2. 阿坝藏族羌族自治州动物科学技术研究所, 红原 624400;
3. 西南民族大学畜牧兽医学院, 成都 610041
2. Institute of Animal Science and Technology of Aba Tibetan and Qiang Autonomous Prefecture, Hongyuan 624400, China;
3. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China
嵴病毒(kobuvirus, KoV)是小RNA病毒科一个新的属。2019年，国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)根据KoV的Polyprotein、P1、2C和3CD区氨基酸相似性进一步将其划分为Aichivirus A~F 6个种以及未分类的挪威鼠嵴病毒、灰松鼠嵴病毒和蝙蝠嵴病毒3个种[1]。其中，Aichivirus A成员的人爱知病毒，Aichivirus B成员的牛嵴病毒和Aichivirus C成员的猪嵴病毒为腹泻病原[2-6]。另外Aichivirus A成员的猫嵴病毒和犬嵴病毒也与腹泻相关[7-8]。
目前，在羊中发现了两种不同种的KoVs：绵羊嵴病毒(ovine kobuvirus, OKoV)和山羊嵴病毒(caprine kobuvirus, CKoV)，OKoV是Aichivirus B的成员，而CKoV是Aichivirus C的成员[1]。OKoV首次在匈牙利绵羊的健康粪便样本中检测到[9]，随后在巴西绵羊的健康、腹泻粪便样本和爱尔兰绵羊肠系膜淋巴结中都检测到了OKoV[7, 10]。而CKoV最早是在韩国黑山羊的腹泻粪便样本中检测到[11-12]，随后又在意大利山羊的健康和腹泻粪便样本中检测到[13]，2019年，ICTV将CKoV确定为Aichivirus C成员[1]。最近本实验室在四川某地山羊腹泻山羊粪样本中检测到CKoV，证实了该病毒在国内的存在，并获得一个近似完整的基因组[14]。此外，在意大利鹿的粪样中也检测到CKoV[15]，表明其可能具有跨种间传播的能力。到目前为止，国内外CKoV流行病学资料仍然匮乏，并且缺乏合适的分离CKoV的细胞培养体系，因此该病毒对山羊的致病性仍不清楚。
目前，GenBank数据库中有3个CKoV基因组序列，包括本实验室上传的1个中国毒株。病毒基因组由末端结合蛋白(vpg)、5′端非编码区(5′UTR)、1个开放阅读框(ORF)以及3′端非编码区(3′UTR)和聚(A)尾组成。3D基因是KoV最为保守的基因，常作为KoV的分子检测的靶基因[16-20]。目前关于CKoV的分子检测方法有3篇报道[11, 13, 21]，其中两篇是通过最为保守的3D基因设计的KoV通用引物，通过PCR产物测序来鉴定种，其特异性和检测效率有待于进一步评价。而特异性检测CKoV的分子检测方法只有1篇RT-PCR方法的报道[13]，还未见实时荧光定量PCR检测方法的报道。尽管KoV 3D基因保守，但也存在遗传多样性，并表现出一定的地域特征[22]。目前，GenBank中CKoV 3D基因序列信息不多，只有3个完整的CKoV 3D基因和11个国外毒株的CKoV 3D基因片段。3个完整的CKoV 3D基因核苷酸之间的相似性为92.5%~94.4%，而11个CKoV 3D基因片段核苷酸之间的相似性为68.5%~98.4%，表明CKoV 3D基因存在遗传多样性。本试验的目的是建立基于3D基因特异性检测CKoV的实时荧光定量PCR方法，并调查CKoV在国内的流行情况。
1 材料与方法 1.1 羊常见病原核酸和临床样本A群羊轮状病毒(ovine rotavirus，ORoV)、羊肠道病毒(caprine enterovirus, CEoV)、羊星状病毒(caprine astrovirus，CAoV)、牛星状病毒(bovine astrovirus, BAoV)、牛冠状病毒(bovine coronavirus, BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)、山羊源产肠毒素大肠杆菌ETEC K99、山羊源沙门菌(Salmonella) CVCC528、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis ) CVCC3847、山羊源志贺菌(Shigella) CVCC1881菌株、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、粪肠球菌(Enterococcus faecium)的核酸样本，均由西南民族大学动物医学实验室保存并提供。
24份山羊(3月龄以内)腹泻粪样本，于2019年1—12月采自四川成都3个山羊养殖场，用于比较检测方法，由西南民族大学动物医学实验室保存。79份山羊(3月龄以内)腹泻粪样本，于2020年1—4月分别采自西南地区3个省市山羊养殖场，其中四川7个场39份、重庆6个场35份、云南2个场5份，用于流行病学调查。所有样本于-80 ℃保存备用。
1.2 主要试剂及仪器Quick Taq HS DyeMix购自TOYOBO东洋纺生物科技有限公司；Prime ScriptTM RT试剂盒为大连宝生物工程有限公司产品；pMD19-T载体、DH5α感受态细胞、DNA Marker Ⅰ、Tirzol试剂盒(RNAiso Plus)、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ等购自TaKaRa公司；核酸染料GoldenView购自西安赫特生物；Gel Extraction Kit胶回收试剂盒、Plasmid Mini kit质粒小量提取提取试剂盒均为OMEGA公司产品。Doc2000凝胶成像系统为美国Bio-Rad公司产品；荧光定量PCR仪为中国BIOER产品)；Cary50Probe紫外分光光度计为美国Vatian公司产品；TGL-16高速冷冻离心机为中国蜀科公司产品。
1.3 引物设计与合成查询并下载GenBank收录的CKoV 3D基因序列，共计11个部分3D基因和3个完整的3D基因。利用MEGA10.0软件分析比对3D基因，采用Primer Premier 5.0软件设计引物(表 1)，本研究预期目的片段为176 bp，位于6 874—7 049 nt(GenBank收录号MT584793)。由上海生工生物工程有限公司负责相关引物合成。
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表 1 4种RT-PCR方法的引物信息 Table 1 Primers informations for four kinds of RT-PCR assays |
按粪便样品∶灭菌PBS(pH 7.2)体积比1∶5制备粪悬液。粪悬液于-80 ℃反复冻融3次，8 000 r·min-1 4 ℃离心10 min，取上清，经0.22 μm一次性滤器过滤后再取上清300 μL，用TrizolTM Reagent试剂盒提取样本总RNA[23]。提取的RNA用Prime Script TMRT试剂盒反转录成cDNA，酚－氯仿法提取DNA[23]，-20 ℃保存备用。
1.5 阳性标准品的制备以CKoV SWUN/F11/2019毒株的cDNA为模板，用自行设计的特异性引物CKoV F/R(表 1)进行RT-PCR扩增。采用25 μL反应体系：CKoV F和CKoV R各1.0 μL，模板1.5 μL，EmeraldAmp PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O补足至25 μL。反应条件同文献[23]“阳性标准品的制备”。反应结束后，3.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定产物。鉴定正确后，胶回收扩增产物并连接至pMD19-T，后续操作同文献[23]。最后提取重组质粒，送生工生物有限公司测序，以测序结果正确的重组质粒作为阳性标准品。用紫外分光光度计检测上述阳性标准品的浓度，并按照以下公式换算为拷贝数，拷贝数(copies·μL-1)=(6.02×1023copies·mol-1)×(浓度μg·mL-1)×10-9/(分子质量g·mol-1)。
1.6 反应体系及条件的优化1.6.1 退火温度的优化 采用20 μL体系：CKoV阳性标准品1.5 μL，TB Green Premix Ex Taq II 10 μL, 上、下游引物各0.5 μL, dd H2O至20 μL。优化判断标准以最小Ct值、最大产物荧光值、特异性单峰等作为指标，选择50~60 ℃对退火温度进行10个梯度的优化。
1.6.2 引物用量的优化 采用“1.6.1”的反应体系以及最佳退火温度，选择0.5~1.5 μL间的8个梯度对引物(浓度为10 mol·L-1)的用量进行优化。
条件优化后即建立基于TB Green的检测CKoV核酸的实时荧光定量PCR方法。
1.7 熔解曲线分析和标准曲线的建立10倍递增稀释CKoV阳性标准品。用“1.6”建立的实时荧光定量PCR方法分别对10-1~10-10递增稀释的标准品进行检测，同文献[23]方法制作标准曲线，并按照以下公式计算出扩增效率，扩增效率(E)=10-1/斜率-1。
1.8 实时荧光定量PCR方法的评价1.8.1 特异性评价 用建立的实时荧光定量PCR方法对常见羊病病原的核酸样本进行检测，以RNase Free ddH2O作为阴性对照。
1.8.2 稳定性评价 分别取等量的2.23×104、2.23×105和2.23×106copies·μL-1的重组质粒，按上述方法进行实时荧光定量PCR扩增，每份样品设3个重复，进行批内重复性试验；同取以上3份样品，在相同反应条件下进行3次独立的检测，进行批间重复性试验。
1.8.3 敏感性测定 以101~1010稀释度的标准品为模板，以RNase Free ddH2O为阴性对照，按上述方法进行实时荧光定量PCR扩增，每个浓度设3个重复。
1.8.4 4种方法的比较 采用所建立的实时荧光定量PCR方法和常用于检测KoV的3种RT-PCR方法[11, 13, 21]分别平行对24份山羊腹泻粪样本进行检测，比较其检出率，引物信息见表 1，全部的阳性PCR产物送生工生物有限公司测序。
1.9 临床样本中CKoV的检测利用本试验建立的实时荧光定量PCR方法对79份山羊腹泻粪样本进行CKoV的检测，从阳性样本中随机挑选20%进行测序，以验证检测结果的正确性。
1.10 CKoV完整的3D基因序列扩增及分析自行设计2对引物分段扩增完整的3D基因，引物序列如下，F1: 5′-CGTTGTCGGCTCTTCTGGCTTCT-3′, R1: 5′- CTATGCGAAAAGCACA- GGAGGGA-3′; (6 500—7 329 nt, GenBank收录号：MT584793); F2′: 5′-GTGACGGCGGGAC-TTACCAGAG-3′; R2: 5′- GGGTGAAACGCCTGGGAAGAG-3′ (7 083—8 078 nt, GenBank收录号：MT584793)，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。分段扩增CKoV阳性样本3D基因，扩增的目的片段经胶回收，连接至pMD19-T载体后，转化到E. coli DH5α感受态细胞中，提取质粒送往上海生工生物有限公司测序。
使用SeqMan software软件拼接3D基因序列，使用DNASTAR7.0软件中的MEGAlign程序测定核苷酸序列和推断氨基酸序列的相似性，使用MEGA 7.0软件以Neighbor-Join法(Bootstrap值为1 000)构建系统进化树。
2 结果 2.1 引物的特异性验证用自行设计的特异性引物从SWUN/F11/2019毒株cDNA中扩增出预期大小的目的片段(图 1)，测序结果证明目的片段长度为176 bp，符合预期结果，与GenBank中CKoV 3D基因的相似性为100%，为CKoV 3D基因的特异序列。
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M. DNA相对分子质量标准; －.阴性对照；+.阳性样品 M. Gene ruler ultra-low range DNA ladder; －. Negative control; +. CKoV positive sample 图 1 引物扩增片段电泳鉴定 Fig. 1 Gel electrophoresis of amplification fragment by specific primers |
优化后的20 μL反应体系：上、下游引物各0.5 μL，模板1.5 μL，TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，ddH2O补至20 μL。
优化后的反应条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s，40个循环；熔解段95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s，循环1次，反应结束。
2.3 标准曲线及熔解曲线紫外分光光度计测得阳性标准品的浓度为70 ng·μL-1，换算后相应拷贝数为2.23×1010copies·μL-1。按照优化后的反应条件进行反应，本试验建立的方法在阳性模板浓度为2.23×102~2.23×108 copies·μL-1之间呈现良好的线性关系(图 2 A)，标准曲线为y=-3.110 6x + 38.09，相关系数R2值为0.999 2，扩增效率为110%。结果说明该方法线性关系良好、扩增效率好。熔解曲线结果(图 2 B)显示，PCR产物在87 ℃左右均出现单一波峰，无引物二聚体和非特异扩增峰。用本试验设计的检测引物对同一模板的3次重复检测结果一致，证明该方法有良好的重复性(结果未展示)。
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图 2 CKoV real-time PCR检测方法的标准曲线(A)及熔解曲线(B) Fig. 2 Standard curve (A) and melting curve (B) of real-time PCR for CKoV |
本试验建立的实时荧光定量PCR方法仅对CKoV具有良好的扩增曲线，不扩增其他无关病原(图 3)。
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1.CKoV标准品模板；2~13. ORoV、CEoV、CAoV、BAoV、BVDV、BCoV、ETEC K99、山羊源沙门菌、奇异变形杆菌、山羊源志贺菌、枯草芽胞杆菌、粪肠球菌；N. 阴性对照 1. CKoV positive samples; 2-13. ORoV, CEoV, CAoV, BAoV, BVDV, BCoV, ETEC K99, Salmonella, Proteus mirabilis, Shigella, Bacillus subtilis, Enterococcus faecium; N. Negative control 图 3 实时荧光定量PCR的特异性 Fig. 3 The specificity test of the real time fluorescent quantitative PCR |
本次所建立的实时荧光定量PCR方法批内变异系数CV为0.56%~0.87%，批间变异系数为0.43%~0.86%(表 2)，表明该方法的检测稳定性良好。
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表 2 实时荧光定量PCR方法的稳定性(n=3) Table 2 Stable test of real time fluorescent quantitative PCR (n=3) |
将2.23×1010 copies·μL-1标准阳性质粒作10倍递增稀释，以101~1010稀释度的标准品为模板进行实时荧光定量PCR检测，同时以等量RNase Free ddH2O代替模板作为阴性对照。结果显示，101~109稀释度范围内均具有特异性扩增曲线，该方法所能检出的最低拷贝数为22.3 copies·μL-1(图 4)。
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1~10.2.23×109~2.23×100；N. 阴性对照 1-10.2.23×109~2.23×100; N. Negative control 图 4 实时荧光定量PCR的敏感性 Fig. 4 The sensitivity test of the real time fluorescent quantitative PCR |
4种检测方法对24份山羊腹泻粪样本中CKoV的检测结果见表 1，本试验所建方法的检出率明显高于文献里其他3种方法(P < 0.05)，且作者建立方法检出的阳性样本包括了其他3种方法所检出的所有阳性样本。本方法检出的全部阳性样本的PCR产物经测序证实均为CKoV的目的基因片段。
2.8 山羊腹泻粪样本中CKoV的检出率对79份山羊腹泻粪样本的检测结果显示，CKoV平均阳性率为25.3%，平均场阳性率53.3%。四川山羊粪样本中CKoV的检出率为30.84%，场阳性率为57.1%；重庆山羊粪样本中CKoV的检出率为8.6%，场阳性率为33.3%；云南山羊粪样本中CKoV的检出率为100%，场阳性率为100%。随机挑选的20%阳性PCR产物经测序证实均为目的片段，进一步证明该方法检测结果的准确性。
2.9 CKoV 3D完整基因的克隆从四川和云南共5个山羊养殖场的CKoV阳性粪样本中成功克隆出大小为1 404 bp的13个完整的3D基因，编码468个氨基酸(GenBank登录号: MW187484~MW187496)。这13个3D基因间的核苷酸相似性为99.6%~100%，氨基酸相似性为99.6%~100%，与GenBank中的仅有的3个CKoV完整的3D基因核苷酸相似性为92.3%~100%，氨基酸相似性为98.5%~100%，与GenBank中11个CKoV 3D基因片段的相似性为70.1~ 92.9%，氨基酸相似性为83.6~98.4%。
系统发育分析表明，这13株CKoV 3D基因与GenBank中唯一的中国CKoV毒株的3D基因共同聚为单独的一个大支(图 5)，表明了国内CKoV 3D基因具有独特的进化趋势。与GenBank中另外2个CKoV完整的3D基因序列相比，14个中国毒株的完整3D基因序列有59个共同的核苷酸突变，其中9个为有义突变，导致了3个氨基酸的突变(E43G、D252E和T368S)。
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●.本研究毒株；▲.本实验室前期克隆的1个中国毒株 ● marks the strain in this study, ▲ marks the Chinese strain previously cloned in our laboratory 图 5 CKoV完整3D基因的邻近法演化树 Fig. 5 Neighbor-joining consensus tree for CKoV complete 3D gene |
KoV是人和多种动物的腹泻病原[2, 4-5, 18-19]，常用的KoV检测方法的靶基因均为3D基因[8, 24-26]。尽管3D基因在KoV成员中相对保守，但也存在遗传多样性，并表现出一定的地域特征[22, 24]。研究表明KoV 3D基因核苷酸的平均替换率为2.64×102替换·(位点·年)-1 [27]。目前检测CKoV的方法有3篇文献报道[11, 13, 21]。Melegari等[13]以3D基因为靶基因的特异性检测CKoV的RT-PCR方法，该RT-PCR方法的上游引物(21个碱基)扩增位点在国内唯一上传的1个完整CKoV 3D基因序列的第4位发生突变(T→C)，而下游引物(22个碱基)扩增位点在第2、5、17位发生突变(C→T，G→C，C→T)，这些碱基突变很可能会影响扩增效率。Lee等[11]以人爱知病毒毒株AiV-1和牛嵴病毒毒株U-1共保守的3D基因设计引物的RT-PCR方法，Reuter等[21]以人爱知病毒毒株AiV-1和牛嵴病毒毒株U-1以及猪嵴病毒S-1-HUN共保守的3D基因设计引物的RT-PCR方法，这两种方法通用引物的扩增位点均与我国毒株不完全匹配，并且均需PCR测序来鉴定种，其特异性也需要进一步验证。本研究根据CKoV流行毒株的3D基因建立了实时荧光定量PCR方法，具有良好的特异性、灵敏性和稳定性，与国外上述3种检测CKoV的RT-PCR方法相比，极大地提高了临床样本中CKoV的检出率，为CKoV的检测和流行病学调查提供了新的技术手段。
CKoV作为山羊新发病毒，其流行病学资料仍然匮乏。本试验用建立的实时荧光定量PCR方法对2020年1—4月四川、云南和重庆共15个山羊养殖场的79份山羊腹泻粪样本进行了检测，山羊CKoV的检出率为25.31%，场阳性率为53.3%，证明该病毒已在上述地区山羊中广泛流行。由于临床样本均来自于山羊腹泻粪样本，未采集山羊健康粪样本作对照，所以CKoV与腹泻之间的关系还需要进一步调查。尽管CKoV的致病性不清楚，但多种KoVs，如人爱知病毒、牛嵴病毒和猪嵴病毒等是导致动物腹泻的重要病原，因此有必要扩大样本进一步调查CKoV在国内的流行情况以及与山羊腹泻间的联系。
目前，GenBank中有3个完整的3D基因，包括本实验室前期上传的1个中国毒株。本研究成功获得了13个国内流行毒株完整的3D基因序列，为CKoV的检测方法的建立和遗传进化分析提供了基础数据。进化分析已有的14个中国毒株完整3D基因的序列，发现这些毒株共同聚为单独的一个大支，与国外毒株具有显著的遗传距离，说明中国毒株具有独特的进化趋势(图 5)，这可能与地域、环境和自然选择模式等压力有关[22, 27]。3D基因编码区含有高度保守的氨基酸序列KDELR、YGDD和FLKR，作为病毒依赖RNA的聚合酶在KoV增殖中起关键作用[28]。14个中国株的完整3D基因编码的氨基酸序列与GenBank中另外2个国外3D氨基酸序列相比，有3个共同的氨基酸突变，但它不在RNA的聚合酶区域，这种独特的氨基酸突变是否会影响3D基因的分子功能需要进一步研究。
4 结论作者基于3D基因成功建立了特异性检测CKoV的实时荧光定量PCR方法，特异性和重复性好，灵敏性高，为CKoV的检测和流行病学调查提供了新的技术手段。并且，CKoV已在四川、云南和重庆3省腹泻山羊中广泛流行，其3D基因具有独特的进化趋势。
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