2. 中国农业科学院 兰州兽医研究所 国家重点实验室, 兰州 730046
, SHI Zhengwang2, LUO Juncong2, YANG Bo2, WANG Lijuan2, WAN Ying2, SONG Rui2, CAO Liyan2, ZHOU Gaijing2, TIAN Hong2, ZHENG Haixue2
, CHEN Yixia1
2. State Key Laboratory of Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, China
猪瘟(classical swine fever, CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起的一种急性、热性、高度传染性的猪病毒性疾病[1-2]。世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties, OIE)将其列为须通报疫病，我国将其列为一类动物疫病。CSFV是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员之一，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组大小约12.5 kb[3-4]。CSFV基因组含有一个开放阅读框，编码1个含3 898个氨基酸的多聚蛋白，该多聚蛋白被病毒和宿主细胞蛋白酶加工成12个成熟蛋白，包括4个结构蛋白(C、Erns、E1、E2)和8个非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)[5-7]。E2蛋白是CSFV的囊膜糖蛋白，也是CSFV的主要保护性抗原蛋白，去糖基分子量为42 ku，用E2蛋白免疫猪时，可刺激宿主机体产生中和抗体从而提供针对CSFV的免疫保护[8-9]。
猪瘟是世界范围内流行的猪病毒性疾病，该病的高发病率和高死亡率对猪养殖业造成了巨大的经济损失，尽管有些地区已经根除，但在根除和流行的边界地区及一些野猪群中仍然存在猪瘟的点状散发流行[10]。因此，猪瘟仍是危害全球养猪业的一个重要流行性疾病。在预防猪瘟方面，早期检测对防制该病的暴发至关重要。目前，病毒中和试验(VNTs)、荧光抗体试验(FATs)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、病毒分离、逆转录链式聚合酶反应(RT-PCR)等均是OIE官方推荐的CSFV诊断方法[11-13]，其中，ELISA是CSFV血清学诊断中最为主要的方法，但传统的ELISA操作时间较长，不能满足临床高通量快速检测的要求。
化学发光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay, CLIA)是基于免疫反应原理，结合化学发光检测技术而建立的一种免疫检测技术[14]。与ELISA相比，CLIA具有特异性强、检测线性范围宽、检测效率高、操作简便、反应时间短、可实现高通量和自动化检测等优点[15]，并且灵敏度提高了6个数量级[16]。目前，CLIA作为一种特异性强、灵敏度高、简单快速的检测方法已在医学领域得到广泛应用，但在动物疫病检测方面仍处于发展阶段，应用尚不广泛[17]。
为了实现CSFV抗体的高特异性、高灵敏性的快速检测，本研究以CHO细胞表达的E2蛋白作为包被抗原，山羊抗猪IgG-HRP抗体作为酶标抗体，鲁米诺作为发光底物溶液，成功建立了一种高特异性、高灵敏性、准确快速的CSFV化学发光抗体检测方法，该方法可广泛用于临床血清样品的CSFV抗体检测。
1 材料与方法 1.1 血清样品采自甘肃省康乐县某猪场的92份背景清晰猪血清样品(56份阳性和36份阴性)均经两种商品化ELISA试剂盒检测、1份CSFV抗体阳性对照血清(中和效价为1∶600)、1份CSFV抗体阴性对照血清、1份标准阳性血清(由阳性对照血清1∶20稀释获得)、1份标准阴性血清(由阴性对照血清制备)、A型口蹄疫病毒抗体阳性血清、O型口蹄疫病毒抗体阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性血清、塞内卡病毒抗体阳性血清、非洲猪瘟病毒抗体阳性血清均由中国农业科学院兰州兽医研究所家畜病原学国家重点实验室制备与保存；152份田间猪血清样品采自不同猪场。
1.2 主要试剂与仪器猪瘟病毒抗体检测试剂盒(批号: 99-43200)购自IDEXX公司；猪瘟病毒抗体检测试剂盒购自深圳芬德生物技术有限公司；猪瘟病毒(GenBank ID: AF092448)E2蛋白胞外区由本实验室通过CHO细胞表达制备；96孔化学发光板购自北京博生欣科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自TaKaRa公司；海藻糖购自南宁中诺生物公司；抗体稀释液(批号：17032206)购自济南百迪泰生物科技有限公司；山羊抗猪IgG-HRP抗体购自上海群己生物科技有限公司；鲁米诺发光底物液购自Thermo公司；化学发光免疫分析仪购自上海鸣捷生物科技有限公司。
1.3 抗原E2蛋白最佳包被浓度及血清样品稀释倍数的确定将原始浓度为0.68 mg·mL-1 E2蛋白用包被液从1∶100倍比稀释包被96孔化学发光板，4 ℃包被12 h。将阳性对照血清和阴性对照血清用样品稀释液分别稀释成1∶50、1∶100、1∶200、1∶300 4个梯度，每孔加入50 μL血清，室温反应10 min，弃液，加入240 μL 1×PBST溶液洗4次，弃液拍干。用抗体稀释液(批号：17032206)将山羊抗猪IgG-HRP抗体1∶120 000稀释，每孔加入50 μL，室温反应10 min，弃液，加入240 μL 1×PBST溶液洗4次，弃液拍干。每孔加入100 μL鲁米诺底物溶液，读取化学发光值。根据阳性血清发光值/阴性对照血清发光值(P/N值)最大为最佳条件原则，确定E2蛋白的最佳包被浓度及血清样品最佳稀释倍数。
1.4 样品稀释液的筛选分别选取：①1%BSA(PBST溶液)，②1% BSA[0.9%NaCl，0.5%Tween-20，0.05 mol·L-1 MOPS(pH7.0)]，③1%BSA[0.9%NaCl，0.5%Tween-20，1%海藻糖，0.05 mol·L-1 MOPS(pH7.0)]作为样品稀释液，用这3种稀释液对阳性对照血清和阴性对照血清1∶200稀释。将稀释好的血清加入化学发光板进行检测，读取化学发光值并计算分析P/N值。根据最大P/N值为最佳条件原则，筛选最佳样品稀释液。
1.5 封闭液的筛选分别选取：①1.5% BSA(1.5 g BSA，100 mL PBST溶液)，②5%脱脂奶粉(5 g脱脂奶粉，100 mL TBST溶液)，③ 2%海藻糖(2 g海藻糖，1%酪蛋白，100 mL PBS溶液)作为封闭液，每孔加入120 μL封闭液，4 ℃封闭10 h。用制备好的化学发光板检测阴阳性对照血清，读取化学发光值并计算分析P/N值。根据最大P/N值为最佳条件原则，筛选最佳封闭液。
1.6 封闭条件的确定在4 ℃分别设置6、8、10、12 h等不同封闭条件，按照以上所设置封闭条件用③封闭液进行封闭。用封闭好的化学发光板检测阴阳性对照血清，读取化学发光值并计算分析P/N值，根据最大P/N值为最佳条件原则，确定最佳封闭条件。
1.7 反应条件的确定将反应条件设置为37 ℃ 5、10、15、20 min和室温5、10、15、20 min，按照所设计的不同反应条件对阴阳性对照血清进行检测，读取化学发光值并计算分析P/N值。依据最大P/N值为最佳条件原则，确定最佳反应条件。
1.8 酶标抗体最佳稀释倍数的确定用抗体稀释液将酶标抗体稀释成1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000、1∶120 000、1∶160 000、1∶200 000等不同浓度梯度。按照设计的不同条件对阴阳性对照血清进行检测，读取化学发光值，并计算分析P/N值，依据P/N值最大为最佳条件原则，确定酶标抗体的最佳稀释倍数。
1.9 判定标准的确定用本研究建立的方法检测92份背景清晰的猪血清样品(56份阳性血清和36份阴性血清)，使用SPSS 17.0软件将化学发光值绘制成横坐标为1－特异性和纵坐标为敏感度的ROC(receiver operating characteristic)曲线，并以约登(Youden)指数[Youden指数=敏感性－(1－特异性)]最大时所对应的化学发光值作为临界值(CO值)[18]。
阴阳性判定：检测1份标准阳性血清和1份标准阴性血清各8次，分别计算化学发光值的平均值。根据标准阳性血清(P)和标准阴性血清(N)的化学发光值平均值，选择合适的系数(a，b)，使二者之和等于临界值(a P +bN=CO)。当S/CO≥a+b时，判定为阳性；当S/CO < a+b时，判定为阴性；其中S代表样品发光值，CO值代表临界值。
1.10 特异性试验用本研究建立的CSFV化学发光抗体检测方法对A型口蹄疫病毒(FMDV A)、O型口蹄疫病毒(FMDV O)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、塞内卡病毒(SVA)、非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体阳性血清进行检测，并设置CSFV抗性阳性血清作为对照。读取化学发光值并分析计算S/CO值，判定待检血清样品的阴阳性，从而分析本方法的特异性。
1.11 灵敏性试验用本研究建立的化学发光检测方法和市售IDEXX CSFV抗体检测试剂盒分别检测1∶200、1∶2倍比稀释的阳性对照血清(中和抗体效价为1∶600)，读取化学发光值并分析计算S/CO值，判定阴阳性，并与市售IDEXX CSFV抗体检测试剂盒检测结果进行对比，从而分析本方法的灵敏性。
1.12 重复性试验1.12.1 批内重复性试验 选取6份血清样品(3份CSFV抗体阳性血清和3份CSFV抗体阴性血清)，用同批包被的化学发光板检测6份血清样本，读取化学发光值并分析计算变异系数。
1.12.2 批间重复性试验 选取2份血清样品(1份CSFV抗体阳性血清和1份CSFV抗体阴性血清)，用3个不同批次化学发光板检测2份血清样本，读取化学发光值并分析计算变异系数。
1.13 临床样本的检测用本研究建立的CSFV化学发光抗体检测方法和商品化CSFV抗体检测试剂盒共同检测152份田间猪血清样品，读取化学发光值并分析计算Kappa值。当0 Kappa≤0.40时，则说明试验的 < 一致性差；若0.40 < Kappa < 0.75，则说明具有中度一致性；若Kappa≥0.75，则说明试验具有高度一致性[19]。
2 结果 2.1 抗原E2蛋白最佳包被浓度及血清样品最佳稀释倍数的确定利用棋盘滴定法对抗原E2蛋白最佳包被浓度及最佳血清稀释倍数进行优化。结果显示，当E2蛋白和血清稀释倍数均为1∶200稀释时，P/N值最大。通过BCA法测定E2蛋白初始浓度为0.68 mg·mL-1(图 1)，因此E2蛋白的最佳包被浓度为3.4 μg·mL-1，血清样品的最佳稀释倍数为1∶200。
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M.蛋白相对分子质量标准；1. 纯化后E2蛋白；2. E2蛋白与CSFV抗体阳性血清反应原性鉴定；3. E2蛋白与CSFV抗体阴性血清反应原性鉴定 M. Protein marker; 1. E2 protein after purification; 2. Identification of the reactivity of E2 protein and CSFV antibody-positive serum; 3. Identification of the reactivity of E2 protein and CSFV antibody-negative serum 图 1 CSFV E2蛋白SDS-PAGE分析(a)及E2蛋白的Western blot鉴定(b) Fig. 1 SDS-PAGE analysis of CSFV E2 protein (a) and Western blot identification of E2 protein (b) |
用①、②、③样品稀释液分别按照最佳稀释倍数对血清样品进行稀释，将稀释好的阴阳性对照血清加入化学发光板检测。读取化学发光值并分析计算P/N值，比值最大时的样本稀释液为最佳样品稀释液。结果表明，用②样品稀释液稀释血清样品时，P/N值最大。因此，最佳样品稀释液为1%BSA。
2.3 封闭液的筛选将已包被好的化学发光板用①、②、③3种不同的封闭液4 ℃封闭10 h。用本批次包被的化学发光板检测以最佳稀释倍数稀释的阴阳性对照血清，读取化学发光值并分析计算P/N值。P/N值最大时该封闭液则为最佳封闭液。结果表明，③封闭液封闭时，P/N值最大。因此，最佳封闭液为2%海藻糖。
2.4 封闭条件的确定用2%海藻糖按照所设计条件封闭化学发光板，通过对阳性对照血清和阴性对照血清检测，读取化学发光值并分析计算P/N值。结果表明，在4 ℃封闭8 h时，P/N值最大，证实了4 ℃封闭8 h为最佳封闭条件。
2.5 反应条件的确定按照所设置的反应条件对阴阳性对照血清进行检测，读取化学发光值并分析计算P/N值。结果表明，在室温反应10 min条件下，P/N值最大。因此，最佳反应条件为室温反应10 min(图 2)。
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图 2 反应条件的筛选结果 Fig. 2 Screening results of reaction conditions |
用抗体稀释液将酶标抗体分别稀释成1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000、1∶120 000、1∶ 160 000、1∶200 000 7个梯度。在最佳反应条件下，检测阴阳性对照血清，读取化学发光值并分析计算P/N值。结果表明，酶标抗体1∶40 000稀释时，P/N值最大。因此，酶标抗体最佳稀释倍数为1∶40 000(图 3)。
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图 3 酶标抗体稀释倍数的筛选结果 Fig. 3 Screening results of the dilution ratio of enzyme-labeled antibody |
利用SPSS 17.0软件将化学发光值绘制成ROC曲线(图 4)，并分析计算每个化学发光值Youden指数。Youden指数最大时为0.946，特异性为100%，灵敏性为94.6%，所对应的化学发光值为42 378.5，即临界值为42 378.5。分别检测1份标准阳性血清和1份标准阴性血清各重复8次，计算化学发光值的平均值。标准阳性血清化学发光值的平均值为293 691.1，标准阴性血清发光值的平均值为14 454.8，设定标准阳性发光值系数(a)为0.1时，标准阴性血清发光值系数(b)为0.9，此时两者之和为42 378.5，与CO值42 378.5一致。当S/CO ≥1时，判定为阳性；当S/CO < 1时，则判定为阴性。
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图 4 ROC曲线绘制结果 Fig. 4 ROC curve drawing results |
用本研究建立的CSFV化学发光抗体检测方法，对FMDV A型、FMDV O型、PRRSV、SVA、ASFV抗体阳性血清和CSFV抗体阳性血清进行检测，读取化学发光值并判定阴阳性。结果表明，以上5种猪病抗体阳性血清的S/CO值均小于1，为CSFV抗体阴性血清，证实了本研究建立的CSFV化学发光抗体检测方法与这5种猪病并无交叉反应，具有较好的特异性。
2.9 灵敏性试验用本研究建立的CSFV化学发光抗体检测方法和市售IDEXX CSFV抗体检测试剂盒检测倍比稀释的阳性对照血清，读取化学发光值并分析计算S/CO值，判定阴阳性，与IDEXX CFSV抗体检测试剂盒检测结果对比，从而分析本方法的灵敏性。结果表明，本方法的最低稀释度为1∶6 400，而IDEXX CSFV抗体检测试剂盒的最低稀释度为1∶64，因这两种方法分别是在1∶200和1∶2的基础上稀释，故灵敏度相当。
2.10 重复性试验在最佳条件，用本研究建立的化学发光检测方法对6份血清样品(阳性血清和阴性血清各3份)进行检测，以评估该方法的批内重复性。选取3个不同生产批次的发光板对2份血清样品(阳性血清和阴性血清各1份)进行检测，用于批间重复性的评估。每个血清设置4个平行孔，读取化学发光值并分析计算变异系数。结果显示，批内变异系数为1.80%~6.88%，批间变异系数为1.11%~9.18%，批内及批间变异系数均小于10%，表明本研究建立的CSFV化学发光抗体检测方法重复性好(表 1)。
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表 1 重复性试验结果 Table 1 Repeatability test results |
用本研究建立的CSFV化学发光抗体检测方法与商品化CSFV抗体检测试剂盒共同检测152份田间猪血清样品，读取化学发光值并分析计算Kappa值。结果表明，Kappa值为0.929>0.75，说明本研究建立的CSFV化学发光抗体检测方法具有高度一致性(表 2)。
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表 2 比对试验结果 Table 2 Comparison test results |
迄今为止，猪瘟在全球多个国家已得到基本控制，但某些地区仍存在猪瘟点状散发流行、种猪的严重带毒，并通过胎盘传染导致仔猪的先天性带毒以及后备猪潜伏带毒形成亚临床感染，这是猪瘟在猪场持续发生的重要原因，也给猪瘟的根除和净化工作带来了巨大的挑战[20]。目前，我国对猪瘟的防控主要以猪瘟兔化弱毒疫苗和亚单位E2蛋白重组疫苗免疫接种，结合抗体水平监测，因而CSVF血清学诊断显得尤为重要。E2蛋白是CSFV主要保护性抗原，能够诱导机体产生中和抗体，提供保护性免疫，从而能有效抵御猪瘟强毒的攻击[21]。因此，E2蛋白常被用作CSFV血清学诊断和疫苗开发研究的对象之一[22]。
ELISA是CSFV血清学诊断中最为常用的检测方法，但其在检测线性范围小、操作时间长等方面的不足[23]，在很大程度上降低了高通量检测的效率。CLIA作为一种高特异性、高灵敏性、快速简单准确的检测方法，不仅符合食品、生物医学等领域的快速灵敏检测的需求，更是在兽医、动物疫病检测上具有广泛的潜在应用价值[23]。Tan等[24]用CLIA、商品化ELISA试剂盒和以重组人源α3(Ⅳ)NC1蛋白包被自制的ELISA检测31例抗肾小球基底膜(anti-GBM)疾病患者体内的anti-GBM抗体，检测结果一致性较好，但在疑似患者检测上，CLIA要优于商品化ELISA试剂盒。熊玲红等[25]用化学发光法和酶联免疫法(ELISA)检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)并对两种方法进行比较，结果表明，化学发光和ELISA检测方法对SARS-CoV-2 IgG检测的灵敏度均高于SARS-CoV-2 IgM，并且化学发光检测灵敏度要高于ELISA方法。
ELISA检测试剂盒CO值的设定方法大多采用阴性样品OD450 nm均值±2 s或3 s，这种方法可能会导致假阴性比例过高，从而影响结果判定的准确性[26]。ROC曲线是一种兼顾灵敏度和特异性设定CO值的好方法，其主要通过Youden指数来筛选最佳的CO值，当Youden指数越大时，真实性越高[27]。本研究应用ROC曲线筛选最佳的CO值具有较好的科学性和真实性。Kappa值是检验两个检测方法一致性的重要指标，Kappa值越大时，两种检测方法的一致性越高[28-29]。应用Kappa一致性检验分析不同猪瘟抗体检测试剂盒检测结果一致性，比国内同类研究更加科学[30]。本研究建立的CSFV化学发光抗体检测方法与常规ELISA相比，不仅能在20 min完成对田间血清样品中CSFV抗体的检测，还能在加入鲁米诺发光底物之后直接读取化学发光值，省去终止反应这一步骤，缩短了检测时间。本文成功建立的CSFV化学发光检测方法不仅具有特异性强、灵敏性高、快速简单准确等优点，并且能极大地提高了CSFV抗体检测的效率，也为化学发光检测方法在其他动物疫病检测方法上的应用提供了参考。
4 结论成功建立了基于E2蛋白的CSFV化学发光抗体检测方法，该方法不仅具有高特异性、高灵敏性，并且能在20 min完成对田间血清样品中CFSV抗体的检测，极大地提高了高通量检测的效率。
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