2. 河北工程大学生命科学与食品工程学院, 邯郸 056038
, LIAN Pengjing1, BAI Yu1, XI Liuqing1, ZHANG Zihui1, NIU Xiaofei2, YANG Junqi2, QIAO Jian1
2. College of Life Sciences and Food Engineering, Hebei University of Engineering, Handan 056038, China
禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)可感染人和多种动物，严重威胁着人和动物健康，并造成巨大的经济损失。其中，H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 subtype AIV，H9N2 AIV)广泛流行于中国养殖场鸡群中，可导致鸡群产蛋量下降以及表现出呼吸道和消化道症状，给养禽业造成一定的经济损失[1]。此外，H9N2 AIV虽然属于低致病性禽流感病毒，但其具有广泛的宿主适应性，可感染鸡、鸭、鹌鹑等多种宿主，也可跨物种传播感染猪、雪貂和人等哺乳动物[2-4]。而且多项血清流行病学调查显示，在我国有13.7%~37.2%的人可能曾感染过H9N2 AIV[5-7]。在大多数情况下，H9N2 AIV感染人往往导致轻度的临床症状[8-9]，因此容易被忽视，这就有可能使得H9N2 AIV在人体内逐渐适应，并与其他流感病毒亚型发生基因重组，形成可能造成全球流感大流行的新型流感病毒。
人肠道中存在着与人体内细胞等量的共生菌[10]，并在机体代谢、营养和免疫等过程中都起着重要作用[11]。而且肠道菌群不仅在抵抗肠道病原感染发挥重要作用，其对抵抗肠道外部位如肺部的病原感染也发挥重要作用[12]。通过补充益生菌等方法改善肠道微生物群可有利于肺部感染性疾病的治疗，而抗生素等引起的肠道菌群失调会通过“肠-肺轴”导致肺部免疫应答受损从而促进肺部病原感染[13-14]。反之，当机体存在肺部病原感染时，也可影响肠道菌群的微生态平衡，例如，近年来，越来越多的研究表明，肺部的病原感染，如肺结核分枝杆菌[15]、呼吸道合胞病毒[16]、严重急性呼吸综合征冠状病毒2[17-18]以及流感病毒(H1N1[19]、H5N1[20]、H7N9[21-22])等的感染都可影响到肠道菌群的稳态。
然而，关于H9N2 AIV呼吸道感染对肠道菌群的影响还未见有研究报道。而且由于粪便易获取以及粪便中近60%的固体物质为来自于肠道的共生菌群[23]，大部分的研究都是采用粪便中的菌群来代表肠道菌群。因此，本研究通过收集小鼠感染H9N2 AIV前和感染后的粪便，利用16S rRNA测序技术，来探究小鼠感染H9N2 AIV后其肠道菌群的动态变化，以期为进一步研究H9N2 AIV的感染、肠道菌群和机体的免疫这三者的相互作用提供一些参考。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 H9N2 AIV 由本实验室于2008年从河北某规模化养殖场的鸡群中分离得到，命名为A/Chicken/Hebei/4/2008(H9N2)，GenBank登录号为FJ499463~FJ499470。之前实验室的研究结果已经表明，A/Chicken/Hebei/4/2008(H9N2)对它本来的宿主鸡致病性较弱(其只能在鸡气管和肺有效复制，并不引起鸡死亡)，但却对哺乳动物小鼠具有很强的致病性(其能在小鼠除脑部之外的各个脏器有效复制，以肺组织内病毒滴度最高，并且能引起小鼠死亡[24])。在给小鼠鼻腔接种H9N2 AIV前，将原始病毒液经10日龄的SPF鸡胚培养24~72 h，收集鸡胚尿囊液，充分混匀后, 分装, 并于-80 ℃冰箱保存，待后续试验使用。通过使用MDCK(Madin-Darby canine kidney)细胞进行空斑形成试验测定保存的含H9N2 AIV尿囊液中的病毒滴度。测得其病毒滴度为1.4×108 PFU·mL-1。
1.1.2 实验动物 SPF级BALB/c小鼠，雄性，6~8周龄，体重为18~20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
1.1.3 主要试剂 生理盐水购自石家庄四药有限公司，异氟烷购自河北一品制药股份有限公司，DNA提取试剂盒购自Omega Bio-tek公司，FastPfu聚合酶购自北京全式金公司，2%琼脂糖凝胶购自Biowest公司，AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen Biosciences公司。
1.2 方法1.2.1 试验设计 将24只BALB/c小鼠随机分为2组，分别为对照组和感染组，每组12只。对照组小鼠鼻腔接种50 μL用生理盐水稀释60倍后的不含H9N2 AIV的尿囊液，感染组小鼠鼻腔接种50 μL用生理盐水稀释60倍后含有1.2×105 PFU H9N2 AIV的尿囊液。
1.2.2 鼻腔接种 接种时，用异氟烷麻醉小鼠后，取50 μL接种液置于小鼠鼻尖处，小鼠本能性吸入，然后将小鼠竖直放置1~2 min，以确保接种液进入下呼吸道。
1.2.3 粪便样本收集 考虑到哺乳动物肠道微生物的时间节律性变化，因此，应尽量在取材日的同一时间采样。在第0和33天收集对照组小鼠的粪便，在H9N2 AIV感染后第4、8、21和33天收集感染组小鼠的粪便，收集时避免尿液污染粪便。小鼠粪便收集后立即放入-80 ℃冰箱中保存待用。
1.2.4 DNA提取、PCR扩增和测序 根据试剂盒说明书进行粪便中总DNA提取。DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。之后用338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 引物对V3-V4可变区进行PCR扩增。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，再用Tris-HCl缓冲液洗脱，定量，Illumina MiSeq PE300测序(由上海美吉生物医药科技有限公司完成)，最后进行微生物多样性的生物信息分析。
1.3 统计分析试验结果以“x±sx”方式表示。体重数据用IBM SPSS Statistics 26.0软件进行统计分析；alpha多样性指数数据用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析；其余数据在美吉生物云平台进行统计分析。两组试验数据差异比较时使用unpaired Student’s t test或是Wilcoxon秩和检验，两组以上试验数据差异比较时使用one-way ANOVA，即单因素方差分析。P＜0.05表示差异显著，具有统计学意义。
2 结果 2.1 H9N2 AIV感染后小鼠体重变化BALB/c小鼠(6~8周龄)感染H9N2 AIV(1.2×105 PFU·只-1)后, 从第3天开始逐渐表现为精神沉郁，活动较少，被毛粗乱，失去光泽，弓背，扎堆等，在感染后第6天表现最为严重，但未有小鼠死亡，之后小鼠逐渐恢复至对照组小鼠的状态。体重方面，与对照组小鼠相比较，感染组小鼠在感染后第3天其体重就开始显著降低(P < 0.05)，至感染的第6天体重降至最低点(P < 0.001)，之后体重慢慢恢复，到第10天时已与对照组小鼠体重相比较差异不显著(图 1)。这说明通过给予BALB/c小鼠鼻腔接种1.2×105 PFU·只-1剂量的H9N2 AIV可使小鼠表现出感染症状，并使得小鼠体重短时间下降。
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***. P < 0.001 图 1 BALB/c小鼠感染H9N2 AIV后的体重 Fig. 1 Body weight of BALB/c mice infected with H9N2 AIV |
测序样本数为18个，分别是对照组小鼠在第0和33天的粪便样本和感染组小鼠在感染后第4、8、21和33天的粪便样本，每组各3个样本。总共测得原始序列1 452 493×2条，总碱基数为874 400 786 bp。优化序列后，有效序列数为849 528条，有效碱基数为370 810 923 bp，平均每条序列的碱基数约为436 bp。
2.3 对照组小鼠在第0、33天的肠道菌群alpha多样性比较alpha多样性是指样本群落内的物种多样性，其包含群落的两个方面信息: 1)群落丰富度(community richness)，即物种数目；2)群落多样性(community diversity)，其既包括物种数，也包括群落全部物种数量分配的均匀程度。描述群落丰富度的指数主要包括Sobs指数、Chao1指数和ACE指数等，其中，Sobs指数表征实际观测到的物种数，其值越大，表明对应的群落的丰富度越高；描述群落多样性的指数主要包括Shannon指数和Simpson指数等，其中Shannon指数越大，表明对应的群落的多样性越高。由表 1可知，对照组小鼠在第0、33天的肠道菌群的Sobs指数和Shannon指数都没有显著差异，说明对照组小鼠在第0、33天的肠道菌群的alpha多样性(即物种的数目)没有明显变化。
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表 1 对照组小鼠和感染组小鼠肠道菌群的alpha多样性指数比较 Table 1 Comparison of the alpha diversity index of the gut flora of control mice and infection mice |
可操作分类单元(operational taxonomic units, OUT)是将测序后得到的成千上万条序列(测序得到的每1条序列来自1个菌株)按照彼此的相似性分为的许多小组。1个小组就是1个OTU。因为16S rRNA基因的变异率在3%以内，因此，序列相似性超过97%就被认为是同一个物种。根据得到的样本群落中不同物种的丰度(序列数)数据，运用严格的统计学方法，对不同组微生物群落之间的物种进行假设检验，评估物种相对丰度差异的显著性水平，可获得在门、纲、目、科、属、种、OUT等不同分类水平的组间显著性差异物种。但由于16S rRNA的基因序列只是细菌基因组上极小的1段序列，利用16S rRNA的基因序列进行细菌分类鉴定只能鉴定到属水平。因此, 经16S rRNA基因的测序后，通常选择在门、属和OUT这3个分类水平上进行物种相对丰度的组间显著性差异检验。由图 2可知，对照组小鼠在第0、33天的肠道菌群各物种的相对丰度无论是在门水平、属水平上还是在OUT水平上都没有显著性差异。说明对照组小鼠在第0、33天的肠道菌群各物种的相对丰度没有明显变化。
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图 2 对照组小鼠在第0和33天的肠道菌群在门水平(A)、属水平(B)和OUT水平(C)上的物种相对丰度 Fig. 2 The relative abundance of gut bacterial species of the control group mice at day 0 and day 33 at the phylum level (A), genus level (B) and OUT level (C) |
从以上结果可知，对照组小鼠在第0、33天的肠道菌群群落结构是稳定的。因此，以对照组小鼠第0天的肠道菌群作为对照，再与感染组小鼠在感染后第4、8、21和33天的肠道菌群作比较。由表 1可知，Sobs指数和Shannon指数在对照组小鼠和感染后第4、8、21和33天的感染组小鼠之间均没有显著性差异。说明小鼠感染H9N2 AIV后第4、8、21和33天的肠道菌群的alpha多样性(即物种数)同样没有明显变化。
2.6 H9N2 AIV感染后小鼠肠道菌群的物种差异由图 3A可知，在门水平上，对照组小鼠肠道菌群和感染组小鼠在感染后第4、8、21和33天的肠道菌群中的厚壁菌门(Firmicutes)细菌和拟杆菌门(Bacteroidetes)细菌的相对丰度都存在显著性差异(P＜0.001)，具体表现为与对照组小鼠肠道菌群相比较，感染组小鼠肠道菌群中的厚壁菌门(Firmicutes)细菌相对丰度在感染后第4天时减少，之后逐渐增多；而拟杆菌门(Bacteroidetes)细菌的相对丰度在感染后第4天时增多，之后逐渐减少。由图 3B可知，在属水平上，相对丰度排名前15的菌属中，对照组小鼠肠道菌群和感染组小鼠在感染后第4、8、21和33天的肠道菌群中排名第1、2、3、10、11、12和15的菌属都存在显著性差异(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05，P＜0.001，P＜0.01)，分别为norank_f_Bacteroidales_S24-7_group、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Alistipes、Ruminococcaceae_UCG-014、Ruminiclostridium、Alloprevotella和Oscillibacter。由图 3C可知，在OUT水平上，相对丰度排名前15的OTU中，对照组小鼠肠道菌群和感染组小鼠在感染后第4、8、21和33天的肠道菌群中排名第1、3、6、11和14的OTU都存在显著性差异(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05，P＜0.001，P＜0.05)。此外，在OUT水平上进行PCoA分析(principal co-ordinates analysis)，可用来研究样本群落组成的相似性和差异性。PCoA图中的每个点代表 1个样本，相同颜色的点表示为同1组。图中两点之间的距离越近，表明相对应的两个样本之间的微生物群落结构相似度越高；反之，图中两点之间的距离越远，表明相对应的两个样本之间的微生物群落结构相似度越低。由图 3D(图中两点之间距离算法为unweighted_UniFrac)可知，对照组小鼠和感染组小鼠在感染后第4、8、21和33天的样本点可以明显区分开，而且采用相似性分析(ANOSIM)和非参数多元方差分析(Adonis)对组间差异进行检验，结果显示均有统计学意义：ANOSIM的R值为0.491 9，P值等于0.002，Adonis的R2值为0.413 2，P值等于0.001(ANOSIM中R值越接近1表示组间差异越大于组内差异；Adonis分析中R2值代表分组因素对样本差异的解释度，R2越大表示分组对差异的解释度越高；P值小于0.05说明本次检验的可信度高)。以上结果说明，小鼠感染H9N2 AIV后第4、8、21和33天的肠道菌群的群落结构发生了明显改变，并且在感染第33天后仍未恢复，而且这主要是由于各物种的相对丰度发生了明显改变。
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*.P < 0.05; **.P < 0.01; ***.P < 0.001 图 3 H9N2 AIV感染后小鼠肠道菌群在门水平(A)、属水平(B)和OUT水平(C)上的物种相对丰度以及PCoA分析(D) Fig. 3 The relative abundance of gut bacterial species of mice infected with H9N2 AIV at the phylum level (A), genus level (B) and OUT level (C) and principal co-ordinates analysis (D) |
机体处于健康状态时，肠道菌群与宿主间通过精密的调控机制处于动态平衡状态。本研究结果也表明对照组小鼠的肠道菌群的群落结构在33 d内是稳定的。而机体的内在因素(如遗传背景等)、外在因素(如饮食习惯、生活方式、药物的使用等)以及环境因素等都可影响肠道菌群的组成。近年来，越来越多的研究表明，肺部感染性疾病也可导致肠道菌群发生变化。例如，Hu等[15]研究发现，感染了肺结核分枝杆菌的病人其肠道菌群alpha多样性下降。Zuo等[17]研究则表明，新冠肺炎患者的肠道菌群的组成发生了显著变化，表现为条件致病菌增多，有益共生菌减少。此外，近些年来，已有多个研究表明流感病毒感染后可引起机体肠道菌群的变化。
Qin等[21]和Hu等[22]研究均发现感染了H7N9病毒的病人肠道菌群的Shannon指数降低，表明H7N9病毒感染人可导致肠道菌群的多样性降低。然而，本研究的结果表明，感染了H9N2 AIV的小鼠第4、8、21和33天时其肠道菌群的Shannon指数没有显著变化；Yildiz等[20]的研究结果同样表明，低致病性H5N1病毒(A/Viet Nam/1203/2004)感染小鼠第3、5、7、14和28天，小肠中菌群的Shannon指数没有明显变化，表明H9N2 AIV和低致病性H5N1病毒不导致小鼠肠道菌群的多样性发生明显改变。
小鼠和人肠道菌群在门水平上是相似的，均以厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)这两大类细菌为主。而当使用抗生素等原因导致菌群失调时，变形菌门(Proteobacteria)细菌的相对丰度就会增加[25-26]。Qin等[21]研究表明，感染了H7N9病毒的病人其肠道菌群中拟杆菌门细菌的相对丰度减少而变形菌门细菌的相对丰度增加。Deriu等[19]研究同样表明，H1N1病毒(A/Puerto Rico/8/34)感染小鼠9 d后，小鼠肠道菌群中拟杆菌门细菌(如分节丝状菌)的相对丰度减少，而变形菌门细菌(如肠杆菌科细菌)的相对丰度增加。类似地，Wang等[27]研究表明，感染了H1N1病毒(A/Puerto Rico/8/34)的小鼠，感染7 d后肠道菌群中厚壁菌门的乳酸杆菌和拟杆菌门的分节丝状菌的丰度减少，而变形菌门肠杆菌科的细菌(特别是大肠杆菌)的丰度增多。然而，Yildiz等[20]研究则表明，低致病性的H5N1病毒(A/Viet Nam/1203/2004)感染小鼠后粪便中的菌群没有明显变化，而其小肠中的菌群发生了明显改变；感染7 d后，小肠中的厚壁菌门细菌的相对丰度增加，而拟杆菌门细菌的相对丰度减少。本研究结果则表明，H9N2 AIV感染小鼠第4、8、21和33天小鼠肠道菌群中的厚壁菌门细菌相对丰度先减少后逐渐增多，拟杆菌门细菌的相对丰度则先增多后逐渐减少，而变形菌门细菌的相对丰度则没有明显改变。综上可知，流感病毒可引起肠道菌群发生改变，并且这种改变与感染的流感病毒亚型、感染对象(人和小鼠)、取样部位(粪便和小肠)和时间等有关。
拟杆菌门细菌相对丰度的增加与体重的降低有一定的相关性，肥胖人群进行低卡路里饮食后，其体重下降，肠道中拟杆菌门细菌的相对丰度也逐渐增加[28]。本研究结果表明，小鼠感染H9N2 AIV后其体重从第3天就开始显著降低，而在第4天时其肠道菌群中的厚壁菌门细菌相对丰度减少而拟杆菌门细菌的相对丰度增多，这也佐证了拟杆菌门细菌相对丰度增加与体重降低的相关性。此外，大多数拟杆菌门细菌对pH较敏感，并且在酸性环境中几乎不能增殖，厚壁菌门细菌则与之相反[29]，而炎症反应的发生可以降低相应部位的pH[30]。因此，当发生炎症反应时，可使厚壁菌门细菌的相对丰度增多，而拟杆菌门细菌的相对丰度减少。本研究结果表明，小鼠感染H9N2 AIV第8天后肠道菌群中的厚壁菌门细菌相对丰度逐渐增多，而拟杆菌门细菌的相对丰度则逐渐减少，这可能与H9N2 AIV的肺部感染导致肠道中炎症反应的发生有关。本实验室之前的研究表明，H9N2 AIV感染小鼠7 d后可引起小鼠肠道损伤[31]。Wang等[27]研究表明，小鼠感染H1N1病毒(A/Puerto Rico/8/34)后的第7、9天都发生了肠道损伤，而且这主要是由于TH17细胞免疫反应增强，分泌大量的IL-17A导致的。因此, H9N2 AIV感染后期引起的肠道部位炎症反应的发生有可能使得肠道的pH降低，进而使得肠道菌群中厚壁菌门细菌相对丰度增加而拟杆菌门细菌相对丰度减少。另外，Sencio等[32]研究表明，小鼠感染流感病毒(H3N2和H1N1)后，由于其采食量降低，改变了小鼠的肠道菌群的组成以及减少了肠道菌群产生的短链脂肪酸，进而通过降低肺泡巨噬细胞的杀菌活性来促进肺炎链球菌的继发感染。本研究结果表明，H9N2 AIV可导致小鼠肠道菌群群落结构的改变，也有可能促进细菌的继发感染，这有待于后续试验证实。
鉴于流感病毒感染可改变肠道菌群的稳态，而且肠道菌群稳态的破坏使得机体肺部抵抗力降低，可以考虑将可恢复肠道菌群稳态从而提高肺部抵抗力的方法(如补充益生菌等)作为预防和治疗流感病毒感染的辅助手段。Zhang等[33]研究表明，小鼠感染H7N9病毒后可通过增加肠道内的动物双歧杆菌等细菌的数量从而促进辅酶A等的生物合成来抵抗流感病毒感染，而且通过灌胃补充双歧杆菌可以提高小鼠对流感病毒感染的抵抗力。因此，通过将16S rRNA基因的测序结果与其他组学(如宏基因组学、蛋白质组学和代谢组学等)的结果联合分析，明确是哪一类细菌及其代谢产物在疾病的发生发展过程中起作用，之后针对其进行补充或是阻断，就可以更好地预防和治疗疾病。
4 结论H9N2 AIV感染可引起BALB/c小鼠肠道菌群的群落结构发生明显改变，并且在感染33 d后仍未恢复，而且这主要是由于各物种的相对丰度发生了明显改变，在门水平上主要表现为H9N2 AIV感染后小鼠肠道菌群中的厚壁菌门细菌相对丰度先减少后逐渐增多，而拟杆菌门细菌的相对丰度则先增多后逐渐减少。
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