砷(As)是一种普遍存在于各种环境介质中的有毒类金属[1]。环境中过量的砷会对生物体产生毒副作用，慢性砷中毒已成为世界性的公共卫生问题，我国是受砷中毒影响较重的国家[2]。
辽宁绒山羊作为我国优秀的绒山羊品种，原产于辽宁省东南部山区，以其绒毛品质优和产绒量高而享誉世界，是我国严禁出境的珍贵品种资源之一，目前主要分布在瓦房店市、庄河市、辽阳市以及盖州市等地[3-5]。近年来，畜牧养殖业中为了促进畜禽生长、预防疾病而使用的含砷饲料添加剂，以及工业中与农业生产中木材防腐剂、杀虫剂中也往往含有砷化合物，这些含砷化合物的使用会使砷在环境中富集，饮水摄入是其主要途径，会在含有较多角蛋白的表面皮肤和毛发中发生蓄积，致使绒山羊皮肤异常[6-8]。皮肤被认为是对砷毒性最敏感的器官之一[9]。
进入动物体内的砷主要在肝组织发生甲基化反应，其中二甲基砷酸是哺乳动物代谢砷的一种主要代谢产物，微量的二甲基砷酸可由皮肤组织排出[10]。无机砷甲基化是砷在动物体内的主要代谢方式, 被公认为砷元素的解毒过程[11]。在过去的几年里，研究者一直认为无机砷在体内甲基化代谢产生的有机砷是不具有毒性作用的，直到2000年，研究者们发现，无机砷在动物体内发生甲基化之后，毒性发生了改变，这一发现证明了甲基化过程并不是完全解毒的，一甲基亚砷酸、二甲基亚砷酸等三价甲基化形式的砷对细胞有毒性作用，同时，在致癌过程中砷的甲基化代谢产物起着重要的作用[12-14]。
目前，对于二甲基砷酸毒性的研究主要集中在细胞水平和分子水平，Sakurai等[15-16]以人皮肤成纤维细胞TIG-112和猿皮肤成纤维细胞CRL-1609作为研究对象，得出二甲基砷酸对TIG-112和CRL-1609细胞等哺乳动物细胞具有明显的细胞毒性。Fujioka等[17]研究发现，二甲基砷酸能够增加小鼠雄性后代中肺腺癌10.0%发生率，并且与雄性对照后代相比，同时还增加了雄性后代肝细胞癌的发生。细胞DNA是外界环境毒物主要作用靶点，DNA一旦受到损伤，且在复制前没有得到正确的修复，受到损伤的DNA进入复制过程就会导致一系列不良结果，甚至最终可能会导致细胞的死亡。有研究表明，二甲基砷酸能引起人肺泡L-132细胞、小鼠和兔子的肺和肝、人纤维原细胞等不同类型细胞发生DNA单链断裂和DNA交联，损伤细胞DNA，具有基因毒性[18-21]。同时，高浓度的二甲基砷酸能够诱导人肾癌细胞HL-60、正常小鼠肝细胞TRLl215和人白血病HL-60等细胞产生凋亡[22-23]。细胞凋亡涉及多种机制，研究表明，砷可以通过降低线粒体膜电位来诱导细胞凋亡[24-25]。Kumar等[26]研究得出，砷通过氧化应激影响线粒体膜电位变化，从而导致细胞凋亡。Perker等[27]研究发现，溶酶体(lysosome)数量和通透性变化存在于早期的凋亡级联反应, 进而引起凋亡反应。本研究以辽宁绒山羊为研究对象，通过砷对绒山羊皮肤成纤维细胞的染毒试验，初步筛选细胞毒性阈值，检测细胞骨架形态的变化，进一步探究二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞的毒性作用，结合流式细胞仪、免疫荧光检测等方法检测凋亡细胞的细胞器及其膜电位的变化，深入探究其诱导细胞凋亡的机制，为后续研究砷对辽宁绒山羊皮肤细胞损伤以及对绒山羊皮肤细胞生长的影响提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物试验用羊购自辽宁省大连市金石滩永盛绒山羊养殖场，10月份随机选取1只7月龄各项机能正常，体重为25 kg左右的雄性辽宁新品系绒山羊。
1.2 绒山羊皮肤成纤维细胞的分离与培养绒山羊腹部除去表面毛发，剪取绒山羊皮肤，用无菌PBS冲洗，将组织剪成1 mm3体积的碎块，加入2倍体积混合酶液，37 ℃消化30~45 min，离心后，加适量完全培养基(Hyclone，美国)。所有细胞在37 ℃，5% CO2条件下培养。
1.3 MTT检测绒山羊皮肤成纤维细胞的增殖活性待细胞80%黏连，根据细胞量进行细胞扩培，扩培后将细胞分置于96孔板；根据不同浓度分组(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1、5、10、25、50、100 mmol·L-1) 的二甲基砷酸(Sigma，美国)对绒山羊皮肤成纤维细胞给药处理，于24、48、72、96 h进行MTT(Sigma，美国)检测；进行MTT检测时每孔加入10 μL的MTT，避光条件下培养3~4 h后；每孔吸去培养液，加入150 μL DMSO(Invitrogen，美国)，于摇床上混匀10 min；经酶标仪(Thermo)492 nm检测。
1.4 免疫荧光检测绒山羊皮肤成纤维细胞骨架和形态的变化将扩培后的细胞分于6孔板；将不同浓度二甲基砷酸给药处理后于24 h进行免疫荧光检测；PBS漂洗，4%多聚甲醛固定10 min。内源过氧化物酶灭活；将切片浸入抗原修复液(柠檬酸三钠缓冲液)中，96 ℃ 5 min。10%FBS封闭15 min。加入微管蛋白(Abcam，美国) 和鬼笔环肽抗体(Actin-Trakcer Green，中国)，4 ℃孵育过夜后洗片。微丝荧光探针(碧云天C1033)和CY3标记二抗，37 ℃孵育30 min。PBS漂洗封片，荧光显微镜下观察。
1.5 彗星试验检测绒山羊皮肤成纤维细胞的DNA损伤情况将已预热56 ℃的80 μL 0.5%正常熔点琼脂糖NMA滴到载玻片上，盖上盖玻片，4 ℃放置10 min凝固。取10 μL含1 000个细胞的PBS和75 μL 0.5%低熔点琼脂糖LMA在37 ℃混匀，进行第二层胶和第三层胶的制备。然后进行细胞裂解。取出载玻片，PBS冲洗后碱解旋20 min。在25 V、300 mA条件下电泳20 min。用Tris-HCl(pH7.5)中和15 min。50 μL 30 μg·mL-1的溴化乙锭(Sigma, 美国)避光染色20 min，即可观察，数据通过彗星分析软件CASP分析得到。
1.6 流式细胞仪检测绒山羊皮肤成纤维细胞的凋亡将绒山羊皮肤细胞接种至6孔板中，每孔加入1 mL培养液。细胞经胰酶消化后，收集细胞悬液，用PBS调整细胞浓度，75%冰乙醇固定细胞1~2 h，取200 μL细胞悬液与10 μL PI混匀，孵育45 min，冷PBS溶液洗涤细胞，流式上机检测，CELL Quest软件分析细胞散点图，根据各象限细胞数计算凋亡细胞比例。
1.7 透射电镜观察绒山羊皮肤成纤维细胞的细胞质和细胞器变化收集培养的细胞，1 000 r·min-1离心2~3 min，加2.5%戊二醛进行固定，乙醇梯度脱水(30%、50%、70%、80%、90%、95%)，每次15 min；无水乙醇处理20 min；纯丙酮处理20 min；包埋剂与丙酮1∶1混合液处理1 h；包埋剂与丙酮3∶1处理样品3 h；纯包埋剂处理样品过夜，进行超薄切片，醋酸铀(Spi-Chem，美国)、柠檬酸(Spi-Chem，美国)铅染液中染色15 min；1%氢氧化钠洗1次，水洗2次，干燥后进行电镜观察。
1.8 二甲砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞线粒体膜电位(ΔΨm)的影响将绒山羊皮肤细胞铺板于24孔板中，密度为5×104个·mL-1，使用不同浓度的二甲基砷酸处理24 h后；取出细胞培养液，加入37 ℃预温育的Mito-Tracker Green染色工作液，与细胞共孵育30 min；去除Mito-Tracker Green染色工作液，加入37 ℃预温育的新鲜细胞培养液；用荧光显微镜观察拍照，图像软件分析。
1.9 二甲基砷酸对溶酶体的影响绒山羊皮肤细胞铺板于24孔板中，密度为5×104个·mL-1，使用不同浓度的二甲基砷酸处理24 h后；去除细胞培养液，加入37 ℃温育的Lyso-Tracker Red染色工作液，与细胞37 ℃共孵育30~120 min；去除Lyso-Tracker Red染色工作液，加入新鲜的细胞培养液；每组随机选取50个细胞测量其荧光强度，随后用共聚焦显微镜观察拍照。
1.10 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，数据均用“ x±s”表示，采用单因素方差分析，差异显著表示为P < 0.05，差异极显著表示为P < 0.01。半抑制浓度(IC50)值采用curve 1.4拟合软件进行估算得出。
2 结果 2.1 二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞增殖的影响不同浓度组(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1、5、10、25、50、100 mmol·L-1)的二甲基砷酸染毒绒山羊皮肤成纤维细胞24、48、72、96 h后，经MTT法检测，结果见表 1。通过不同时段的比较，发现24 h时不同浓度的OD值均能明显地反映出二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞的增殖和抑制趋势，存在一定的剂量-效应关系，而48、72、96 h时增殖作用逐渐减弱甚至消失，因此选取24 h作为时间样点进行后续试验。24 h时，相比对照组，二甲基砷酸浓度为0.8 mmol·L-1时对绒山羊皮肤成纤维细胞有明显的促进增殖作用；浓度在0.8~1 mmol·L-1时，增殖效果减弱；当浓度大于1 mmol·L-1时对皮肤成纤维细胞产生显著的毒性作用(P < 0.01)。根据MTT试验检测结果，选择24 h条件下的4个浓度组进行后续试验，分别为对照组(未做任何处理)、促进浓度组(0.8 mmol·L-1)、临界浓度组(1 mmol·L-1)、IC50浓度组(38.68 mmol·L-1)。
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表 1 二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞处理OD值的测定结果 Table 1 The result of OD value in the skin fibroblasts of Liaoning cashmere goat by dimethyl arsenic acid |
用不同试验组即对照组(未做任何处理)、促进浓度组(0.8 mmol·L-1)、临界浓度组(1 mmol·L-1)、IC50浓度组(38.68 mmol·L-1)的二甲基砷酸处理绒山羊皮肤成纤维细胞后进行免疫荧光检测，结果见图 1。
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染核(蓝色)、微丝(绿色)、微管(红色) Staining nucleus(blue), microfilament (green), microtubules (red) 图 1 二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞骨架的影响(400×) Fig. 1 The effects of dimethyl arsenic acid on skin fibroblast cytoskeleton of cashmere goats(400×) |
与对照组相比，促进浓度组细胞骨架形态完整，核周红色荧光密集排列，促进微管蛋白聚合；临界浓度组的细胞骨架形态发生改变，微丝收缩明显，核周红色荧光分散排列；IC50浓度组的细胞骨架形态差异很大，微丝收缩明显，核周红色荧光分散排列明显，抑制微管蛋白聚合。
2.3 二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞DNA的影响为了避免凋亡或坏死所造成的SCGE试验呈现假阳性，采用台盼蓝染色法观察4个浓度组细胞DNA的损伤，结果见图 2和表 2。
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图 2 二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞DNA的损伤 Fig. 2 DNA damage of cashmere goat skin fibroblasts by dimethyl arsenic acid |
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表 2 二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞DNA的影响 Table 2 Effect of dimethyl arsenic acid on DNA of cashmere goat skin fibroblasts |
在荧光显微镜(200×)下观察，细胞DNA呈橘红色，对照组细胞DNA只有一个完整的头部，二甲基砷酸促进浓度组和临界浓度组均未出现拖尾现象，IC50浓度组出现彗星尾，最多且最明显，同时发生Ⅰ、Ⅱ级DNA链断裂，与对照组相比，其差异具有统计学意义(P < 0.01)。因此可以说明，高浓度二甲基砷酸可以引起绒山羊皮肤成纤维细胞DNA链断裂，从而引起DNA损伤。
2.4 二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞凋亡的影响根据流式细胞仪获取的4个浓度组细胞散点图分析，左上象限为死细胞，左下象限为活细胞，右上象限为晚期凋亡细胞，右下象限为早期凋亡细胞(图 3)。
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图 3 二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞凋亡率的影响 Fig. 3 The effect of dimethyl arsenic acid on apoptosis rate of skin fibroblasts of Liaoning cashmere goat |
结果经统计学分析，对照组、促进浓度组、临界浓度组、IC50浓度组的早期凋亡率分别为4.19%、3.41%、6.69%、14.90%；晚期凋亡率分别为0.422%、0.413%、0.848%、2.790%，总的凋亡率分别为4.612%、3.823%、7.538%、17.690%。由此可以得出，细胞的凋亡主要以早期凋亡为主，相比对照组，促进浓度组凋亡细胞数减少，随二甲基砷酸浓度的增加，临界浓度组和IC50浓度组的凋亡率明显上升。
2.5 二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞线粒体形态及膜电位的影响用4个浓度组的二甲基砷酸处理绒山羊皮肤成纤维细胞后，进行透射电镜观察和免疫荧光检测试验，结果见图 4和图 5。
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图 4 二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞的细胞质和细胞器形态的影响 Fig. 4 The effect of dimethyl arsenic acid on cytoplasm and organelle morphology of skin fibroblasts of Liaoning cashmere goats |
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图 5 二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞线粒体的影响 Fig. 5 The effect of dimethyl arsenic acid on mitochondria in the skin fibroblasts of Liaoning cashmere goats |
相比对照组，促进浓度组的线粒体数目增多，膜结构清晰，嵴致密，形态完整；临界浓度组线粒体数目减少，形态不规则，膜部分破裂，线粒体肿胀，嵴断裂溶解；IC50浓度组线粒体数目明显降低，形态不完整，线粒体呈现不清晰或无的状态。
通过测定细胞内荧光染料Mito-Tracker Green的染色强度，分析不同浓度组二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞线粒体跨膜电位的影响，结果见图 6。与对照组相比，促进浓度组膜电位升高，临界浓度组膜电位降低，变化不明显，IC50浓度组膜电位明显降低，差异具有统计学意义(P < 0.01)。
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图 6 二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞线粒体膜电位的影响 Fig. 6 The effect of dimethyl arsenic acid on mitochondrial transmembrane potential of skin fibroblasts of Liaoning cashmere goats |
用荧光显微镜观察与统计4个浓度组二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞溶酶体的影响，结果见图 7和表 3。
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蓝色是细胞核，红色是溶酶体 Blue is the nucleus, red is the lysosome 图 7 二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞溶酶体的影响 Fig. 7 The effects of dimethyl arsenic acid on lysosomes in Liaoning cashmere goat skin fibroblasts |
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表 3 二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞溶酶体的影响 Table 3 The effects of dimethyl arsenic acid on lysosomes of Liaoning cashmere goat skin fibroblasts |
与对照组相比，促进浓度组溶酶体数目增多，临界浓度组的溶酶体数目减少，IC50浓度组溶酶体数目明显降低，差异具有统计学意义(P < 0.01)。
3 讨论砷是自然界中一种常见的环境污染物，被认为是有毒的，主要通过饮用水和饮食进入动物体内，从而对动物机体造成威胁[28]。本研究探讨了二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞的毒性作用和其诱导细胞凋亡的机制。首先。MTT法检测了不同浓度(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1、5、10、25、50、100 mmol·L-1) 二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞的毒性作用，结果表明，在24 h时，0.1~1 mmol·L-1浓度的二甲基砷酸能促进绒山羊皮肤成纤维细胞增殖；浓度大于1 mmol·L-1的二甲基砷酸则会引起较强的细胞毒性，且随着浓度的增加，IC50浓度组细胞毒性明显(P < 0.01)。因此，可以说明在短时间内五价有机砷对绒山羊皮肤成纤维细胞增殖具有双向调节作用，且随着浓度增加和时间的延长，这种作用会逐渐消失，仅对细胞生长产生抑制作用，具有剂量-效应和时间-效应关系，这一结果与Vega等[29]的研究结果一致。
然而二甲基砷酸对不同类型细胞毒性作用阈值存在很大差异，Sakurai等[15]研究发现，10 mmol·L-1的二甲基砷酸会对TRL 1215细胞产生很强的毒性作用。尹仕伟等[30]研究得出，10 μmol·L-1的二甲基砷酸对人胚肺成纤维细胞生长产生明显抑制作用。通过本研究与Sakurai等[15]、尹仕伟等[30]的研究结果比较得出，二甲基砷酸对不同类型细胞产生毒性的浓度有所不同，这是由于绒山羊皮肤成纤维细胞、TRL 1215细胞、人胚肺成纤维细胞3种类型的细胞对砷的吸收不同，积累不同，从而对细胞产生的毒性作用不同[31]。同时，不同的砷化合物毒性也存在很大差别。通过本研究与本课题组已有的亚砷酸钠对辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞的研究比较得出亚砷酸钠的毒性强于二甲基砷酸的毒性。究其原因，一方面，与有机砷相比，无机三价砷对皮肤中的巯基蛋白具有高度的亲和力, 无机三价砷与巯基蛋白的结合是其毒性的重要机制[32-33]；另一方面，无机砷在体内甲基化生成的有机砷存在解毒作用。
细胞骨架由微管、微丝、中间纤维3个主要部分构成，这种结构处于动态变化中。微管为细长中空而直的细管，长度不一，可达数微米，中心是电子不透明的空腔。微丝又称肌动蛋白丝，这种直径为7 nm的纤维存在于所有的真核细胞中，由球形肌动蛋白和肌球蛋白聚合而成的细丝彼此缠绕成双螺旋丝，它们分别由相应的的蛋白质亚基组装而成，并赋予细胞不同的形态和功能。中间丝又称为中间纤维，一种直径为10 nm左右的细长管状结构。细胞骨架在维持细胞形态、运动、物质运输等方面具有重要的作用。本研究中，用微管蛋白和鬼笔环肽标记一抗，用微丝荧光探针(C1033)和CY3标记二抗，应用免疫荧光技术成功观察得到二甲基砷酸处理后辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞骨架的变化。
细胞DNA是外界环境毒物主要作用的靶点。彗星试验可以检测DNA双链断裂、单链断裂、碱不稳定位点等多种类型的DNA损伤[34-35]。Mishra和Flora[36]的研究表明，慢性砷暴露于淋巴细胞会使DNA单链发生断裂，造成DNA损伤。Yin等[37]研究表明，砷可以直接导致双链DNA损伤，并间接降低JB6细胞中DNA修复能力，从而增强UVB引起的DNA损伤。Zhang等[38]研究发现，砷会诱导DNA损伤并抑制NER相关基因的表达。Yih等[39]研究发现，砷能使DNA损伤, 通过抑制G2周期检测点的活性导致CGL-2细胞凋亡，Mourón等[40]的研究得出，0.5 mmol·L-1二甲基砷酸会引起人肺成纤维细胞DNA-蛋白质交联，从而引起损伤。本研究结果发现，高浓度二甲基砷酸能引起绒山羊皮肤成纤维细胞DNA链断裂，从而导致DNA损伤，具有基因毒性。从研究结果可以看出，二甲基砷酸对不同细胞的敏感性不同，导致对其DNA损伤程度不同。
细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体生长发育、维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动的程序化死亡过程，包括外源性通路和内源性通路两种。内源性通路的特征是线粒体功能发生变化，线粒体不仅是为细胞提供能量的细胞器，而且在细胞凋亡过程中发挥了极其重要的作用。一般认为，在高强度的细胞应激状态下，细胞内的溶酶体膜通透程度较高，则可导致溶酶体内容物的大量释放，引起快速的细胞凋亡。线粒体膜电位降低是细胞凋亡的特异性标志，膜电位一旦受到损伤，最终就会导致细胞的凋亡[41-42]。
Kumar等[26]的研究得出，砷通过诱导人白血病细胞DNA损伤和线粒体膜电位改变引起细胞凋亡。本研究得出，二甲基砷酸引起的绒山羊皮肤成纤维细胞凋亡与DNA损伤、线粒体膜电位之间存在相关性。促进浓度组山羊皮肤成纤维细胞线粒体膜电位升高，凋亡细胞数减少，随着二甲基砷酸浓度的增加，IC50浓度组细胞的DNA与细胞器损伤加重、线粒体膜电位降低，凋亡率升高。除此之外，Pan等[43]研究得出，砷通过激活线粒体-溶酶体通路诱导胰腺细胞凋亡。本研究得出，IC50浓度组山羊皮肤成纤维细胞的线粒体膜电位降低，溶酶体膜完整性降低，含量减少，凋亡率升高。因此可以说明，二甲基砷酸通过线粒体和溶酶体途径诱导细胞凋亡。
4 结论本研究探索了二甲基砷酸对辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞的毒性作用以及诱导细胞凋亡的机制，研究结果表明，一定浓度的二甲基砷酸对辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞具有毒性作用，并具有进一步诱导细胞凋亡作用，为后续砷导致绒山羊皮肤细胞损伤及环境因素对绒山羊皮肤细胞生长影响的研究提供重要信息。
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