2. 南京农业大学淮安研究院, 淮安 223001;
3. 淮安市淮阴新淮种猪场, 淮安 223322;
4. 江苏现代农业(生猪)产业技术体系集成创新中心, 南京 210095;
5. 淮安沐林新农村发展研究有限公司, 淮安 223001
2. Huai'an Academy, Nanjing Agricultural University, Huai'an 223001, China;
3. Huaiyin Xinhuai Pig Breeding Farm of Huai'an City, Huai'an 223322, China;
4. Industrial Technology System Integration Innovation Center of Jiangsu Modern Agriculture (PIG), Nanjing 210095, China;
5. Mulin New Rural Research and Development Corporation of Huai'an City, Huai'an 223001, China
耐粗饲简单来讲是猪对粗纤维含量高、可消化能和营养水平低的日粮耐受,且不影响日增重和饲料转化率的能力。用化学成分来评价耐粗饲具有明显优势,纤维消化率指标则是最佳的单一评价因子。最初,国内外主要使用“粗纤维”评定猪的日粮纤维消化率水平,但由于粗纤维的测定方法不能准确反映日粮中纤维的含量,因此,目前研究人员主要用中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)表观消化率作为评定饲料中纤维类物质消化指标[1]。
苏淮猪含有25%淮猪血统和75%大白猪血统,保留了其父本生长快、瘦肉率高的特性及母本的耐粗饲性能。本课题组前期已经对苏淮猪的耐粗饲性能进行了初步的研究,其中,张叶秋等[2]和郝帅帅等[3]在日粮中使用添加34.8%的米糠替代部分玉米(粗纤维含量7.5%)对苏淮猪进行75 d饲喂试验,发现苏淮猪采食量显著下降,但其试验末期体重、试验期日增重和料肉比无显著变化,表明苏淮猪具有耐受高纤维日粮的特性。蒲广等[4]分别采用基础日粮和7%、14%、21%、28%脱脂米糠替代玉米的日粮对体重在(62.90±0.78)kg的苏淮育肥猪进行28 d饲喂试验,发现对苏淮猪的生长性能没有显著影响,且随着日粮脱脂米糠等量替代玉米水平的升高,NDF表观消化率不受显著影响,进一步验证了苏淮猪的耐粗饲性能。
虽然前期已对苏淮猪的耐粗饲特性进行了研究,但目前还未鉴定到与苏淮猪耐粗饲相关的宿主基因。推测苏淮猪群体耐粗饲性状在长期人工选择过程中,染色体区段上控制目标性状基因的优势等位基因频率应逐渐增加,多态性发生了改变。因此,本研究拟通过使用选择信号分析方法来鉴定与苏淮猪耐粗饲相关的宿主基因。选择信号分析方法根据其分析原理可以分为以下3种类型:1)基于等位基因频率谱的方法,代表的计算方法包括Tajima's D[5]和CLR(composite likelihood ratio)[6]等;2)基于连锁不平衡的方法,主要包括EHH(extended haplotype homozygosity)[7]和nSL(number of segregating sites by length)[8]等;3)基于群体间遗传分化的方法,主要包括Fst方法[9]等。目前,应用较为广泛的选择信号检测方法包括Fst和nSL分析方法。目前,利用选择信号分析来揭示造成表型差异的遗传机制的相关研究已广泛开展。例如,张威[10]利用Fst检测技术,在皖南黑猪中找到与耐粗饲、抗病性、高繁殖力特征相关的基因;Eichstaedt等[11]使用nSL的研究方法,发现了高原人对低压缺氧的生理适应相关的GPR126和EPAS1基因;Vatsiou等[12]通过研究发现,将nSL与其他选择信号方法结合起来进行分析,提高了找到受选择区域的能力。因此,对于受到强烈选择的个体基因组,基于nSL分析方法[8]可挖掘高纤维表观消化率苏淮猪群体的基因组受选择区域。针对未受到强烈选择的个体基因组结构与受到选择的个体基因组结构存在显著的差异,基于Fst分析方法[9]探究高、低纤维表观消化率苏淮猪群体的基因组差异。通过nSL和Fst方法可以初步鉴定与苏淮猪耐粗饲性能相关的基因,对揭示苏淮猪耐粗饲的遗传机制具有重要意义。
本研究利用高、低NDF表观消化率苏淮猪的全基因组SNP芯片数据,基于Fst和nSL分析方法,检测其基因组上的选择信号,运用功能注释与富集分析筛选受到选择的且与苏淮猪耐粗饲性状相关的候选基因;通过关联分析鉴定与苏淮猪NDF表观消化率显著关联的SNP位点;旨在为苏淮猪耐粗饲选育及品种改良提供重要参考。
1 材料与方法 1.1 试验动物试验采样在江苏省淮安市淮阴种猪场进行,选取331头160日龄相同饲养管理条件下健康的苏淮猪(含25%淮猪和75%大白猪血统的国家级新品种)个体为研究对象(其中包括295头母猪和36头公猪)。在试验期间,所有猪限饲,每天08:00和15:00对猪进行饲喂,自由饮水。采集苏淮猪的粪便和耳组织样品,粪便样品用于NDF表观消化率的测定,耳组织样品用于个体基因组DNA的提取。本研究所涉及到的试验均严格按照南京农业大学实验动物福利与伦理委员会制定的规章制度执行(许可证书编号:SYXK(苏)2017-0007)。160日龄苏淮猪的日粮成分见表 1。
1.2.1 NDF表观消化率的测定 按每200 g粪样加15 mL的10%硫酸均匀混合于自封袋中,并且排尽空气,保存在-20 ℃冰箱待测。其中,NDF含量采用ANKOM A200i半自动纤维分析仪(Ankom,USA)测定[4],NDF表观消化率的计算方法参考Niu等[13]和Pu等[14]研究中的公式。
1.2.2 根据NDFEBV挑选试验群体 使用DMU软件计算331头苏淮猪NDF表观消化率的EBV[15],具体模型:Y=μ+H+y+B+A+e,式中,Y代表NDF表观消化率表型的观测值;μ代表群体均值;H代表栏舍的固定效应;y代表年份的固定效应;B代表苏淮猪的采样批次,由于批次数量较多,作为协变量;A为个体的加性遗传效应;e为随机残差效应。由于试验群体中绝大部分个体为母猪,且通过回归分析发现,性别对NDF表观消化率没有显著影响,故在模型中没有考虑性别因素。
根据NDFEBV将331头苏淮猪按照从大到小进行排序,挑选高(n=33)、低(n=33)各10%的苏淮猪用于后续的芯片分型和选择信号分析。
1.2.3 高、低NDF表观消化率苏淮猪基因型检测 利用组织基因组提取试剂盒(天根)提取耳组织样品基因组DNA,DNA质检合格后,使用基于Illumina平台的Geneseek公司开发的GGP 80K SNP芯片进行检测,获得SNP分型数据。原始基因型数据以ped和map文件存储。考虑到原始基因型数据等位基因频率偏低可能影响后续的分析结果,因此,利用PLINK软件对SNP进行质量控制[16]。质控标准:平均检出率大于0.9,平均最小等位基因频率大于0.01,个体检出率大于0.9。
1.2.4 基因型数据填充 由于nSL分析需要全部分型成功的SNP基因型,本研究将芯片数据质控后没有分型成功的SNP位点进行填充,利用Beagle软件对有缺失的基因型数据进行填充和单倍型推断[17]。
1.2.5 高、低NDF表观消化率苏淮猪群体间Fst选择信号检测 按照Weir和Cockerham[18]的统计方法进行高、低NDF表观消化率苏淮猪群体间Fst值的计算,利用Vcftools软件计算每个位点的Fst值[19]。利用R包qqman展示全基因组水平上Fst值的分布[20]。选择Fst值top 1%作为阈值线[21],高于阈值线的SNP位点定义为受选择位点。Fst的计算公式参考Weir和Cockerham[18]的报道。
1.2.6 高NDF表观消化率苏淮猪群体内nSL选择信号分析 nSL选择信号的计算使用Selscan软件[22]进行,将高NDF表观消化率的苏淮猪群体作为试验群体。基于nSL选择信号得到的统计量近似符合正态分布[8],因此, 对计算得到的原始nSL值,利用norm参数进行标准化正态分布处理。将标准正态化处理后的nSL取绝对值,同时从大到小排序,取top 1%作为阈值线[21],高于阈值线的SNP位点定义为受选择位点。nSL的计算原理参考Ferrer-Admetlla等[8]的报道。
1.2.7 苏淮猪显著选择信号候选区域功能注释 分别将高、低NDF表观消化率苏淮猪群体间Fst分析和高NDF表观消化率苏淮猪群体nSL分析中鉴别的距离小于250 kb的受选择位点合并成一个显著选择信号区域,以此类推[23]。对选择信号区域内的基因进行基因注释,使用猪11.1版本参考基因组(Sscrofa 11.1),注释网站为Ensembl官网(http://www.ensembl.org)。除了对猪相关基因注释数据库分析外,将找到的候选基因通过Ensembl网站的Biomart数据库同人基因组进行同源比对,获得人方面相对应的直系同源基因集,并结合Genecards数据库[24]和NCBI中的PubMed数据库来挖掘基因功能注释信息。通过KOBAS 3.0数据库(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/)对受选择区域内的基因进行GO和KEGG功能富集分析[25],分析内容涵盖了细胞组分(cellular component)、分子功能(molecular function)、生物学过程(biological process)以及生物学通路(pathway)分析。
1.2.8 苏淮猪全群NDF表观消化率与基因型的关联性分析 挑选Fst和nSL两种分析中受到选择的共有SNP位点,通过一代测序进行全群分型。利用SAS 9.4软件将共有SNP位点基因型与NDF表观消化率进行关联性分析,具体模型:Yijkm= μ+Gi+Hj+yk+Bm+a+eijkm,式中,Yijkm为猪的NDF表观消化率;μ为均值;Gi为猪的基因型固定效应;Hj为栏舍的固定效应;yk为年份的固定效应;Bm代表苏淮猪的采样批次,由于批次数量较多,作为协变量;a为去除SNP效应的个体育种值;eijkm为随机残差效应。以P < 0.05表示差异达到显著水平,以P < 0.01表示差异达到极显著水平。由于试验群体中绝大部分个体为母猪,且通过回归分析发现,性别对NDF表观消化率没有显著影响,因此在模型中没有考虑性别因素,所得结果均以NDF表观消化率的“平均数±标准误”表示。
2 结果 2.1 苏淮猪品种内纤维表观消化率的变异分析由表 2可知,苏淮猪高、低NDF表观消化率组在NDF表观消化率表型上存在极显著差异(P < 0.01)。
通过对高、低NDF表观消化率苏淮猪群体芯片分型数据进行质控,共有51 367个有效SNPs位点用于后续分析。通过Fst分析高、低NDF表观消化率苏淮猪群体间差异的基因组片段,共鉴别到514个受选择位点,主要分布在1、2、4、5、9、10、11、15号染色体上,其中2号染色体上的受选择位点分布最多(图 1)。通过合并同一染色体上距离小于250 kb的受选择位点为一个显著选择信号区域,共发现79个显著选择信号区域。
通过nSL方法分析高NDF表观消化率苏淮猪受到选择的基因组片段,主要计算每个核心SNP的检验统计量,并取其绝对值,包含有47 972个nSL统计量,共鉴别到480个受选择位点,主要分布在1、2、3、4、5、6、7、10、12、14号染色体上,其中7号染色体上的受选择位点分布最多(图 2)。通过合并同一染色体上距离小于250 kb的受选择位点为一个显著选择信号区域,共发现76个显著选择信号区域。
通过使用Fst和nSL分析方法,共鉴定到146个受选择信号区域(其中两种分析方法部分受选择信号区域发生重叠)。利用Ensembl数据库的BioMart模块注释Fst和nSL分析方法分别获得的选择信号区域富集的基因,并与人类基因组进行直系同源比对,共获得361个人类直系同源基因。富集分析结果发现,部分条目的生物学功能与猪的肠道细胞增殖和肠道免疫功能相关。例如,有8个基因被富集到“MAPK信号通路”,而“MAPK信号通路”是已发现的与结肠健康有关的通路,而结肠是消化纤维的关键部位(表 3)。
选择信号区域内基因功能注释发现,多个基因与肠道发育、健康、细胞增殖等生物学功能相关,包括MTHFD1L、PHLPP1、TRPM6、MCC、NEDD9、UVRAG、KLF5等基因,这些基因可能影响肠道纤维消化(表 4)。
在Fst、nSL两种分析鉴别的受选择位点中,有8个相同的位点,分别位于1、2、6、8和12号染色体(表 5)。通过苏淮猪全群NDF表观消化率与8个SNPs位点关联分析发现(表 5),rs81363074、rs327393763和rs81404927位点与苏淮猪群体NDF表观消化率存在显著关联(P < 0.05),rs81347101和rs318870857位点与苏淮猪群体NDF表观消化率存在极显著关联(P < 0.01)。其中,对于rs81347101位点而言,GG基因型个体的NDF表观消化率极显著高于AA基因型个体(P < 0.01),AG基因型个体的NDF表观消化率显著高于AA型个体(P < 0.05)。而rs80917848、rs81432855和rs81270042位点与NDF表观消化率不存在显著关联(P>0.05)。
已有大量文献报道不同猪种利用纤维的能力有差异,例如中国的地方猪种[33-34]被发现与现代高度商业化的瘦肉型猪种相比均表现出更强的粗纤维消化能力。过去中国地方品种猪主要采用放牧形式或以青粗饲料为主、添加精料为辅的低营养水平的日粮作为饲料,因此,普遍具有耐粗饲特性。霍贵成[35]报道指出,以稻壳和米糠作为日粮主要纤维源,随着日粮中NDF含量的提高,胃肠道形态上发生明显的适应性变化,即消化道长度增加,尤其结肠长度增加明显;付金剑等[36]研究发现,14%麸皮替代日粮水平可抑制二花脸猪结肠细胞的凋亡,维持肠道健康。这些都说明了中国地方猪的耐粗饲特性,但是,关于中国地方猪耐粗饲能力的遗传机制尚不清楚。因此,本试验以苏淮猪为研究对象,探索猪耐粗饲能力的相关遗传机制。
苏淮猪含有耐粗饲性能强的淮猪的25%血统,在培育过程中对耐粗饲性能进行了持续的人工选择,因此,苏淮猪具有耐粗饲特性。前期,本课题组张叶秋等[2-4]先后通过苏淮猪的饲喂试验和相关生长指标的测定证明了苏淮猪具有较好的纤维表观消化率及耐粗饲特性,有利于苏淮猪对纤维的分解与利用。但目前其受选择的与高纤维表观消化率相关的基因或与耐粗饲相关的基因未知。本研究采用高、低NDF表观消化率的苏淮猪作为试验群体,通过使用Fst和nSL的方法来探究苏淮猪在基因组水平受到强烈选择的基因片段。
在猪育种早期的时候,根据性状表型值的高低来选择相对应的个体。随着数量遗传学理论的发展,育种学家借助一定的统计方法将性状的表型值进行剖分,并从中估计出可以真实遗传的部分,即育种值,使猪的育种由表型值选择发展为育种值选择,从而提高了选种的准确性和效率。尤其是动物模型BLUP方法的应用,使得育种值的估计可以充分利用不同亲属的信息,在对场、年度及其他环境效应进行估计的同时,预测出个体的育种值,从而科学、准确地进行选种[37-38]。因此,本研究采用EBV来选择试验对象进行后续的研究。通过研究发现,高、低EBV组苏淮猪的NDF表观消化率存在极显著差异,这进一步说明了本研究样品选择的准确性。
3.2 苏淮猪人工选择作用在苏淮猪品种形成的过程中存在持续的人工选择,并且由于选择会在基因组上形成选择性清除区域。通过检测识别选择信号,找到影响苏淮猪持续受选择的优良性状背后的候选基因,如影响耐粗饲及肠道纤维消化能力的候选基因,为相关区域基因的功能研究提供重要参考。
本研究基于猪高密度SNP芯片数据,运用两种选择信号分析方法对苏淮猪进行全基因组检测,研究发现,共有146个基因组区段受到了强烈的正向选择作用,区间内共有361个基因。通过富集分析和基因功能注释分析发现,MTHFD1L、PHLPP1、TRPM6、MCC、NEDD9、UVRAG、KLF5等基因与苏淮猪的肠道发育和肠道健康相关。Agarwal等[26]研究发现,MTHFD1L基因参与了结肠癌的进展,而MTHFD1L的阻断降低了结肠癌细胞的生长,维持了结肠的生理健康;Li等[27]研究发现,PHLPP1基因会抑制肿瘤的进展,可降低结肠癌细胞的运动性并阻止肿瘤的进展;Luongo等[28]研究发现,TRPM6不能被TRPM7替代,并且TRPM6/7复合物和TRPM6/7介导的Mg2+流入在人上皮结肠细胞中是必不可少的,影响结肠细胞的增殖和迁移;Benthani等[29]研究发现,MCC基因是结、直肠肿瘤抑制基因,该基因在大肠癌细胞中通过E-钙黏着蛋白介导的细胞黏附来调节对肿瘤的抑制;Han等[30]研究发现,丁酸钠可通过miR-203/NEDD9级联反应诱导结直肠癌(CRC)细胞凋亡,抑制CRC细胞增殖;Quach等[31]研究发现,UVRAG基因是体内至关重要的自噬调节剂,促进自噬可能有助于治疗易感人群的炎症性肠道疾病和癌症;Nandan等[32]研究发现,成年小鼠结肠组织皮损伤,结肠中的KLF5基因缺失,肠道组织经历了急性生理变化,进一步表明KLF5基因在结肠稳态中的重要性。因为肠道纤维消化能力与肠道(尤其是大肠)的健康与生长发育紧密相关,所以,这些基因可能通过影响猪的大肠健康、稳态和发育,从而间接影响苏淮猪的肠道纤维消化能力。因此,这些基因可以作为影响苏淮猪耐粗饲性状的候选基因进行后续的研究。
本研究发现,Fst与nSL方法检测到的选择信号区域重叠较少,区域内只找到8个共有SNPs位点。其主要原因可能是两种方法分析的原理不同,且对不同类型的选择信号具有不同的检测灵敏度;Fst方法对两个存在显著分化的群体选择信号具有较高的检测效力,而nSL方法则对短期或正在进行选择的群体选择信号具有较高的检测效力。通过在苏淮猪全群内,将苏淮猪的NDF表观消化率与两种分析鉴别的8个共有SNPs位点基因型进行关联分析,来验证影响苏淮猪NDF表观消化率的SNP位点。结果表明,rs81363074、rs327393763、rs81404927、rs81347101和rs318870857位点与苏淮猪群体NDF表观消化率存在显著关联,而这5个位点也可以用于苏淮猪纤维消化率选育提升的分子标记。其中,rs81363074位点位于在MCC基因上,而MCC是影响结直肠道健康的重要候选基因[29],因此推测,MCC基因是影响苏淮猪纤维表观消化率的重要候选基因,可用于后续的研究。rs327393763位点位于LRP8基因附近,该基因与ABGL4、PCSK9基因相互作用,增加心代谢的风险[39];rs81404927位点位于DMP1、DSPP、SPARCL1基因上,DMP1基因在成骨细胞分化中起作用[40],DSPP基因与牙本质发育有关[41],SPARCL1基因在中枢神经系统发育中起着关键作用[42];rs81347101位点位于DHCR24基因上,该基因突变影响胆固醇的产生[43];rs318870857位点位于GLIS1基因上,该基因调控细胞的分化与表达[44]。然而,上述rs327393763、rs81404927、rs81347101和rs318870857位点及其所在基因是如何影响纤维消化的有待后续进一步研究。
4 结论本研究使用Fst与nSL两种互补的检测方法在高、低NDF表观消化率苏淮猪群体中找到146个受选择的基因区域,并依此鉴定到影响苏淮猪NDF表观消化率的受选择候选基因MTHFD1L、PHLPP1、TRPM6、MCC、NEDD9、UVRAG、KLF5。同时还鉴定到rs81363074、rs327393763、rs81404927、rs81347101和rs318870857位点与NDF表观消化率相关联。上述基因和分子标记的发现为未来解析苏淮猪耐粗饲性状的遗传机制提供了重要参考依据。
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