2. 辽宁省疾病预防控制中心, 沈阳 110005
2. Liaoning Center for Disease Prevention and Control, Shenyang 110005, China
芽胞杆菌是一类常见的革兰阳性细菌，是动植物微生态的优势菌之一，不仅种类繁多，而且来源广泛，存在于土壤、海洋、植被、食物及动物肠道等多种样品中[1-2]，其产生的芽胞可在高温、高压、强酸、强碱等多种极端环境中生存，具有较强的耐受能力[3-4]。芽胞杆菌代谢产生的细菌素分为修饰后细菌素(Ⅰ类)、无修饰细菌素(Ⅱ类)和具有磷酸酶活性的大分子蛋白(Ⅲ类)，而有些在遗传、分子或氨基酸结构等方面缺乏数据，无法按照分类法进行分类的抗菌蛋白，统称为类细菌素[5]。芽胞杆菌产生的细菌素和类细菌素是继乳酸菌细菌素之后的又一类重要的细菌素[6]，与乳酸菌产生的细菌素相比，芽胞杆菌细菌素抗菌谱更广，包括革兰阳性菌、革兰阴性菌、酵母和真菌，并且具有耐酸碱、耐高温的特性。这些特性提示了芽胞杆菌产生的(类)细菌素具有广泛的应用前景[7-8]。
据研究报道，多种芽胞杆菌可以代谢产生细菌素或类细菌素，例如地衣芽胞杆菌(B. licheniformis)、枯草芽胞杆菌(B. subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(B. amyloliquefaciens)、苏云金芽胞杆菌(B. thuringiensis)、蜡样芽胞杆菌(B. cereus)和凝结芽胞杆菌(B. coagulans)等[5]。近十年，从芽胞杆菌中分离出的细菌素或类细菌素有50余种，如Xin等[9]从分离自藏猪肠道的枯草芽胞杆菌TS的发酵产物中纯化到细菌素TP，该细菌素为相对分子质量约1.5 ku的肽，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑菌活性；Ayed等[10]从解淀粉芽胞杆菌An6发酵产物中分离到约11 ku的类细菌素，该类细菌素在pH 4.0~10.0条件下仍具有抑菌活性；Sharma等[11]对枯草芽胞杆菌GAS101所产细菌素的抑菌活性和作用机制进行研究，发现该细菌素对大肠杆菌和表皮葡萄球菌具有抑制作用，且具有耐高温、耐酸碱的特点。但由于(类)细菌素是细菌产生的天然成分，与众多物质混合，成分不单一，存在分离纯化难度大、产量低等问题。因此，通过基因工程技术进行体外表达是获得足量(类)细菌素的有效途径[12]。
羊驼原产于安第斯高原地区的恶劣环境下，具有抗寒、抗旱、抗病力强且可自然产生单域抗体等优良特性，羊驼的这些特性与其体内特定的微生物菌群有着密切的关系。本研究从羊驼粪便中分离到1株产抑菌物质的枯草芽胞杆菌菌株SXAU18，分离纯化后预测其产生的抗菌蛋白的基因序列，通过原核表达获得具有生物活性的DarA重组蛋白。本研究将为DarA的功能研究和作为抗菌蛋白的应用奠定理论依据。
1 材料与方法 1.1 菌株枯草芽胞杆菌SXAU18的分离：在山西农业大学羊驼繁育基地，随机采取10头羊驼的粪便，参照相关研究报道的方法[9]，将羊驼粪便按照0.2 g·头-1进行混合，加入PBS制成均匀的悬液，37 ℃培养箱孵育1 h后进行梯度稀释，涂布于LB平板，37 ℃培养24 h。通过菌落的形态、大小和颜色等菌落特征的观察和革兰染色后镜检，挑选可疑菌落。划线纯化4次后，牛津杯扩散法测定挑选菌株发酵上清液的抑菌活性。挑选抑菌效果最好的菌株进行16S rDNA鉴定，结果表明，该菌为枯草芽胞杆菌，将其命名为枯草芽胞杆菌SXAU18。
指示菌：大肠杆菌(Escherichia coli)CMCC44102、沙门菌(Salmonella paratyphi A)CMCC(B)50001、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC26003、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)CMCC(B)26069、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)CMCC(B)28001，单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC19111，保存于山西农业大学羊驼生物工程实验室。
1.2 枯草芽胞杆菌SXAU18的抑菌活性将枯草芽胞杆菌SXAU18活化后，按照1∶100的体积比接种于LB液体培养基中，30 ℃培养24 h后，10 000×g 4 ℃离心20 min，收集上清液，用0.22 μm滤器过滤获得无细胞的培养上清。参照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书检测无细胞培养上清液的总蛋白浓度。
参照文献[13-14]采用牛津杯扩散法测定SXAU18培养上清的抑菌活性。步骤如下：①培养板中倒入大约10 mL的2%琼脂培养基制成下层培养板；②在下层板上间隔合适距离放置牛津杯，15 mL的0.75%软的TSA培养基(胰蛋白胨15.0 g·L-1，大豆蛋白胨5.0 g·L-1，氯化钠30.0 g·L-1，琼脂7.5 g·L-1)或者15 mL的0.75%的BHI(脑心浸液)培养基，冷至55~60 ℃时，加入指示菌107CFU·mL-1，倒入下层培养基上，待上层凝固后，拔出牛津杯，形成上层板；③在孔中加入180 μL无细胞培养上清，并以LB培养基为阴性对照，氨苄青霉素为阳性对照，每个样品3个重复，置于培养箱中培养过夜，用游标卡尺测量抑菌环直径。
1.3 抑菌物质的分离纯化硫酸铵沉淀：无细胞培养上清液1 L，用饱和度为50%的硫酸铵盐析，在室温下用磁力搅拌器搅拌6 h，10 000×g，4 ℃离心20 min，沉淀溶于1/40体积的PBS中。氯仿抽提：收集到的样品与氯仿按照1∶1体积比例混合，震荡15 min，4 500×g离心10 min，弃掉上层和下层相，收集中间相，真空浓缩仪(Eppendorf, Saxony, GER)干燥后用1/2体积PBS重悬干燥沉淀物。分子截留：收集到的样品利用10 ku cut-off和3 ku cut-off超滤离心管(Millipore, Massachusetts, USA)3 000×g 4 ℃离心，获得10 ku以上、3~10 ku和3 ku以下三段蛋白液；SDS-PAGE分离：具有抑菌活性的蛋白液通过4%~20% SDS-PAGE(Sigma-Aldrich, TruPAGETM Precast Gel System)电泳，一个泳道进行考马斯亮蓝染色，另一个泳道用0.1% Tween 80清洗，30 min·次-1，洗3次，之后MilliQ水清洗30 min除去SDS，将清洗后的胶条放置到LB固体平板上，在上层倾倒含有100 μL (OD600 nm=0.6)指示菌的0.75%TSA软固体培养基，37 ℃培养过夜，测定抑菌效果。以金黄色葡萄球菌为指示菌，在分离纯化的每一步后均进行抑菌活性检测。
1.4 质谱及生物信息学分析切下具有抑菌活性的SDS电泳条带，送至华大基因，做质谱分析。通过UltiMate3000 (Dionex)和Q Exactive (Thermo Fisher Scientific, Millipore, Massachusetts, USA) LC-MS/MS质谱仪系统进行蛋白序列分析。获得序列运用Mascot软件(Matrix Science)进行UniProt分析。通过NCBI和ExPASy-ProtParam tool对质谱结果进行分析，预测其抑菌蛋白的氨基酸序列。根据大肠杆菌密码子偏好性，优化合成预测抗菌蛋白的基因序列。
1.5 重组质粒pCold-I-DarA的构建根据抗菌蛋白优化后的基因序列，设计构建表达载体的特异性引物，上游引物引入HamHⅠ酶切位点，下游引物引入SalⅠ酶切位点。引物序列，F：5′-TAACGGGATCCATTGTTGCCGTGGTTCAGGA-3′，R：5′-TTGATGTCGACGAACTGATGGAATTCATCCA-3′。以优化序列为模板，PCR扩增基因序列。PCR产物进行胶回收后，用HamHⅠ和SalⅠ进行双酶切，与同样经过双酶切的pCold-I表达质粒进行连接，将连接产物转入DH5α感受态细胞中，将转化菌液涂布在含有Amp的LB平板上，37 ℃培养箱中过夜培养，随机挑取3个单克隆进行测序鉴定，将鉴定正确的阳性克隆接种于含有Amp的LB培养基中，培养过夜提取重组质粒pCold-I-DarA。
1.6 DarA蛋白的原核表达将重组质粒pCold-I-DarA转化至BL21细胞中，测序鉴定阳性转化子。取阳性转化子的菌液按1∶100的体积比转接于含Amp的LB培养基中，在37 ℃培养至OD≈0.6时，加入诱导剂，同时设定不加诱导剂的对照组，15 ℃ 150 r·min-1诱导12 h。离心收集菌体，用PBS重悬菌体，吹打均匀，超声破碎，离心收集超声后的上清和沉淀。进行SDS-PAGE检测。
1.7 重组DarA蛋白的纯化将超声上清液上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA -Sepharose Cl-6B亲和层析柱，用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mmol·L-1 Tris-HCl，20 mmol·L-1咪唑，0.15 mol·L-1 NaCl，pH8.0)洗脱杂蛋白，之后，用Ni-IDA Elution-Buffer(20 mmol·L-1 Tris-HCl，250 mmol·L-1咪唑，0.15 mol·L-1 NaCl，pH8.0)洗脱目的蛋白。上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS进行透析过夜。纯化样品进行12% SDS-PAGE和Western blotting分析。
1.8 表达纯化后DarA的活性鉴定以金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌作为指示菌，采用牛津杯扩散法对重组蛋白的活性进行鉴定。同时设定氨苄青霉素为阳性对照，PBS为阴性对照。分别在孔中加入180 μL的待测样品，将抑菌平板放置到培养箱中培养大约12 h，观察并记录抑菌效果。
2 结果 2.1 SXAU18发酵上清的抑菌效果分离自羊驼粪便中的枯草芽胞杆菌SXAU18，经培养获得该菌株的无细胞培养上清，BCA蛋白浓度测定其总蛋白的浓度为1.04 μg·μL-1，指示菌的抑菌作用见表 1，结果显示，该菌所产上清对革兰阳性菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黄微球菌和单增李斯特菌具有显著的抑菌活性(表 1)。
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表 1 SXAU18所产类细菌素对指示菌的抑菌活性检测(x±s) Table 1 Effect of bacterocin-like substance produced by SXAU18 on indicators antimicrobial activity (x±s) |
对枯草芽胞杆菌SXAU18所产抑菌物质进行分离纯化。1 L无细胞发酵上清液通过饱和50%的硫酸铵盐析得到25 mL粗提液，其抑菌活性见图 1A；粗提液通过氯仿抽提后进行分子截留和浓缩，获得相对分子质量3 ku以下、3~10 ku之间和10 ku以上3个蛋白大小的蛋白浓缩液，抽提液和浓缩液的抑菌活性测定分别见图 1B和1D。图 1D显示，抑菌蛋白相对分子质量主要集中在10 ku以上。进而将相对分子质量大于10 ku的蛋白液做SDS-PAGE分析，结果显示，在大约15 ku产生明显的抑菌区域(图 1E)，纯化结果显示，该菌所产抗菌物质是10~20 ku的蛋白质。
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A. 硫酸铵沉淀后的抑菌活性；B. 氯仿抽提后的抑菌活性；C. PBS阴性对照；D. 超滤后的各个组分的抑菌活性；E. 10 ku以上蛋白液的SDS电泳和抑菌活性分析(a. SDS电泳；1. 低相对分子质量蛋白标准; 2. 样品；b. 胶条在10~25 ku大小对金黄色葡萄球菌具有明显的抑菌区域) A. Antibacterial activity of ammonium sulfate precipitation; B. Antibacterial activity of chloroform extraction; C. Negative control; D. Antibacterial activity of ultrafiltration collection; E. SDS-PAGE analysis of purified protein solution over 10 ku and detection of antibacterial activity on gel (a. SDS-PAGE; 1. 1.7-40 ku low-range protein ladder; 2. Sample; b. Gel overlaid with S. aureus showing a clearing inhibitory zone indicating antibacterial activity associated with over 10-25 ku band) 图 1 枯草芽胞杆菌SXAU18所产类细菌素在分离纯化过程中的抑菌活性测定(以金黄色葡萄球菌为指示菌) Fig. 1 Antibacterial activity assay of purification process of bacterocin-like substance produced by Bacillus subtilis SXAU18(S. aureus as indicator bacteria) |
质谱分析结果显示：枯草芽胞杆菌SXAU18所产活性物质含有特定的氨基酸序列——GSSIFGLAPGK。UniProt、NCBI和ExPASy-ProtParam tool分析预测结果显示：抑菌蛋白可能为环二腺嘌呤核苷酸受体A(c-di-AMP receptor A)，其是枯草芽胞杆菌中第二信使“(c-di-AMP)”的主要受体蛋白之一。根据大肠杆菌密码子偏好性对抑菌蛋白的基因序列进行优化，优化后的序列为：ATTGTTGCCGTGGTTCAGGATCAGGATAGCAATCGCCTGCTGAAAACCTTAACCGATCATAACTTCCGCGTTACCAAACTGGCAACCACCGGCGGCTTCCTGAAAAGTGGTAATACCACCTTCATGATTGGCGTGGAAGATATTCGCGTTAATAAAG CACTGAGCCTGATTAAAGAAAATGGTCAGAAACGTGATCAGATGATTGCCCCGGTTAGCCCGATGGGTGGCAATGCAGATAGTTATGTTCCGTATCCGGTGGAAGTGGAAGTTGGCGGTGCAACCGTGTTCGTGCTGCCGGTGGATGAATTCCATCAGTTC。
2.4 DarA的原核表达和纯化SDS-PAGE分析结果显示，外源诱导表达的重组蛋白DarA是以可溶性上清蛋白和包涵体两种形式存在，且主要以可溶性上清蛋白形式表达(图 2A)。重组蛋白DarA纯化后的SDS-PAGA分析结果显示，纯化后的DarA蛋白为单一条带(图 2B)。Western blot结果表明：重组表达的DarA蛋白能够与鼠抗HIS单克隆抗体特异性结合，蛋白大小约为12 ku(图 2C)，与预计大小相符。
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A.重组蛋白DarA原核表达SDS电泳图(M. 蛋白相对分子质量标准; 1. 未诱导组; 2. 诱导组; 3. 诱导组超声波破碎后上清; 4.诱导组超声波破碎后沉淀); B.重组蛋白DarA纯化的SDS电泳图(M. 蛋白相对分子质量标准; 1. 超声波破碎后的样品；2. 流出；3. 洗脱); C.纯化后DarA的Western blot结果(M.蛋白相对分子质量标准; 1.纯化样品) A. SDS-PAGE of DarA protein expression (M. Protein marker; 1. Non-induced group; 2. Induced group; 3. Supernatant after induction of fragmentation; 4. Precipitation after induction of fragmentation); B. SDS-PAGE analysis of DarA fusion protein purification (M. Protein marker; 1. Samples after ultrasonic breaking; 2. Flow-through; 3. Elution); C. Western blot analysis of DarA fusion protein purification (M. Protein marker; 1. Purified sample) 图 2 DarA重组蛋白表达和纯化的SDS电泳和Western blot分析 Fig. 2 SDS-PAGE and Western blot analysis of DarA protein expression and purification |
抑菌鉴定结果显示：重组蛋白DarA对金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌均产生明显的抑菌环(图 3A、B)。同时，PBS阴性对照孔周围的细菌生长未受到抑制(图 3C、D)。Amp阳性对照孔周围的细菌生长受到了明显的抑制(图 3E、F)，结果表明：由原核表达系统表达产生的DarA蛋白具有抑菌活性。
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A. DarA对金黄色葡萄球菌的作用; B. DarA对单增李斯特菌的作用; C、D. PBS阴性对照组; E、F. 氨苄青霉素阳性对照组 A. Inhibitory activity against S. aureus of DarA; B. Inhibitory activity against L. monocytogenes of DarA; C, D. PBS negative control; E, F. Ampicillin positive control 图 3 重组DarA蛋白的抑菌活性分析 Fig. 3 Antibacterial activity of recombinant protein DarA |
拮抗菌是自然存在的抑制有害病原菌的菌群，具有对人畜安全，对环境无污染，不易使病原微生物产生抗性等优点，也是获取抗菌物质的重要生物资源[5]。枯草芽胞杆菌作为农业部允许在饲料中添加的益生菌之一，具有耐高温、耐酸碱、易培养、抗逆性好、加工损失少的特点[15]，属于非肠道固有菌群，在自然界中分布广泛。近年来，越来越多的芽胞杆菌菌株及其所产(类)细菌素被分离和应用。例如，Xin等[9]从藏猪肠道中分离得到一株芽胞杆菌菌株TS，并分离到抗菌肽TP。Wu等[16]从淀粉芽胞杆菌菌株ZJHD3-06中分离出抑制李斯特菌生长的细菌素CAMT2。益生芽胞杆菌或所产益生素在鸡、猪、羊体内的试验结果表明，其具有增强免疫、促进肠道发育和提高饲料转化率等作用[17-19]。本研究从羊驼粪便中筛选到一株枯草芽胞杆菌SXAU18，该菌的发酵上清对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黄微球菌和单增李斯特菌的生长具有显著的抑制作用。
常见的细菌素分离纯化方法有盐析、有机溶剂沉淀、有机溶剂抽提、酶解法、超滤法、等电点沉淀、凝胶分离、亲和层析、离子交换色谱、疏水层析等[20]。在实际分离纯化过程中需要将几种方法结合起来使用。如Beri c ′等[21]、Smitha和Bhat[22]采用硫酸铵沉淀、氯仿抽提、SDS-PAGE方法分别纯化到细菌素licheniocin 50.2和Bacteriocin BL8。本研究综合运用硫酸铵沉淀、氯仿抽提、分子截留、SDS-PAGE和牛津杯扩散法对枯草芽胞杆菌SXAU18发酵上清液中的抑菌成分进行分离和鉴定，初步判断：枯草芽胞杆菌SXAU18所产抑菌活性物质为相对分子质量约15 ku的蛋白质。经质谱和生物信息学分析预测其主要抑菌成分(之一)为DarA，该蛋白为枯草芽胞杆菌中第二信使“环二腺嘌呤核苷酸(c-di-AMP)”的主要受体蛋白之一。He等[23]在研究中指出：c-di-AMP是细菌中广泛存在的第二种信使，参与维持渗透压、调控DNA损伤、生物膜形成，耐酸胁迫以及其他功能，它是细菌产生芽胞所必需的，并且其基因也是细菌生长的必需基因。Gundlach等[24]解析了DarA蛋白的晶体结构，结果表明，该蛋白形成同源三聚体，结合三个环二腺嘌呤核苷酸(PDB: 4RLE)，并指出DarA并不是枯草芽胞杆菌的生存所必需的蛋白。据文献报道，目前DarA蛋白的生物学功能还没有被诠释。
为验证DarA是否具有抗菌功能，需要获得较纯的DarA蛋白。根据枯草芽胞杆菌SXAU18发酵上清对革兰阳性菌具有抑制生长的作用，对革兰阴性菌基本没有作用的特点，本研究选择原核表达系统作为表达体系，同时，为提高重组蛋白的表达量和分泌表达蛋白比例[25-26]，按照大肠杆菌的密码子偏好性对DarA的基因序列进行了优化[27]，并以pCold-I作为表达质粒，进行低温诱导，从而降低包涵体的表达比例，最终获得了良好的表达效果。
芽胞杆菌细菌素分类法将其细菌素分为3类：Ⅰ类细菌素，以羊毛硫菌素或环状为特征；Ⅱ类细菌素，是一类小分子(0.77~10 ku)的线性肽；Ⅲ类细菌素，相对分子质量大于30 ku蛋白。其他许多中等大小的抗菌多肽(10~30 ku)和其他由杆菌产生的大的抗菌蛋白，无法按照分类法进行分类，被称为类细菌素[5]。本研究获得的DarA重组蛋白相对分子质量大小约为12 ku，加之Gundlach等[24]报道的DarA结构特点，DarA应属于芽胞杆菌类细菌素的一种。
本研究所得结果为DarA的功能研究和作为抑菌蛋白的应用奠定了理论依据。
4 结论从羊驼粪便中分离到枯草芽胞杆菌SXAU18，该菌株能够发酵产生抑制金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黄微球菌和单增李斯特菌生长的类细菌素DarA，重组表达后的DarA具有抑菌活性。
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