在96孔板中加入10 μL样品和150 μL总谷胱甘肽检测工作液，孵育5 min后加入50 μL (0.5 mg·mL-1) NADPH，室温孵育25 min并利用酶标仪测定412 nm吸光度。
1.13 SSCs的总蛋白提取及凋亡蛋白的Western blot检测按照细胞裂解液RIPA∶PMSF=100∶1的比例配置，PMSF的浓度为1 mmol·L-1。每孔加入200 μL裂解液震荡裂解5 min后，将液体转移至1.5 mL离心管中，12 000 r·min-1离心5 min后转移上清液。利用BCA试剂盒(碧云天)测定蛋白浓度，浓度统一后取80 μL上清液和20 μL。5×蛋白上样缓冲液混合后煮沸10 min，冷却后放置在－80 ℃保存。
根据蛋白大小按照Western blot试剂盒(赛维尔)内推荐浓度制胶。分别制作10%分离胶与5%浓缩胶，蛋白点样后90 V电压下电泳25 min，确保条带位于两层胶交界处。120 V电压继续电泳50 min，至蛋白marker完全分离。剪取PVDF膜浸泡在甲醇中激活5 min后，确保PVDF膜与蛋白胶之间无气泡并能完全覆盖, 将转膜夹安装在电泳槽中，加入预冷的转膜液，埋在冰中用200 mA稳定电流转膜1 h。PVDF膜浸入含5%脱脂奶粉的TBST封闭液中，与37 ℃摇床100 r·min-1孵育2 h。抗体按需求提前稀释，一抗4 ℃孵育过夜，二抗与37 ℃摇床100 r·min-1孵育1 h。清洗PVDF膜，加入显影液后放入化学发光图像分析系统采集图像，利用ImageJ软件进行条带光灰度值分析。
1.14 数据统计与分析数据统计分析及作图使用Praphpad prism 5软件，两组间数据差异采用t检验分析。无差异时不表示(P＞0.05)，差异显著以*表示(P＜0.05)，差异极显著时以**表示(P＜0.01)。
2 结果 2.1 猪SSCs的鉴定2.1.1 细胞形态学观察 分离的细胞培养至14 d左右时，团块大小和数量不断增大，并可用肉眼观察到细胞培养板中的白色克隆团(图 1A)。在400倍显微镜下观察克隆团，可观察到克隆团主要由无色圆形细胞聚集而成(图 1B)。本研究在培养猪SSCs过程中发现，单独的SSC呈圆形或椭圆形，并且在体外培养过程中单独的细胞会聚集转变为有立体结构的圆簇型或葡萄簇型，符合SSCs体外培养的生长特性[9-10]。
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A. 细胞克隆团；B. 显微镜观察细胞克隆团(400×) A. Cloning cluster; B. Microscopic observation of the cell clones(400×) 图 1 克隆团细胞形态学观察 Fig. 1 Observation of the morphology of clonal cells |
2.1.2 AKP染色鉴定克隆样细胞 AKP染色前观察细胞状态，圆簇型克隆团及饲养层细胞处于无色透明状态(图 2A)。染色后观察，克隆团细胞被染为棕褐色，饲养层细胞大部分不着色(图 2B)。可初步说明克隆团内存在SSCs。
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A. AKP染色前克隆团无色透明；B. AKP染色后克隆团着深褐色 A. The clone cluster is colorless and transparent before AKP staining; B. After AKP staining, the clone cluster with alkaline phosphatase positive is dark-brown 图 2 克隆团细胞碱性磷酸酶染色 Fig. 2 Alkaline phosphatase staining of clonal cells |
2.1.3 SSCs分子标记检测 实时定量PCR检测结果表明，干细胞标志基因OCT4在克隆团细胞中表达量显著高于ST细胞与间质细胞(leydig cells，LY)(图 3B)；SSCs标志基因NANOG在克隆团细胞中表达量显著高于ST细胞与LY细胞(图 3A)；SSCs标志基因PLZF在克隆团细胞中表达量显著高于ST细胞与LY细胞(图 3C)。表明克隆团主要由SSCs组成。
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A. NANOG基因的表达差异；B. OCT4基因的表达差异；C. PLZF基因的表达差异。*. P＜0.05；**. P＜0.01，下同 A. Difference in expression of NANOG gene; B. Difference in expression of OCT4 gene; C. Difference in expression of PLZF gene. *. P < 0.05;**. P < 0.01, the same as below 图 3 实时定量PCR检测标志基因表达量 Fig. 3 Quantitative real-time PCR detection of marker genes expression |
2.1.4 细胞免疫荧光检测 荧光显微镜下观察处理后的细胞爬片, 其中DAPI将所有细胞核染出。调整荧光镜片，可观测到UCHL1及SOX2抗体阳性荧光反应(图 4)。将两组结果组合，发现荧光抗体阳性反应主要集中于细胞克隆团处，克隆团周围其它细胞无荧光信号。结果表明，克隆团细胞特异性表达SSCs标记基因UCHL1与干细胞标志基因SOX2。
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A. 荧光检测UCHL1基因表达；B. 荧光检测SOX2基因表达 A. Fluorescence detection of UCHL1 gene expression; B. Fluorescence detection of SOX2 gene expression 图 4 标记基因荧光信号检测 Fig. 4 Detection of fluorescent signal of marker genes |
2.2.1 MT提高猪SSCs活力 设置MT浓度梯度组处理SSCs，经CCK8细胞活力检测发现，各浓度组在处理细胞24 h时，细胞活力无显著差异；各浓度组在处理48 h时，MT浓度50 μmol·mL-1以上的处理组细胞活力较对照组显著上升(P＜0.05，图 5)。结果表明，MT具有提高猪SSCs细胞活力的作用。
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A. 48 h时各处理组与对照组间存在显著差异(P＜0.05) A. There is a significant difference between the treatment groups and the control group at 48 h(P < 0.05) 图 5 MT对猪SSCs活力的影响 Fig. 5 Effect of MT on the cell viability in SSCs of pigs |
2.2.2 MT降低猪SSCs ROS水平 Rosup处理细胞作为阳性对照(图 6A)，不同浓度MT处理细胞48 h后检测各组荧光强度(图 6B~D)。将各组荧光结果进行量化，50 μmol·mL-1处理组ROS水平与对照组无显著差异，250 μmol·mL-1处理组ROS水平显著低于对照组(P＜0.05，图 6E)。结果表明，MT处理SSCs后可降低细胞内ROS水平。
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A. Rosup处理细胞30 min；B. DMSO处理细胞48 h；C. 50 μmol·mL-1 MT处理细胞48 h；D. 250 μmol·mL-1 MT处理细胞48 h；E. ROS荧光强度量化 A. Rosup treatment of cells; B. DMSO treated cells for 48 h; C. 50 μmol·mL-1 MT treatment for 48 h; D. 250 μmol·mL-1 MT treatment for 24 h; E. Quantification of ROS fluorescence intensity 图 6 MT对猪SSCs内ROS含量的影响 Fig. 6 Effect of MT on the content of ROS in pig SSCs |
2.2.3 MT提高猪SSCs GSH含量 稀释谷胱甘肽(glutathione，GSH)标准品为2、5、10、15、25 mol·L-1制作标准曲线(图 7A)。检测发现，50 μmol·mL-1 MT处理SSCs 48 h后细胞内GSH含量无显著变化，250 μmol·mL-1 MT处理SSCs 48 h后，细胞内GSH含量极显著上升(P＜0.01，图 7B)。结果表明，MT添加后可提高SSCs内GSH含量。
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A. GSH浓度标准曲线；B. 不同浓度MT处理48 h后GSH含量 A. GSH concentration standard curve; B. Changes in GSH content after treatment with different concentrations of MT after 48 h 图 7 MT对猪SSCs内GSH含量的影响 Fig. 7 Effect of MT on GSH content in pig SSCs |
2.2.4 MT抑制凋亡蛋白表达 选用50、250 μmol·mL-1浓度MT处理细胞48 h后提取蛋白。蛋白条带结果显示，50与250 μmol·mL-1处理组总Caspase 3、Bax凋亡蛋白亮度随着MT浓度增加而变暗，Bcl-2抗凋亡蛋白亮度无明显变化(图 8A)。量化蛋白条带灰度值，检测到到250 μmol·mL-1组总Caspase 3表达量极显著低于对照组(P＜0.01，图 8C)，50和250 μmol·mL-1组Bax/Bcl-2比值显著低于对照组(P＜0.05，图 8B)。
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A. 凋亡蛋白条带分析；B. Bax/Bcl-2量化蛋白条带灰度值量化；C. Caspase 3量化蛋白条带灰度值量化 A. Band analysis of apoptotic protein; B. Quantification of gray value of Bax/Bcl-2 protein band; C. Quantification of gray value of Caspase 3 protein band 图 8 MT对猪SSCs内凋亡蛋白表达的影响 Fig. 8 Effect of MT on the expression of apoptotic protein in pig SSCs |
对SSCs的研究需要大量活性和纯度高的细胞，因此，幼龄动物的睾丸是理想的实验材料。本研究选用了7日龄大白猪睾丸进行细胞分离，此时生精小管内SSCs细胞数量处于一个巅峰状态，且分化进程还未发生。SSCs起源于胚胎外胚层，与胚胎干细胞具有相同的特性，单个细胞呈圆形或椭圆形，细胞直径约为9~12 μm，胞内除线粒体、核糖体外其它细胞器均不发达[11]。Zhang等[12]分离PIC猪的生殖细胞，在培养过程中细胞会发生聚集形成SSCs群落。Zhao等[9]通过分离巴马香猪的SSCs发现，体外培养的SSCs会聚集成圆簇状或葡萄簇状的克隆团。本研究在培养分离的细胞3 d后观察到细胞开始聚集，7 d后观察到结构紧密的细胞簇出现，挑克隆观察发现，由若干圆形细胞构成，培养过程中具有SSCs的生长特征。
SSCs的分离纯化是进行体外培养及研究的基础。最早人们利用胰蛋白酶、DNase Ⅰ曾成功分离出小鼠SSCs，后经不断完善，利用胶原酶Ⅳ、胰蛋白酶及DNase Ⅰ分步消化是最为常用的方法[13]。胶原酶Ⅳ可以消化睾丸组织中的细胞间质，胰蛋白酶消化使细胞分散，而DNase Ⅰ可以消化漂浮的DNA防止细胞黏连。本研究以观察到生精小管的出现表示胶原酶Ⅳ消化完全。胰蛋白酶主要作用是使细胞分散，本研究中，为避免消化时间过长对SSCs造成损伤，以能观察到大部分生精小管被消化表示胰蛋白酶消化完全。
SSCs常用的纯化方法是差速贴壁法，其利用了不同细胞间贴壁速率差异的特性。将细胞悬液在明胶基质或层黏连蛋白包被过的培养皿上短时间培养，SSCs由于贴壁能力差，短时内只会松散依附在其它细胞上层。此时轻轻吹打后收集未贴壁细胞，并对此进行多次贴壁培养，最终即可得到相对纯度较高的SSCs[14]。此方法一般用于分离小鼠或大鼠等动物的睾丸细胞，但近年来有也有用此方法成功分离出牛和猪等大型动物SSCs的报道[15]。本研究共进行了两次差速贴壁获得3批细胞，其中第3批细胞在培养7 d后可观察到大量SSCs样克隆团出现。由于SSCs差速贴壁后仍无法与其它细胞彻底分离，故进行后续试验前应采用挑克隆培养方式进一步纯化。
AKP染色是常用的干细胞鉴定方式。未分化的干细胞膜上具有高水平的AKP表达，利用试剂盒可使细胞内的AKP水解生成奈酚，与重氮盐结合后呈蓝紫或深褐色显现，此方法已在小鼠上成功鉴定出SSCs[16-17]。Zhao等[9]通过AKP染色鉴定出了巴马香猪的SSCs，陈庭锋[10]通过AKP染色鉴定出了姜曲海猪的SSCs。为避免染色过深造成视野不清晰，本研究的避光染色过程中为15 min，染色后可明显观察到细胞克隆团着棕褐色，表明克隆团细胞中存在SSCs。
有报道称，一些分子可作为猪SSCs标志物, 但由于其自身功能复杂等原因，特异性及敏感度较高的SSCs标志物仍无法统一[18]。OCT4(POU5F1)属于POU转录因子家族的Ⅴ类，是干细胞中普遍表达的特异性基因，其表达量会随着干细胞分化的进行而不断下降[19]。SOX2属于SOXB1亚家族，作为一种干细胞中常见的标志物，在SSCs及其起源早期原始生殖细胞(primordial germ cell, PGC)中都有表达[20-21]。Buaas等[22]在小鼠中敲除PLZF基因后发现，小鼠产生生殖缺陷，染色后观察到PLZF与OCT4在未分化SSCs中共表达，可作为标志基因。NANOG被发现在猪SSCs内特异性表达，表达量会随着动物年龄增长而不断下调[23]。UCHL1(PGP 9.5)全称泛素末端水解酶1，被证实在猪、牛、水牛、山羊SSCs上特异性表达，现常作为家畜生殖细胞鉴定的有效标志物[24]。本研究选用睾丸内常见的ST细胞和LY细胞作为对照，利用实时定量PCR的方法检测标志基因在不同细胞中表达量的差异。从结果可以看出，克隆团细胞中干细胞标志基因OCT4及SSCs标记基因NANOG、PLZF表达量均显著高于对照组，说明，克隆团细胞主要由SSCs组成。采用细胞免疫荧光法处理细胞，经荧光显微镜下可观察到克隆团处具有荧光反应，证明克隆团细胞表达SSCs的标记基因UCHL1与干细胞标志基因SOX2。通过上述鉴定结果可证明，培养得到的克隆团细胞主要为SSCs。
MT作为一种调控动物生殖发育的重要激素，在动物生殖系统中分布广泛。有研究称，MT能显著提高精子质量和活力，增强受精过程中精子的超活化作用，可充当冻精保护剂使用[25]。Gholami等[26]对移植了SSCs的小鼠连续10 d注射MT，HE染色后发现，注射MT小鼠生精小管内细胞的形态明显好于未注射MT的小鼠。对于体外培养的卵母细胞，MT能显著提高细胞的成熟，并保护细胞免受氧化应激的影响[27-28]。虽有关MT作用的报道已有很多，但其是否对猪SSCs有直接影响仍未见报道。本研究设置了若干MT浓度组处理SSCs，发现在处理48 h后50 μmol·mL-1以上试验组细胞活力发生显著升高。表明MT对猪SSCs的细胞活力有促进作用。
精液冷冻过程中常用MT作为保护剂使用。李崇阳[29]通过研究奶牛性控冻精后发现，MT能有效缓解精子解冻过程中产生的ROS。本研究在添加MT后发现，SSCs内ROS含量随MT浓度的上升而下降，GSH含量随着MT浓度的升高而上升。上述结果说明，MT是可通过提高SSCs内GSH含量来清除细胞内产生的ROS，保护细胞不受损伤。另一方面，MT主要通过受体介导G蛋白信号传导途径行使生理功能，其中，MT1和MT2受体亚型存在于所有脊椎动物中[30]。Yang等[31]发现，牛ST细胞MT1、MT2基因表达随着MT浓度提高而上升。李波[32]在用MT处理小鼠SSCs细胞后检测到MT1、MT2蛋白表达升高。本研究下一步将验证MT处理后猪SSCs MT1、MT2基因的表达变化。
细胞在正常生理活动过程中或受到外界刺激对导致ROS含量升高。张明[33]在用镉处理猪ST细胞后，发现细胞ROS含量上升发生氧化损伤并引发细胞凋亡。有报道称，通过添加玉米赤霉烯酮而引发氧化损伤的ST细胞中，线粒体会释放细胞色素C(cytochrome c，Cyt-c)到胞浆中, 活化Caspase 9后进一步激活凋亡基因Caspase 3的表达[34-35]。另一方面，促凋亡蛋白Bax可转移至线粒体膜上，形成一条Bax通道来介导Cyt-c释放的过程[36-37]。同属于Bcl家族的Bcl-2是抗凋亡蛋白中的一种，除可调节Caspase家族的激活外，其BH1、BH2结构域还会与Bax结合发生异二聚化来限制Bax的凋亡作用，并通过两者间比例来决定细胞的存亡[38-40]。本研究利用Western blot检测MT处理后细胞中凋亡蛋白表达情况，发现随着MT浓度升高凋亡蛋白Caspase 3与Bax/Bcl-2比例发生下降。由于MT能有效清除细胞受外界刺激或代谢过程中产生的ROS，细胞损伤得到抑制促使了凋亡基因表达下调。如后续研究可验证MT不会对SSCs产生促分化等其他影响，则可考虑在体外培养SSCs的过程中加入MT来保护细胞存活。
4 结论添加MT后可促进猪SSCs细胞活力上升，是由于MT可直接清除细胞内产生的ROS，提高了总GSH含量，抑制了凋亡基因的表达。表明MT具有保护细胞不受损伤和促进猪SSCs活力的作用。
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