绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae，Mo)可引起绵羊和山羊间质性肺炎，主要表现为咳嗽、流鼻涕、发热、渐进性消廋^[1-2]。该病一年四季均可发生，以秋冬季为主，应激等其他诱因使羊免疫力下降，Mo可趁机感染机体^[3]，目前，该病已经成为严重危害全球养羊业的重要疾病之一。临床上许多疾病的临床症状及病理表现都与羊支原体肺炎相似，对于该病的诊断主要依据临床症状和分子生物学及免疫学的检测^[4]，但是这些诊断方法耗时较长，而且对于判断病程转归、指导临床治疗的价值有限。计算机断层扫描(computed tomography，CT)被认为是评估人肺部疾病的金标准^[5]，有较高的密度分辨力，可以更好地显示病变的位置、大小、范围及性质，另外更有利于判断病程的转归，在早期发现、诊断过程及治疗都存在着重大的意义。近年来，CT在小动物肺部疾病的诊断中越来越广泛^[6-7]，国外早在2005、2007年就有了关于CT在反刍动物肺部疾病中应用的相关报道^[8-9]。迄今为止，国内鲜有关于羊肺部疾病的CT影像诊断研究。本研究人工感染山羊肺炎支原体，诱发山羊支原体肺炎，结合病理解剖学和组织病理学变化研究山羊支原体肺炎的CT影像学特征，以期为临床上羊肺部疾病的影像学诊断提供参考依据。

1 材料与方法 1.1 支原体

绵羊肺炎支原体IK3-3株(CVCC380)，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.2 主要仪器设备和试剂

联影医疗uCT510立体等像素16层螺旋CT扫描仪(联影)，速眠新、苏醒灵(拜特医药)，异氟烷(河北一品制药)，绵羊肺炎支原体间接血凝诊断试剂盒(中国科学院兰州兽医所)，KM2液体培养基：MEM培养基(Gibco，Thermo Fisher Scientific)55 mL，1.7%水解乳蛋白Hank’s缓冲液35 mL，25% 酵母浸液2 mL，健康马血清10 mL，1%醋酸铊溶液1 mL，青霉素200 IU·mL^-1，0.4%酚红0.18 mL，调整pH至7.4~7.8。

1.3 试验动物

20只山羊购自江苏句容某养殖场，体重在30~40 kg，临床及影像学检查均无异常，经绵羊肺炎支原体间接血凝诊断试剂盒检测阴性。

1.4 绵羊肺炎支原体的制备

将绵羊肺炎支原体IK3-3株按1∶10比例接种KM2液体培养基中，37 ℃静置培养，待培养物变黄后，传代扩大培养，待培养物变黄后，按颜色变化单位(cell culture unit, CCU)测定支原体含量，收获备用。

1.5 人工感染绵羊肺炎支原体

20只羊随机分为两组，对照组C(n=5)和试验组E(n=15)。试验组每只羊气管内注射接种5 mL绵羊肺炎支原体IK3-3株(10⁷CCU·mL^-1)，对照组接种5 mL的无菌生理盐水。接种完毕后肌注与速眠新等剂量苏醒灵使羊苏醒。两组羊隔离饲养，每日早上09:00观察两组羊临床症状，测量直肠体温。

1.6 CT检查

对照组与试验组分别于人工接种前和接种后第7、14、21、28天进行CT扫查。检查前所有羊禁食24 h，禁水2 h。肌内注射速眠新(0.1 mg·kg^-1)进行诱导麻醉，采用面罩进行异氟烷维持麻醉，于扫描床上俯卧位保定，头朝向扫描机架，进床扫描。使用联影医疗uCT510立体等像素16层螺旋CT扫描仪进行胸部扫查，扫查参数为电压140 kV，电流20 mA，螺旋扫描方式，层厚1.2 mm，层距0.6 mm，矩阵512 × 512。检查结束后，肌注与速眠新等剂量苏醒灵使羊苏醒。应用HOROS软件对扫描获得的CT影像进行读片、分析。图像重建肺窗(WW 1400，窗位WL- 500)，纵膈窗(WW 350，窗位WL 40)，

1.7 病理学检查

感染后第29天切断颈动脉处死，剖检观察病理解剖学变化。选择病变明显的肺叶，手术刀切取小块病变和健康交界处的肺组织，置于4%甲醛溶液进行固定，制备常规石蜡切片，HE染色，显微镜下观察组织病理学变化。

1.8 病料中支原体分离、鉴定

羊剖杀后，参考孙喜安^[10]的方法，分离培养并鉴定支原体。取肺病健交接部位，至少选择3个取样点，在研钵中加入2 mL KM2培养基；将病料剪碎研磨，过滤，将滤液按1∶5比例接种培养基，37 ℃培养3~4 d。分离培养物用细菌基因提取试剂盒提总基因组DNA。根据HSP70基因设计PCR鉴定引物MoHSP70-F：5′-ATGAAAGGAAAACATAATATGGC-3′，Mo HSP70-R：5′-TTAGTT- TTGTTTGATTTCAGCAT- 3′，目的片段1 815 bp。PCR反应体系：2 × T5 Super PCR Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，基因组DNA 1 μL，补水至20 μL。PCR条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 90 s，30循环，72 ℃ 7 min；4 ℃保存。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2 结果 2.1 肺炎支原体感染后临床症状观察

对照组羊感染后未见咳嗽、喷嚏及眼鼻分泌物等临床症状。试验组羊接种绵羊肺炎支原体后，按照临床症状可分为重症、中症和轻症。重症羊4只，在感染后第3~4天普遍出现食欲减退的表现，体温升高(41~42 ℃)，感染后7 d出现喷嚏及咳嗽等症状，第14天出现打喷嚏、咳嗽，眼鼻分泌物增多等较为严重的呼吸道症状，并持续到第21天，之后逐渐减轻。中症羊感染7 d后，体温一过性升高(40~41 ℃)之后正常，并有轻微咳嗽、流浆液性鼻液和腹泻等症状，21 d后无异常临床症状。轻症羊感染后体温正常或以中低温为主，偶尔略微升高，仅表现流浆液性鼻液或脓性鼻液。另5只无症状，鼻拭子经绵羊肺炎支原体间接血凝诊断试剂盒检测，判为未感染。

2.2 CT检查表现

对照组羊CT影像如图 1所示(图像的左侧为身体的右侧，上方为身体的背侧)。在接种前、感染后第7、14、21、28天对照组CT影像均未发现异常。双侧肺纹理清晰，未见异常密度影，气管、支气管通畅，支气管周围未见异常密度影。肺门、纵隔未见肿大淋巴结影。双侧胸膜平滑，无增厚，胸膜腔未见积液征。

重症组羊CT影像如图 2所示，感染初期(第7天)多见各肺叶呈现片状的磨玻璃密度影(白色箭号)，肺纹理紊乱增粗，部分肺叶出现大片实变影(白色箭头)；中后期(第14~21天)整体肺野密度增高，支气管血管周围间质增厚，出现边缘模糊的高密度“鞘”状结构(黑色箭号)；有的羊可见大片炎症渗出所致的空气支气管征(黑色箭头)；胸膜渗出，表现条带状的增厚影(白色三角形)。第28天胸部影像较第21天无明显变化。

中症组羊CT影像如图 3所示，感染初期(第7天)整体肺叶密度变化不大，右侧中叶支气管周围、右侧肺叶出现部分小片状的磨玻璃密度影(白色箭号)。感染中期(第14天)右肺中叶支气管出现相平行的两条线状高密度“轨道征”及“印戒征”(白色箭头)，提示支气管壁增厚；双侧后叶前部小叶间间质增厚，呈现网状/线状的不透明影(黑色箭号)，右后叶出现平行于胸壁的胸膜下线(黑色箭头)。感染后期(第21天)病灶基本吸收，肺野密度大体恢复正常。第28天影像已无异常。

轻症组羊CT影像如图 4所示，感染初期(第7天)可见部分肺叶出现小片状的磨玻璃密度影(白色箭号)，双肺后叶出现由于细支气管扩张导致的“树芽征”(白色箭头)，右侧后叶后段出现沿着胸壁的线状紊乱影像(黑色箭号)。感染中期(第14天)磨玻璃密度影和“树芽征”基本消失，感染第7天扫描所见的右侧后叶后段的线状紊乱影已发展为胸膜下线(黑色箭头)。感染后期(第21天)影像已无异常。

2.3 CT影像数据分析

羊支原体肺炎CT影像分析结果如表 2所示，试验组中10只羊肺部出现异常影像，其中，单侧肺叶病变3只，双侧肺叶病变7只，右前叶病变10只，右中叶病变5只，右后叶病变8只，左前叶病变5只，左后叶病变6只，副叶病变4只。主要以磨玻璃影为主，多表现为间质性肺炎，好发于右前叶，重症组多见支气管壁增厚，空气支气管征和网格状影。

2.4 病理剖检

试验组羊剖检如图 5所见。打开胸腔可见部分肺与胸膜发生粘连(白色三角形)。肺有不同程度的粉色肉变(黑色箭号)和肝变(白色箭号)，肺与胸壁发生粘连。局部有明显的结节(白色箭头)出血点和出血斑，病变区域突出于肺表面，质地坚硬，用手触摸有粗糙感，颜色呈暗红色或粉红色。肺间质明显增宽，表面呈大理石纹路病变(黑色箭头)，病变区域和健康区域有明显界限。

2.5 病理组织学检查

试验组羊病理组织学检查结果如图 6所示。可见不同程度的支气管肺炎及间质性肺炎，与CT影像表现一致。细支气管黏膜上皮增生，周围巨噬细胞、淋巴细胞浸润，管腔内有浆液性渗出，混有大量的中性粒细胞、巨噬细胞和脱落的上皮细胞(图 6A)；肺局部见脓肿病灶(图 6B)，肺泡腔及间质内见大量坏死的中性粒细胞；肺泡结构部分破坏(图 6C)；肺泡壁与间隔有中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞浸润(图 6D)。小血管周围淋巴细胞浸润，毛细血管充血、淤血。

2.6 支原体分离、鉴定

从试验组感染成功羊的肺部采集的病料，经过培养及PCR检测，扩增到1 815 bp目的片段(图 7)，与预期理论大小一致，说明试验组羊感染了绵羊肺炎支原体。

3 讨论

支原体感染动物机体后常引起慢性或潜伏感染，造成慢性消耗性疾病，并且常引起其他继发性疾病，发病率和死亡率增加^[11-12]。Mo感染后细胞因子能够激活内皮细胞和粒细胞，导致炎症的发生^[13]。在临床上表现为非典型肺炎症状，危害严重。CT具有较高的密度分辨力，对病变的部位、形态、密度、临近支气管、血管束及胸膜、纵隔状况均有较好的显现，是诊断肺部疾病的最佳影像检查方法。可以发现X线片难以发现的病变影像和肺炎早期的影像变化，有助于与其他疾病进行鉴别诊断^[14]。

本研究人工感染绵羊肺炎支原体，通过临床症状、病理学变化、病原学检测确定支原体肺炎造模成功。由于机体免疫力不同，感染的病羊表现出不同程度的临床症状。病羊剖检可见气管有大量的黏液渗出，多见双侧肺叶发生病变，好发于右前叶。肺有明显的出血点和出血斑，不同程度的肉变，能明显看到健康和病变的交界处，切面呈大理石样。病变肺组织病理检查可见肺间质增宽，支气管上皮细胞增生，支气管内炎性渗出，血管和细支气管周围也存在大量炎性细胞浸润^[15]。

本研究对成功诱发支原体肺炎羊进行CT扫描，由获得影像可知羊支原体肺炎影像主要以间质性肺炎伴发支气管肺炎为主。CT影像上以片状的磨玻璃密度影为主要特征，同时也会出现小叶间间隔增厚的网格状影像，符合间质性肺炎的影像表现，病理组织学检查也显示间质增厚，符合间质性肺炎的病理表现。支气管黏膜增厚、出现双轨征是支气管肺炎的主要CT影像表现，病理上表现为支气管黏膜增厚，管腔内大量的炎性渗出。CT影像上的实变影，与病理解剖上表现的肉变和肝变的变化一致。

随着支原体肺炎病程的发展，CT影像表现也在不断的变化。重症组羊初期以磨玻璃密度影为主，肺纹理增粗，部分肺叶实变。随着病情的发展，肺野整体的密度升高，直至试验结束后也无明显的变化，这些均与临床表现相符。中症组病情相对重症组轻，CT影像上也没有表现出大面积的实变影，且在21 d内影像表现大部分消失。轻症组仅出现小片状的磨玻璃密度影，且第14天后已经无明显的影像表现。

4 结论

山羊支原体肺炎多见双侧肺叶病变，好发于右前叶，以间质性肺炎伴发支气管肺炎为主，胸部CT影像主要表现为片状磨玻璃密度影，网格状阴影，其中重症羊多见空气支气管征，个别羊见胸膜增厚影。支原体肺炎的影像表现与临床症状、病程发展一致，影像上的表现与病理解剖学、病理组织学变化也具有一致性，说明CT可以准确地评估羊支原体肺炎的发展，对羊支原体肺炎的诊断具有重要的参考价值。