, SHI Zhengwang, YANG Bo, MA Yuan, LUO Juncong, WAN Ying, SONG Rui, TIAN Hong
, ZHENG Haixue
非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的猪的一种高度致死性出血性疾病，病程短，死亡率高。世界动物卫生组织将其列为必须报告类疾病，我国将其列为一类动物疫病[1]。20世纪中叶之前，该病一直局限于非洲，之后逐步向欧洲蔓延[2]。2007年，随着Ⅱ型ASFV进入高加索地区，疫情逐渐扩散至俄罗斯及东欧地区[3-4]，2018年8月，在我国辽宁省沈阳市首次发现该病，在1年时间内传播至我国32个省份，对我国养猪业造成重创[5-7]。除我国外，蒙古、越南、柬埔寨、老挝、朝鲜、菲律宾等国家也陆续出现非洲猪瘟疫情[8]，该病毒几乎造成了全球性蔓延。
ASFV是一种具有囊膜的双链DNA病毒[9]，其传染性和稳定性强，可通过受感染的猪肉制品和一些污染品进行传播，具有显著的接触传播特性[10-12]。目前国内外无有效的商品化疫苗防控ASFV[13]，短期内依靠早期诊断与区域化防控管理来进行防治，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制了该病毒的基因缺失苗，但该疫苗目前只取得了实验室阶段成果[14]，因此，建立该病的快速准确诊断方法是控制该病的重要前提，而诊断方法的建立则与抗体的研发密不可分。
抗体是机体免疫系统中重要的免疫分子，也是疫苗和诊断试剂中的核心成分。传统的抗体多为单克隆抗体，产量高、特异性强，一度成为生物制剂中的重要组成部分[15]。ASFV具有庞大的基因组，约编码150多个蛋白质[16]，依据主要衣壳蛋白P72，又分为24种基因型[17-18]，传统的单克隆抗体已不足以应对此病毒，因此迫切需要一种安全有效的新型抗体。单链抗体(ScFv)是近些年生物领域里发展快速的一种新型抗体，只含有重链可变区与轻链可变区，由一段Linker序列连接，因此比常规抗体分子量小很多，是一种具有巨大治疗和诊断潜力的分子[19-20]。1996年，Mason等[21]首次报道了A12型口蹄疫病毒ScFv，自此，开启了ScFv的发展历程，后续研制出了ScFv多聚体、双特异性ScFv等多种形式抗体[22]。ScFv因其独特的分子结构而具有广泛的应用价值：较小的分子量使其具有很好的穿透性，易携带靶向药物进入细胞内部，从而为肿瘤诊断与治疗开辟了新的途径[23-24]；双特异性ScFv是一类可以同时特异性结合两种不同抗原的人工改造抗体，将其应用到诊断技术上，可以拓展检测宽度，提高检测灵敏度；ScFv作为一种人工合成的基因工程抗体，一方面易于进行分子的改造，可直接对靶细胞产生杀伤作用[25-26]；另一方面可以在原核表达系统中大量生产，极大地缩短抗体制备周期。ScFv最突出的特点是克服了传统单克隆抗体鼠源性强的特点，消除了抗体应用上的异源性反应，扩宽了抗体的应用范围。综上所述，它独特的生物学特性与广泛的应用前景，使其有望成为科研攻坚上的新型利器。
本研究通过分离ASFV感染康复猪外周血淋巴细胞，扩增猪源ScFv基因，制备了一种分子量小、灵敏度高的抗ASFV单链抗体，为ASFV诊断提供新型原材料。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 材料与试剂 LTS1110猪外周血淋巴细胞分离液Kit购自天津灏洋生物制品公司；pMDTM20-T载体、E. coli JM109感受态、PrimeSTARⓇ HS DNA Polymerase、RNase-free Water、DL2000 DNA Marker、6×Loading Buffer均购自宝生物公司；Unstained protein MW marker(26610)、Unstained protein MW marker(26616)、6×His Tag Monoclonal Antibody(HIS.H8), HRP、6x-His Tag Monoclonal Antibody (HIS.H8), Alexa Fluor 555均购自Thermo Fisher Scientific公司；Goat Anti-Pig IgG H&L (HRP) (ab6915)购自Abcam公司；BL21(DE3)感受态购自北京全式金；Trizol、镍柱亲和层析树脂、DNA片段回收试剂盒和质粒提取试剂盒为OMEGA产品；分子生物学试剂来自Sigma公司；其他生化试剂均为国产分析纯；ASFV感染康复猪、ASFV阴阳性血清及ASFV CN/GS/2018分离株均由国家非洲猪瘟区域实验室(兰州)提供。
1.1.2 引物设计 根据GenBank上收录的猪IgG重链(AK405798)、轻链Kappa链(EU683881)、轻链Lamda链(AF345512)基因序列，参考文献设计扩增猪IgG可变区的引物。引物序列如表 1所示，其中VH-F1、VH-R1，VLκ-F1、VLκ-R11、VLκ-R12、VLκ-R13, VLλ-F1、VLλ-R1用于第1轮扩增；VH-F1、VH-R2，VLκ-F2、VLκ-R11、VLκ-R12、VLκ-R13，VLλ-F2、VLλ-R1用于第2轮扩增；VH-F1、VLλ-R1、VLκ-R11、VLκ-R12、VLκ-R13用于第3轮扩增。引物由大连宝生物有限公司合成。
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表 1 重链及轻链目的片段扩增引物 Table 1 Primers set used for heavy and light chain variable genes amplification |
1.2.1 猪外周血淋巴细胞提取 采集ASFV感染康复猪的外周血，用LTS1110猪外周血淋巴细胞试剂盒进行猪外周血淋巴细胞的分离：①向外周血中加入等量全血稀释液，混匀。②离心管中量取与稀释后血液等量的分离液，将稀释后血液缓慢加入，使其平铺于分离液液面，1 800 r·min-1，水平离心30 min。③小心吸取第二层白色淋巴细胞，加入10 mL清洗液，1 500 r·min-1水平离心10 min。④弃上清，以5 mL清洗液重悬，1 500 r·min-1水平离心10 min。⑤弃上清，以1 mL RNA Later保存液重悬，置-80 ℃保存备用。
1.2.2 淋巴细胞总RNA提取 采用Trizol试剂提取法提取淋巴细胞总RNA，经Thermo公司的Thermo Nano Drop One检测，所提取的总RNA浓度为356 ng·μL-1，OD260 nm /OD280 nm为1.87。
1.3 抗体可变区基因的扩增1.3.1 VH基因及VH-Linker基因扩增 以提取的淋巴细胞总RNA为模板，反转录得到全基因组cDNA。以cDNA为模板，VH-F1和VH-R1为引物，扩增VH基因。反应程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s、52 ℃ 5 s、72 ℃ 30 s、30个循环；72 ℃ 10 min；将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，纯化收集VH。
以VH基因为模板，VH-F1和VH-R2为引物，扩增VH-Linker基因。反应程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s、56 ℃ 5 s、72 ℃ 30 s、35个循环；72 ℃ 10 min；将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，纯化收集VH-Linker。
1.3.2 VLλ基因及Linker-VLλ基因扩增 以cDNA为模板，VLλ-F1和VLλ-R1为引物，扩增VLλ基因。反应程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s、53 ℃ 5 s、72 ℃ 30 s、30个循环；72 ℃ 10 min；将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，纯化收集VLλ。
以VLλ基因为模板，VLλ-F2和VLλ-R1为引物，扩增Linker-VLλ基因。反应程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s、68 ℃ 30 s、35个循环；72 ℃ 10 min；将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，纯化收集Linker-VLλ。
1.3.3 VLκ基因及Linker-VLκ基因扩增 以cDNA为模板，VLκ-F1和VLκ-R11、VLκ-R12、VLκ-R13为引物，扩增VLκ基因。反应程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，54 ℃ 5 s, 72 ℃ 30 s, 30个循环；72 ℃ 10 min；将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，纯化收集VLκ。
以VLκ基因为模板，VLκ-F2和VLκ-R11、VLκ-R12、VLκ-R13为引物，扩增Linker-VLκ基因。反应程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，68 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min；将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，纯化收集Linker-VLκ。
1.3.4 ScFv(VH-Linker-VL)基因扩增 分别以VH-Linker和Linker-VLλ、VH-Linker和Linker-VLκ为模板，以VH-F1、VLλ-R1和VH-F1、VLκ-R11、VLκ-R12、VLκ-R13为引物，通过SOE-PCR技术扩增拼接VH-VLκ和VH-VLλ。反应程序如下，①无引物：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，68 ℃ 30 s，10个循环；72 ℃ 10 min。②有引物：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s、55 ℃ 5 s，72 ℃ 50 s，35个循环；72 ℃ 10 min。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，纯化收集VH-VLκ和VH-VLλ。
1.4 T-A克隆鉴定及pET-30a-ScFv质粒的构建将ScFv(VH-VL)基因连接至pMDTM20-T载体上，进行质粒PCR鉴定，取PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，挑选条带大小合适的质粒送测序。对测序结果进行比对分析，挑选正确的基因序列送武汉金开瑞公司进行pET-30a-ScFv质粒的构建。
1.5 ScFv抗体的表达与纯化将构建成功的pET-30a-ScFv质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞，每50 μL感受态细胞分别转化1 μL pET-30a-ScFv质粒，将转化的菌液均匀涂布于LB-K+平板上，37 ℃倒置培养12~16 h直至单克隆出现，挑取单克隆菌落于LB-K+液体培养基中，37 ℃诱导表达抗体蛋白，对表达的抗体蛋白进行收集、洗涤、纯化，即得抗ASFV ScFv抗体。
1.6 VH-VLλ11抗体ELISA活性鉴定1.6.1 VH-VLλ11包被检测板鉴定ASFV 取纯化的ScFv抗体VH-VLλ11(0.1 mg·mL-1)，按照1∶4的比例包被检测板，包被完成后，加入50 μL灭活ASFV，37 ℃温箱孵育30 min，250 μL PBST洗涤液洗涤4次，拍干，分别加入50 μL 1∶5稀释的ASFV阳性血清2孔、1∶5稀释的健康猪血清2孔、血清稀释液2孔，37 ℃温箱孵育30 min，250 μL PBST洗涤液洗涤4次，拍干，加入50 μL 1∶15 000稀释的HRP标记的猪二抗，37 ℃温箱孵育30 min，250 μL PBST洗涤液洗涤4次，拍干，加入50 μL TMB底物溶液，37 ℃温箱孵育15 min，加入50 μL终止液(H2SO4)，在分光光度仪上读取反应物的OD450 nm值。
1.6.2 ASFV抗原包被检测板鉴定VH-VLλ11 取P73兔抗1∶1 000包被检测板，4 ℃包被12 h后弃掉，PBST洗涤4次，拍干，再加入1∶1稀释的ASFV全病毒抗原，包被完成后，分别加入50 μL 1∶16稀释的VH- VLλ11抗体蛋白(0.4 mg·mL-1)、稀释液各2孔，37 ℃温箱孵育30 min，250 μL PBST洗涤液洗涤4次，拍干，加入50 μL 1∶5 000稀释的兔抗猪HIS-HRP，37 ℃孵育30 min，250 μL PBST洗涤液洗涤4次，拍干，加入50 μL TMB底物溶液，37 ℃孵育15 min，加入50 μL终止液(H2SO4)，于酶标仪上读取OD450 nm值。
1.7 VH-VLλ11抗体间接免疫荧光试验以ASFV接种猪PAMS细胞，同时设立阴性对照，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，0.1% Triton-100室温透膜15 min，PBS洗3次，再以5% Blocker BSA室温封闭15 min后，加入VH-VLλ11抗体(1∶200)4 ℃孵育过夜，PBS洗3次，6×-His Tag Monoclonal Antibody (HIS.H8), Alexa Fluor 555(1∶60)室温避光染色1 h，PBS洗3次，加入DAPI染核10 min，PBS洗3次，上镜观察。
2 结果 2.1 VH及VL基因的扩增鉴定将扩增的VH及VL基因进行1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，由结果可知在300 bp左右出现了明显的条带，条带大小与预期的目的条带大小相一致，见图 1。
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A.VH基因扩增产物；B. VLκ基因扩增产物；C. VLλ基因扩增产物；M. DNA相对分子质量标准；1~2.VH；3. VLκ；4~5. VLλ A. VH gene amplification product; B. VLκ gene amplification product; C. VLλ gene amplification product; M. DL2000 DNA marker, 1-2. VH; 3. VLκ; 4-5. VLλ 图 1 猪源抗体VH及VL基因扩增 Fig. 1 Porcine antibody VH and VL gene amplification |
将扩增的VH及VL基因进行1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果可见在320 bp左右出现了明显的条带，条带大小与预期的目的条带大小相一致，见图 2。
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A.VH-Linker基因扩增产物；B. VLκ-Linker基因扩增产物；C. VLλ-Linker基因扩增产物；M. DNA相对分子质量标准；1.VH-Linker；2~3. VLκ-Linker；4~5. VLλ-Linker A. VH-Linker gene amplification product; B. VLκ-Linker gene amplification product; C. VLλ gene amplification product; M. DL2000 DNA marker, 1. VH-Linker; 2-3. VLκ-Linker; 4-5. VLλ-Linker 图 2 猪源抗体VH-Linker及VL-Linker基因扩增 Fig. 2 Porcine antibody VH-Linker and VL-Linker gene amplification |
将SOE-PCR扩增拼接得到的VH-Linker-VL基因进行1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果可见在约800 bp左右出现了明显的条带，条带大小与预期的目的条带大小相一致，见图 3。
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A. VH-Linker-VLλ基因扩增产物；B. VH-Linker-VLκ基因扩增产物；M. DNA相对分子质量标准；1. VH-Linker-VLλ；2. VH-Linker-VLκ A. VH-Linker-VLλ gene amplification product; B. VH-Linker-VLκ gene amplification product; M. DL2000 DNA marker; 1. VH-Linker-VLλ; 2. VH-Linker-VLκ 图 3 猪源抗体ScFv(VH-Linker-VL)基因扩增 Fig. 3 Porcine antibody ScFv(VH-Linker-VL) gene amplification |
将构建的pMDTM20-T-ScFv(VH-Linker-VL) 质粒送杨凌天润奥科生物科技有限公司进行测序，共挑选了17个单克隆，经测序后发现其序列与NCBI网站上公布的猪IgG可变区序列的框架区基本一致、CDR区存在差异，符合猪IgG轻重链可变区基因结构。将以上基因序列进行pET-30a-ScFv质粒的构建，VH-Linker-VL位于pET-30a的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间。
其中，VH-Linker-VLλ11测序结果如图 4所示。
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图 4 pMDTM20-T-ScFv(VH-VLλ11)质粒测序峰图 Fig. 4 pMDTM20-T-ScFv (VH-VLλ11) plasmid sequencing peak map |
对构建的pET-30a-ScFv质粒进行抗体蛋白的诱导表达。结果显示：仅pET-30a-VH-VLλ11在37 ℃诱导后出现1条27 ku的特异蛋白条带(包涵体)，大小与预期相符，并在诱导剂浓度为1/1 000，诱导时间为6 h时，ScFv抗体表达量达高峰。将表达的VH-VLλ11抗体进行镍柱纯化，结果如图 5所示。
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M. 未染色蛋白质分子标准(26610)；1、2. ScFv抗体(VH-VLλ11) M. Unstained protein MW marker (26610);1, 2. ScFv antibody(VH-VLλ11) 图 5 pET-30a-ScFv(VH-VLλ11)抗体蛋白纯化浓缩 Fig. 5 pET-30a-ScFv (VH-VLλ11) antibody protein purification concentration map |
2.6.1 VH-VLλ11包被检测板鉴定ASFV 将表达纯化的VH-VLλ11抗体蛋白包被检测板鉴定其与ASFV的反应活性，结果显示VH-VLλ11抗体具有ASFV反应活性，如图 6所示。
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图 6 VH-VLλ11包被检测板鉴定ASFV Fig. 6 Identification of ASFV coated with VH-VLλ11 |
2.6.2 ASFV抗原包被检测板鉴定VH-VLλ11 以P73兔抗捕获ASFV抗原包被检测板检测纯化的VH-VLλ11抗体蛋白，结果显示，VH-VLλ11抗体蛋白与ASFV具有反应性，如图 7所示。
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图 7 ASFV包被检测板鉴定VH-VLλ11 Fig. 7 Identification of VH-VLλ11 coated with ASFV |
2.6.3 VH- VLλ11抗体间接免疫荧光鉴定 以6×-His Tag Monoclonal Antibody (HIS.H8), Alexa Fluor 555进行VH-VLλ11抗体的荧光染色，结果显示VH-VLλ11可与处于细胞质中的ASFV发生反应，如8所示。
3 讨论目前，ASFV对全球养猪业造成了巨大威胁，中国作为养猪大国，猪肉更是老百姓的日常肉类主要来源。自2018年我国暴发非洲猪瘟疫情以来，猪肉价格大幅上涨，给百姓的日常生活带来了极大的影响。科研学者夜以继日，积极进行ASFV疫苗的研发，但目前全球还未有商品化的ASFV疫苗，因此，ASF的快速诊断对防控该病至关重要。抗体作为诊断方法中的核心成分，是决定诊断方法优劣的重要因素，在本研究中，主要致力于制备一种分子量小、穿透力强、异源性低的ScFv。
本研究通过分离了ASFV感染康复猪的外周血淋巴细胞，从中提取RNA来作为扩增模板，考虑到猪的抗体轻链类型有λ型和κ型两种，作者在设计引物时分别设计了两种轻链类型的引物，并通过在引物5′端添加Linker序列(一段由甘氨酸和丝氨酸组成的多肽链)，利用重叠PCR(SOE-PCR)扩增得到VH-VLκ和VH-VLλ两种基因。BLAST比对结果显示，获取的基因与NCBI网站上公布的猪IgG重链与轻链基因的相似性均达80%以上，后由公司代为构建pET-30a-ScFv表达质粒，最终通过大肠杆菌表达系统表达得到VH-VLλ11抗体蛋白。
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图 8 VH-VLλ11的间接免疫荧光试验 Fig. 8 Indirect immunofluorescence experiment of VH-VLλ11 |
将表达的蛋白纯化后进行ELISA检测技术及IFA试验验证，证实VH-VLλ11抗体蛋白具有ASFV反应活性，但反应活性较低，这与ScFv亲和力低的特性相一致，其主要原因主要有两点：一是由于ScFv与常规抗体相比，少了Fc结构域，Fc结构域的缺失虽然能够降低抗体的异源反应[27]，但也在一定程度上影响了抗体亲和力，二是因为ScFv的表达多选择大肠杆菌表达系统，其独特的还原性环境，影响了抗体表达过程中二硫键的形成，导致所表达的抗体蛋白多以包涵体的形式存在[28]，从而掩盖了抗体的部分抗原表位，降低了抗体亲和力。当然，ScFv亲和力低的问题可以通过优化表达系统、增加伴侣蛋白等方式解决[29]。
本研究制备了一种与ASFV具有反应性的ScFv，后续可以应用ScFv作为捕获抗体或者检测抗体，建立检测ASFV的ELISA方法，或者包被灭活ASFV，应用抗ASFV ScFv建立竞争或者阻断ELISA方法。此抗体的成功制备填补了目前市场上ASFV ScFv抗体的空白，克服了单克隆抗体制备周期长、异源性强的问题，为ASF的诊断提供了新的原材料。
4 结论通过分离ASFV感染康复猪外周血淋巴细胞，提取淋巴细胞总RNA，应用SOE-PCR技术成功获得猪源ScFv基因，然后应用大肠杆菌表达系统表达ScFv基因，经过ELISA和IFA鉴定，成功获得1株具有ASFV反应活性的猪源ScFv(VH- VLλ11)，为ASF的诊断注入新力量。
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