2. 四川省草原科学研究院, 成都 611731
2. Sichuan Academy of Grassland Sciences, Chengdu 611731, China
胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor binding proteins, IGFBPs)是IGFs的重要组成之一，与IGF配体、IGF受体间相互作用共同调节生物学过程，是胚胎正常发育和出生后机体生长必需的生长因子，参与了脊椎动物生长、新陈代谢、生殖和免疫等调控过程[1-2]。IGFBPs主要涉及IGF依赖和独立作用，IGF依赖作用主要体现在调节IGF的生物利用度，独立作用主要体现在细胞凋亡和细胞周期等调控作用[3]。IGFBP4是IGF信号通路中一种重要的抑制因子，与IGF配体具有较强的亲和力，主要表现为IGF依赖作用，可与IGF配体结合调节生物活性[4]。IGFBP5作为IGFBPs家族中最保守的成员，也主要表现为IGF依赖作用，体现在既能高亲和地与IGF配体结合以降低游离IGF配体浓度达到抑制IGF配体的作用，又能结合IGF配体后将其募集到低浓度区域达到促进IGF配体的作用[5]。IGFBP4和IGFBP5可通过协同作用参与诸多生物过程如肝的生长发育等，在动物的生长发育过程中发挥重要作用[6]。目前已知的7种IGFBPs (IGFBP1~IGFBP7)虽都能与IGF配体结合，但在组织器官分布及生物学作用上不尽相同。迄今为止，关于黄牛[7]、绵羊[8]和山羊[9-10]等多种大型家畜的IGFBP4和IGFBP5相继被克隆报道，但尚未见其在牦牛中的研究。
牦牛(Bos grunniens)是我国青藏高原高山牧区特有的畜牧种质资源，常年生活在气候寒冷、高度缺氧、强紫外线、牧草缺少等极端生态环境中，它们为生活在高海拔的农牧民提供了基本的乳肉品资源，也是当地畜牧业发展的重要保障[11-12]。麦洼牦牛主产于四川省阿坝藏族羌族自治州海拔3 500 m以上的红原县瓦切、麦洼及若尔盖县包座一带，是乳肉兼用高原型地方优良品种，也是我国动物遗传资源中珍稀的畜种资源和基因库[13-14]。肝是哺乳动物机体内最大的消化腺及代谢器官，利用内分泌因子不断调节新陈代谢平衡，在各种营养/有害物质代谢、蛋白质合成和消化液合成等过程中发挥重要功能[15-16]。动物生长发育过程中，外源性细胞色素P450等生物活性物质可对肝的成熟和代谢进行调节[17]。因此，本研究以麦洼牦牛为试验对象，克隆IGFBP4和IGFBP5基因序列，分析其分子结构及功能，并探究其在麦洼牦牛肝组织不同生长阶段的表达特征，为该类因子对牦牛肝生长发育调控及其功能研究提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 样本采集及处理试验动物分为1日龄组、15月龄组和5岁龄组的健康雌性麦洼牦牛，每组3个生物学重复，体重分别约为(12.35±1.85)、(98.88±2.50)和(268.55±27.82)kg，采自四川省阿坝藏族羌族自治州红原县。空腹24 h后快速放血处死，取5岁龄麦洼牦牛心、肝、脾、肺、肾、小肠组织及1日龄、15月龄和5岁龄麦洼牦牛肝组织放入液氮中冷冻，并于－80 ℃保存备用。部分1日龄、15月龄和5岁龄麦洼牦牛肝组织用4%多聚甲醛固定，运回实验室置于常温备用。
1.2 主要试剂及仪器1.1×T3 Super PCR Mix、DL-2000 DNA marker购自北京擎科公司；RNAiso Plus、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒、TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ购自日本TaKaRa公司；动物全蛋白提取试剂盒(C510003)、HRP标记的山羊抗兔/鼠IgG(D110058、D110087)、PVDF印迹膜(F619536)、ECL发光试剂(C510043)购自上海生工公司；BCA Protein Assay Kit购自天根生化科技有限公司；多克隆兔抗IGFBP4和IGFBP5(bs-10585R、bs-0406R)购自北京Bioss公司；单克隆鼠抗β-actin(CW0096)购自北京康为世纪公司；组化二抗试剂盒(产品编号为SP9001)购自北京中杉金桥公司。
稳压稳流电泳仪(型号为DYY-6B)购自北京市六一仪器厂；冷冻离心机(型号为5430R)购自德国Eppendorf公司；凝胶成像系统(型号为Universal Hood Ⅱ)、实时荧光定量PCR仪(型号为CFX96)、半干转膜仪(型号为Trans-Blot TurboTM System)、免染蛋白印迹转运系统(型号为ChemiDocTM Imaging System)购自美国Bio-Rad公司；紫外可见分光光度计BioSpec-nano购自日本岛津生命科学公司；光学显微镜(型号为CX22)购自日本OLMPUS公司；石蜡切片机(型号为RM2235)、徕卡显微成像系统(型号为DM1000)购自德国Leica公司。
1.3 IGFBP4和IGFBP5基因扩增取5岁龄牦牛心、肝、脾、肺、肾和小肠及1日龄、15月龄和5岁龄牦牛肝于液氮中快速冷冻，各加入RNAiso Plus提取总RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳及BioSpec-nano分别检测RNA的完整性和质量。参考本试验室已有牦牛肝转录组序列，用Primer Premier 5.0设计引物序列，详见表 1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。取肝cDNA(采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒合成cDNA)进行PCR扩增，反应体系：模板cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL。反应程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，63 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃ 2 min；4 ℃保存。将阳性PCR产物送公司测序。
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表 1 基因的引物序列 Table 1 Primer sequence of genes |
采用DNAStar、DNAMAN等软件组装、翻译测序结果，并通过Blast与NCBI数据库序列进行比对；应用Mega5.2软件中的邻接法(Neighbor-Joining，NJ算法)构建氨基酸系统进化树，用MegAlign软件分析其基因同源性；用ExPASy在线软件(https://www.expasy.org)进行蛋白结构分析。
1.5 IGFBP4和IGFBP5基因表达谱分析用qRT-PCR方法检测IGFBP4和IGFBP5基因在5岁龄牦牛各组织中的表达情况。以β-actin作为内参基因，引物序列详见表 1。qRT-PCR扩增体系：模板cDNA 1 μL，上、下游引物各0.8 μL，ddH2O 2.2 μL，TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ 5.2 μL。扩增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，65 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共39次循环；熔解曲线65~95 ℃每5 s增加0.5 ℃。
1.6 IGFBP4和IGFBP5 mRNA在牦牛不同生长阶段肝中的表达以β-actin作为内参基因，用qRT-PCR方法检测IGFBP4和IGFBP5基因在1日龄、15月龄和5岁龄牦牛肝中的表达水平。反应体系、程序同1.5，引物序列详见表 1。用本实验室已有的肝RNA-Seq数据分析IGFBP4和IGFBP5基因在1日龄、15月龄和5岁龄牦牛肝中的表达水平。
1.7 IGFBP4和IGFBP5蛋白在牦牛不同生长阶段肝中的表达取1日龄、15月龄和5岁龄牦牛肝组织样品，根据动物全蛋白提取试剂盒提取肝组织总蛋白，按照BCA Protein Assay Kit进行浓度检测，并将其稀释为同一浓度，分装后于-80 ℃保存。将蛋白经SDS-PAGE分离后，以25 V转膜30 min，5%脱脂奶粉封闭，先后孵育IGFBP4、IGFBP5、β-actin一抗(4 ℃过夜，1∶1 000/1∶1 000/1∶2 500)和IgG-HRP二抗(室温1 h，1∶10 000)，利用化学发光液进行ECL显色并拍照。
1.8 IGFBP4和IGFBP5蛋白在牦牛不同生长阶段肝中的定位及表达利用免疫组化染色法检测IGFBP4和IGFBP5蛋白的定位及表达。将1日龄、15月龄和5岁龄牦牛肝组织从4%的多聚甲醛固定液中取出，制成石蜡切片。用0.01 mol·L-1 PBS代替一抗作阴性对照，脱蜡水化后用枸橼酸缓冲液(pH 6.0)进行抗原修复，加入阻断剂后用PBS (pH 7.4)冲洗；滴加适量的正常山羊血清进行封闭，滴加一抗(多克隆兔抗IGFBP4和IGFBP5均按1∶100稀释后使用) 4 ℃孵育过夜后滴加二抗，加入适量DAB显色液显色，苏木精复染后，脱水、透明、封片。用光学显微镜观察染色结果并拍照。
1.9 统计学分析qRT-PCR检测结果以肺的Ct值作为不同组织间差异定量分析的参照，采用2-ΔΔCT法进行分析；Western blot检测结果采用Image J软件测定结果图片中的灰度值并进行分析；免疫组化结果采用Image Pro Plus 6.0计算机图像分析软件测定IGFBP4和IGFBP5阳性反应物的相对平均光密度值并进行分析。以上各数据均使用SPSS 24.0统计软件进行单因素ANOVA分析，结果用“平均值±标准差”表示，P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 IGFBP4和IGFBP5基因克隆取5岁龄牦牛心、肝、脾、肺、肾和小肠及1日龄、15月龄和5岁龄牦牛肝的总RNA，检测可观察到清晰的5S、18S和28S三条带，其OD260nm/OD280nm值均在1.8~2.0之间，说明提取的RNA完整性较高、质量较好。IGFBP4和IGFBP5基因PCR扩增后分别得到777和816 bp的条带(图 1)，将测序得到的基因序列提交至GenBank，序列号分别为MT012934、MT003005。
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M. DNA相对分子质量标准；1~2. IGFBP4和IGFBP5基因扩增产物 M. DNA Marker 2 000 bp; 1-2. The products of IGFBP4 and IGFBP5 genes, respectively 图 1 IGFBP4和IGFBP5基因PCR结果 Fig. 1 PCR amplification of IGFBP4 and IGFBP5 genes |
2.2.1 IGFBP4和IGFBP5系统进化树构建及基因同源性分析 牦牛IGFBP4和IGFBP5基因的开放阅读框分别为777和816 bp，分别编码258和271个氨基酸。IGFBP4和IGFBP5蛋白序列构建的系统进化树如图 2所示，牦牛IGFBP4和IGFBP5蛋白均最先与黄牛、水牛聚为一簇，再与绵羊、山羊、马、猪聚为一簇，最后与小鼠、大鼠和人聚为一簇，表明牦牛IGFBP4和IGFBP5蛋白CDS区高度保守，与黄牛亲缘关系最近，其次为水牛。同源性分析显示，牦牛IGFBP4和IGFBP5基因与黄牛的同源性最高，分别达99.6%、99.5%，与水牛(99.1%、98.8%)、山羊(98.8%、97.2%)、绵羊(98.7%、97.7%)、猪(95.5%、95.2%)、马(93.6%、93.8%)、人(95.2%、94.7%)次之，与大鼠(88.0%、90.1%)、小鼠(89.0%、89.8%)的同源性最低。分析同物种间IGFBP4和IGFBP5基因的同源性结果可知，牦牛、黄牛、水牛、绵羊、山羊、猪、马、小鼠、大鼠、人基因间同源性在55.1%~59.2%之间，其中牦牛IGFBP4和IGFBP5基因间的同源性达58.7%。
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图 2 IGFBP4和IGFBP5蛋白系统进化树的构建 Fig. 2 Phylogenetic tree of IGFBP4 and IGFBP5 proteins |
2.2.2 IGFBP4和IGFBP5蛋白结构分析 预测得到IGFBP4和IGFBP5蛋白的分子式分别为C1184H1914N364O363S25、C1294H2092N390O394S28，分子量分别为27.86和30.31 ku，等电点分别为7.10和8.56，说明此两种蛋白均为弱碱性蛋白。其平均亲水性(GRAVY)分别为－0.474和－0.631，可知这两种蛋白质均为亲水性蛋白质，与ProtScale分析结果一致。IGFBP4和IGFBP5分别在1~18和2~20位氨基酸处具有跨膜区，均为跨膜蛋白；分别在23、20位氨基酸上存在剪切位点峰值(C值：0.702、0.785)，23、20位存在结合剪切位点峰值(Y值：0.786、0.853)和9、11位存在信号肽峰值(S值：0.984、0.989)，表明均有信号肽序列，为分泌蛋白。
IGFBP4和IGFBP5蛋白分别由59.69%和62.36%的随机卷曲、25.97%和20.30%的α-螺旋、9.30%和9.23%的延伸链、5.04%和8.12%的β-转角组成，表明这两种蛋白主要结构元件均为随机卷曲和α-螺旋。IGFBP4和IGFBP5蛋白分别在25~101、174~249位氨基酸和24~100、191~262位氨基酸均具有胰岛素样生长因子结合蛋白结构域和甲状腺球蛋白1结构域，分别属于胰岛素样生长因子结合蛋白超家族结构域(IGFBP superfamily)和甲状腺球蛋白超家族结构域(TY superfamily)。三级结构预测表明，IGFBP4模型与1wqj.1.A模型一致性最高，可达到97.50%；IGFBP5模型与2 dsq.1.A模型一致性最高，可达到64.63%。
2.3 牦牛IGFBP4和IGFBP5基因组织表达谱IGFBP4和IGFBP5基因在5岁龄牦牛不同组织中表达量结果表明，IGFBP4在肝中表达量最高，与肾、心脏、小肠、脾、肺均存在极显著差异(P < 0.01)，肾、心中次之，小肠和脾中表达较弱，肺脏中表达量最低。IGFBP5在肝脏中表达量最高，与肾、心、小肠、脾、肺均存在极显著差异(P < 0.01)，肾、心中次之，小肠和脾中表达较弱，肺中表达量最低(图 3)。
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不同大写字母表示同一基因在不同组织之间的表达差异极显著(P < 0.01)；**表示同种组织不同基因之间的表达差异极显著(P < 0.01) The different uppercase letters indicate that the expression difference between different tissues in the same gene is extremely significant (P < 0.01); Statistically significant expression differences between different genes in the same tissue are indicated by double asterisks (P < 0.01) 图 3 牦牛IGFBP4和IGFBP5基因的组织表达谱 Fig. 3 The expression of IGFBP4 and IGFBP5 genes in different tissues of yak |
同一组织中IGFBP4和IGFBP5基因差异表达量结果表明，在心、肝、脾、肺、肾和小肠6种组织中IGFBP4基因的表达量均极显著高于IGFBP5基因的表达量，具有极显著差异(P < 0.01) (图 3)。计算IGFBP4和IGFBP5基因在不同组织中表达量之间的皮尔逊相关性可知，其皮尔逊相关系数(r)为0.992，即两基因间表达量呈正相关。综上所述，IGFBP4和IGFBP5基因在各组织中均有表达，且IGFBP4基因的表达量极显著高于IGFBP5，均在肝中表达量最高，存在极显著差异(P < 0.01)，具有组织特异性。
2.4 qRT-PCR检测IGFBP4和IGFBP5 mRNA在牦牛不同生长阶段肝中的表达分别用qRT-PCR检测和本实验室已有的肝RNA-Seq数据分析IGFBP4和IGFBP5基因在1日龄、15月龄和5岁龄牦牛肝组织中表达量，结果表明，IGFBP4和IGFBP5基因在肝组织中均呈时序表达，即5岁龄>15月龄>1日龄，具有极显著差异(P < 0.01，图 4A)。计算肝RNA-seq的FPKM值结果表明，肝RNA-Seq测序结果与qRT-PCR结果一致，表明qRT-PCR的表达结果可靠(图 4B)。
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不同大写字母表示同一基因在不同生长阶段之间的表达差异极显著(P < 0.01)；**表示同一生长阶段不同基因之间的表达差异极显著(P < 0.01)，下同 The different uppercase letters indicate that the expression difference between different growth stages in the same gene is extremely significant (P < 0.01); Statistically expression significant differences between different genes at the same growth stage are indicated by double asterisks (P < 0.01); The same as below 图 4 IGFBP4和IGFBP5基因在不同生长阶段牦牛肝组织中的表达 Fig. 4 The expression of IGFBP4 and IGFBP5 genes in liver at different growth stages of yak |
qRT-PCR检测同一生长阶段中IGFBP4和IGFBP5基因差异表达量结果表明，在1日龄、15月龄和5岁龄牦牛肝中IGFBP4基因的表达量均极显著高于IGFBP5基因的表达量，具有极显著差异(P < 0.01，图 4)。计算IGFBP4和IGFBP5基因在不同生长阶段肝中表达量之间的皮尔逊相关性可知，其皮尔逊相关系数(r)为0.990，即两基因间表达量呈显著正相关(P < 0.05)。综上所述，IGFBP4和IGFBP5基因在肝脏组织中呈5岁龄>15月龄>1日龄的时序表达，且IGFBP4基因的表达量极显著高于IGFBP5基因(P < 0.01)。
2.5 Western blot检测IGFBP4和IGFBP5蛋白在牦牛不同生长阶段肝中的表达由于IGFBP4和IGFBP5基因在不同生长阶段牦牛肝中表达量有极显著差异，采用Western blot检测IGFBP4和IGFBP5蛋白在1日龄、15月龄和5岁龄牦牛肝组织中表达量。结果表明，IGFBP4和IGFBP5蛋白在肝组织中均呈时序表达，即5岁龄>15月龄>1日龄，具有极显著差异(P < 0.01，图 5)。
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图 5 牦牛IGFBP4和IGFBP5蛋白在不同生长阶段牦牛肝组织中的表达 Fig. 5 The expression of IGFBP4 and IGFBP5 proteins in liver at different growth stages of yak |
Western blot检测同一生长阶段中IGFBP4和IGFBP5蛋白差异表达量结果表明，在1日龄、15月龄和5岁龄牦牛肝中IGFBP4蛋白的表达量均极显著高于IGFBP5蛋白的表达量(P < 0.01，图 5)。计算IGFBP4和IGFBP5蛋白在不同生长阶段肝中表达量之间的皮尔逊相关性可知，其皮尔逊相关系数(r)为0.923，即两蛋白间表达量呈显著正相关(P < 0.05)。综上所述，IGFBP4和IGFBP5蛋白在肝组织中呈5岁龄>15月龄>1日龄的时序表达，且IGFBP4蛋白的表达量极显著高于IGFBP5蛋白(P < 0.01)。
2.6 免疫组化检测IGFBP4和IGFBP5蛋白在牦牛不同生长阶段肝的定位及表达采用免疫组化技术检测IGFBP4和IGFBP5蛋白在不同生长阶段牦牛肝中的细胞定位及表达情况。结果显示，以棕黄色或黄色判定为阳性细胞，在1日龄、15月龄和5岁龄牦牛肝中IGFBP4和IGFBP5蛋白均有表达，主要在肝细胞的细胞质中表达(图 6A-I)。平均光密度值分析发现，IGFBP4和IGFBP5蛋白在肝组织中均呈时间序列表达，即5岁龄>15月龄>1日龄，具有极显著差异(P < 0.01，图 6J)。同一生长阶段中IGFBP4和IGFBP5蛋白差异表达量结果表明，在1日龄、15月龄和5岁龄牦牛肝中IGFBP4蛋白的表达量均极显著高于IGFBP5蛋白的表达量(P < 0.01，图 6J)。计算IGFBP4和IGFBP5蛋白在不同生长阶段肝中表达量之间的皮尔逊相关性可知，其皮尔逊相关系数(r)为0.946，即两蛋白间表达量呈极显著正相关(P < 0.01)。通过qRT-PCR、Western blot和免疫组化技术分析发现，IGFBP4和IGFBP5的mRNA和蛋白水平在肝脏组织中均呈5岁龄>15月龄>1日龄的时序表达，且IGFBP4的表达量极显著高于IGFBP5(P < 0.01)。
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用0.01 mol·L-1 PBS代替一抗作阴性对照。KC.枯否细胞；HCs.肝细胞；L.淋巴细胞 Negative control was conducted by replacing first antibody with 0.01 mol·L-1 PBS. KC. Kupffer cell; HCs. Hepatocytes; L. Lymphocyte 图 6 IGFBP4和IGFBP5蛋白在不同生长阶段牦牛肝组织中的定位及表达 Fig. 6 The expression and localization of IGFBP4 and IGFBP5 proteins in liver at different growth stages of yak |
本试验成功克隆了牦牛IGFBP4和IGFBP5基因CDS序列。牦牛IGFBP4和IGFBP5基因CDS序列与黄牛(GenBank登录号分别为：NP_776982.1、NP_001098797.1)相比，分别有第3、4位碱基发生突变，但仅分别导致第7位甲硫氨酸突变为缬氨酸(7Met→Val)、第185位赖氨酸突变为谷氨酸(185Lys→GlT)，其他氨基酸发生同义突变。由此可推测，上述突变对IGFBP4和IGFBP5在牦牛的表达及其生长调控具有一定的影响。系统进化树显示，牦牛IGFBP4和IGFBP5蛋白序列与黄牛、水牛聚类最近，并且其基因序列均与黄牛、水牛的同源性最高，分析原因可能是三者均为牛属，这表明IGFBP4和IGFBP5基因在牛属动物物种之间亲缘关系较近，在物种遗传进化过程中具有高度保守性，提示不同物种的IGFBP4、IGFBP5基因在功能上可能具有相似性。IGFBPs蛋白一级结构分为3个明显的区域：保守的N端区域、高变的中央区域和保守的C端区域，哺乳动物IGFBPs的N端和C端具有更高的同源性，这与IGF的高亲和力有关[18]。本试验结果发现，牦牛IGFBP4和IGFBP5蛋白的N端和C端均为IGFBP超家族结构域和TY超家族结构域，具有高度同源性，这表明IGFBPs蛋白在动物进化过程中高度保守，具有高度同源性。IGFBP4和IGFBP5蛋白二级结构主要由随机卷曲和α-螺旋组成，在高级结构中可形成螺旋-转角-螺旋结构，这有助于IGFBP4和IGFBP5在体内循环系统中与IGFs相互结合，调控IGFs的半衰期，提高IGFs的生理活性，从而参与IGFs的生长发育调控作用[19]。
3.2 IGFBP4和IGFBP5基因组织表达谱IGFBPs作为IGFs的高亲和力结合伴侣，是IGFs作用的主要调节剂，主要在肝中合成，其亲和力主要由磷酸化、糖基化和特异的蛋白水解控制，将特定残基进行翻译后修饰，具有促进有丝分裂、诱导细胞分化、调节生长等作用[20]。IGFBP4和IGFBP5基因的功能基本一致，主要表现在IGFs依赖作用。本试验中，牦牛IGFBP4和IGFBP5基因在各组织中广泛表达，且IGFBP4基因表达量在心、肝、脾、肾和小肠中均极显著高于IGFBP5基因表达量(P < 0.01)，推测牦牛IGFBPs基因可能以肝和局部组织共同分泌的方式作用于IGF的活性调节。IGFBP4通过降低结缔组织生长因子和CXC趋化因子受体4的水平发挥抗纤维化活性，并具有抑制细胞增殖、促进软骨表型表达和抑制肥大分化的作用[21-22]。IGFBP5可促进牙髓干细胞的血管生成和神经源性分化潜能，并促进肌内前体脂肪细胞的增殖、肌细胞内脂肪的分解以及游离脂肪酸向胞外转运[23-24]。IGFBP4在绵羊肝中的相对表达量最高[8]，与本试验检测IGFBP4基因在5岁龄牦牛肝组织中表达量最高结果一致，存在显著性差异(P < 0.01)。IGFBP5在绒山羊肾[25]、绵羊心[8]和草原红牛脾[26]中的相对表达量最高。而本试验结果中，IGFBP5在牦牛肝中的相对表达量最高，表明IGFBP5在不同物种中的相对表达量有所差异，可能由于IGFBP5在各组织中以不同的分泌(自分泌与旁分泌)形式产生所致。
3.3 IGFBP4和IGFBP5在不同生长阶段肝中的表达IGFBPs作为生长发育的关键作用因子，共同调控各个组织的生长与发育，从而促进动物机体的生长[27]。IGFBP4基因在牛卵泡发育过程中的表达量随发育阶段而增加，在卵母细胞中达峰值[28]；IGFBP5基因在藏猪脾、军牧猪肾中的表达量随年龄增加而增加，于180日龄达峰值[29]。以上结果表明，IGFBP4和IGFBP5基因的表达量呈时间表达规律，即随年龄的增加而增加，与本试验结果一致，qRT-PCR、Western blot和免疫组化结果显示，IGFBP4和IGFBP5的mRNA和蛋白水平在牦牛肝组织不同生长阶段的表达随时间变化表现为上升趋势，在5岁龄时达到表达峰值，以协同方式共同调控牦牛各脏器的生长发育，这表明牦牛在成年期时其生长发育达到最佳状态。
IGFBPs基因在组织中的表达存在一定的内在关系，可以分析各基因在不同组织的表达对动物体生长发育的影响。肝组织作为IGFBPs蛋白分泌的主要器官，在mRNA水平的表达上表现为正向相关，正向协同调控各基因的表达与分泌，共同协同调控肝的生长发育[8]。IGFBP4和IGFBP5基因协同调控绵羊心、肝等组织的生长发育[8]与虹鳟鱼卵母细胞的成熟[30]。以上研究表明IGFBP4和IGFBP5基因以协同方式共同调控组织生长发育，与本试验结果一致，qRT-PCR、Western blot和免疫组化结果显示IGFBP4和IGFBP5的mRNA和蛋白水平在牦牛不同生长阶段的肝组织中共同正向协同表达，即IGFBP4和IGFBP5之间可能正向调控肝组织的生长与发育。这表明IGFBP4和IGFBP5在肝组织的不同生长阶段相互协同调控mRNA与蛋白的表达。
4 结论综上所述，本研究获得了麦洼牦牛IGFBP4和IGFBP5基因的cDNA序列，并从mRNA和蛋白水平探讨了IGFBP4和IGFBP5在麦洼牦牛不同生长阶段肝中的表达规律。IGFBP4和IGFBP5在麦洼牦牛肝中的表达量与其年龄增长呈正相关，即5岁龄>15月龄>1日龄，结果提示，IGFBP4和IGFBP5可能协同调控牦牛肝的生长发育，这为深入研究IGFBP4和IGFBP5对牦牛的生长发育，尤其是肝组织的发育机制提供了试验依据。
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