2. 贵州大学动物科学学院, 贵阳 550025
, CHEN Xiang1,2
, ZHANG Yan1,2, YANG Peifang1,2, HUI Maomao1,2, TANG Wen1,2, HONG Lei1,2
2. College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China
繁殖性状，特别是多羔性状，是山羊重要的经济性状。随着人们生活水平的提高和对羊肉需求量的增加，提高地方山羊品种的繁殖力十分重要，但山羊的多羔遗传效力低，每胎仅产1~2羔，在一定程度上限制了山羊产业的发展，故研究与产羔数相关的主效基因可提高山羊繁殖力，对养羊业的可持续发展具有重要意义。黔北麻羊是贵州省优良地方品种之一，因其具有高产、早熟、耐粗饲等特点而被专家批准为贵州省新遗传资源，是研究山羊繁殖性能的理想模型[1-2]。组织蛋白酶(cathepsin, CTS)家族已被证实广泛存在于各类细胞或组织中并参与表达[3]，能够催化蛋白质的水解并调节各种正常的生物学过程，例如细胞死亡、增殖、迁移、癌症以及抗原抗体的加工等[4-5]。组织蛋白酶家族包含多种亚型，到目前为止，组织蛋白酶A至Z均有研究报道[6]。就组织蛋白酶的水解机制而言，组织蛋白酶主要包括半胱氨酸组织蛋白酶(组织蛋白酶B、C、S、Z等)、丝氨酸组织蛋白酶(组织蛋白酶A、G)和天冬氨酸组织蛋白酶(组织蛋白酶D、E)[7]。组织蛋白酶D(cathepsin D, CTSD)是溶酶体的主要成分之一，在细胞内以两条链形式存在，由二硫键连接的氨基末端轻链(14 ku)和羧基末端重链(34 ku)组成[7]，主要参与蛋白质的水解，也与细胞凋亡的诱导与促进、癌症的发展、周期有关[8]。大量研究表明，CTSD是一种普遍表达的天冬氨酸溶酶体蛋白酶，在大多数组织和细胞中发挥作用。不仅有利于肌肉的自溶，而且在调节小鼠情绪稳定中起重要作用[9]，还是猪经济性状的候选基因[10]。此外，CTSD mRNA已在子宫[11]、肝[12]、卵巢[13]和骨[14]等多个组织中建立表达图谱。且CTSD的表达会受到卵巢中孕激素的调控，在卵母细胞发育期间表达量显著升高，是卵母细胞发育过程中的关键酶之一；还有研究表明，CTSD的遗传变异可能与卵巢的品质性状有关[15]，在妊娠早期绵羊的卵巢中也能够检测到此基因的表达[11]。虽然CTSD已在猪[16]、牛[17]、绵羊[18]等多种动物中克隆及测序验证，但其对山羊颗粒细胞的影响机理及产羔性状的调控机制未见研究报道。
本研究通过构建pEGFP-N3-CTSD真核表达载体并导入黔北麻羊卵泡颗粒细胞以验证其对颗粒细胞增殖、凋亡、周期及相关因子表达的影响机制，同时判断颗粒细胞中上调CTSD对多胎性状候选基因在转录与翻译水平的表达变化，以期为进一步探明CTSD对山羊产羔性状的调控机理奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料黔北麻羊来自遵义市习水县富兴牧业有限公司，根据繁殖记录，分别选取饲粮组成、免疫程序、饲养环境等外部因素均相同的5只36周龄的多胎(产羔数量为3只)黔北麻羊母羊进行放血屠宰，分两批进行，屠宰时严格按照贵州地方标准《羊屠宰操作规程》(DB22/T 2740—2017)进行，将采集的卵巢组织分为两个部分，用于组织总RNA提取的卵巢组织置于液氮(－196 ℃) 中保存。其次，将用于卵泡颗粒细胞培养的卵巢组织置于预冷的含青链霉素的PBS磷酸盐缓冲液(事前经高温高压灭菌处理)中保存。
1.2 主要试剂与仪器TRIzol®试剂、第一链cDNA合成试剂盒、荧光定量Mix、液氮、TAE缓冲液、异丙醇、无水乙醇、西班牙琼脂糖、卡那霉素粉末、PBS缓冲液、LipofectamineTM 3000 Reagent均购自艾瑞特生物(贵州)；胶回收试剂盒购自康为世纪生物科技(北京)；无内毒素质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)；限制性核酸内切酶EcoR I、Xho I与DNA Maker 2000、DNA Maker 5000均购自宝生物工程(大连)；DNA连接试剂盒、LB肉汤均购自生工生物工程(上海)；CCK-8细胞增殖试剂购自碧云天生物技术(上海)；兔抗CTSD多克隆抗体(bs-1615R)、兔抗BMPR-IB抗体(bs-6639R)、兔抗FSHR抗体(bs-0895R)、兔抗INHA抗体(bs-1032R)均购自Bioss(北京)；内参抗体β肌动蛋白(AF7018)购自Affinity(美国)；0.25%不含EDTA胰酶、DMEM/F-12、胎牛血清、青链霉素混合液均购自Gibco(美国)；细胞周期与细胞凋亡试剂盒购自凯基生物技术(江苏)。pEGFP-N3载体由本实验室保存。
琼脂糖凝胶成像系统、37 ℃恒温细胞培养箱、倒置荧光显微镜、超微量分光光度计、PCR扩增仪(C1000 TouchTM)、流式细胞仪均购自Thermo Scientific(美国)。
1.3 试验方法1.3.1 目的基因、功能基因引物的设计与合成 以GenBank库中发布的山羊CTSD基因mRNA序列(登录号：XM_018043344.1)为参考；利用Primer 5软件设计两对引物，其中，荧光定量引物用于RT-qPCR试验，CDS区扩增引物用于载体的构建，在扩增引物的上、下游处分别添加Xho I与EcoR I酶切位点。同时，以山羊BMPR-IB(登录号：XM_013964509.2)、FSHR(登录号：NM_001285636.1)、INHA(登录号：NM_001285606.1)为功能基因参照，以山羊Bcl-2(登录号：XM_01 8039337.1)、Bax(登录号：XM_013971446.2)、Caspase-3(登录号：XM_018041755.1)为细胞凋亡相关基因参照，以Cyclin A1(登录号：XM_018056659.1)、Cyclin D2(登录号：XM_005680985.3)、Cyclin E(登录号：XM_018062248.1)为细胞周期相关因子参照。分别设计9对用于RT-qPCR试验的引物，内参基因β-actin参照周志楠等[19]所用序列。引物详细信息见表 1。设计完毕后将引物送至生工生物工程(上海)技术服务股份有限公司合成。
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表 1 各引物详细信息 Table 1 Detailed information of each primer |
1.3.2 组织总RNA的提取及cDNA的合成 使用液氮研磨结合TRIzol试剂提取黔北麻羊卵巢组织总RNA，提取完毕后，取1 μL RNA提取液置于超微量分光光度计中检测其浓度及纯度，根据浓度值、RNA图谱及OD260 nm/OD280 nm比值判断RNA的质量。同时，以cDNA第一链合成试剂盒说明书将卵巢组织RNA逆转录合成cDNA第一链，体系为20 μL：RNA Template 1 μL，Oligo dT Primer 1 μL，DEPC-ddH2O 7 μL，2× Reaction mix 10 μL，StarScript Ⅱ RT mix 1 μL。短暂混匀离心后，于PCR仪中42 ℃孵育50 min，85 ℃酶失活孵育5 min，合成的cDNA产物于－20 ℃冰箱保存。
1.3.3 pEGFP-N3-CTSD真核表达载体的构建 以合成的卵巢cDNA第一链为模板，PCR扩增CTSD基因的CDS区，扩增后，在紫外光的照射下将含有目的条带的胶条切下，根据康为(北京)试剂有限公司试剂盒说明书进行回收。复苏pEGFP-N3载体，用Xho I与EcoR I进行双酶切(37 ℃水浴3 h)使其暴露与扩增引物相同的粘性末端，并将产物与酶切后的pEGFP-N3载体进行连接(16 ℃金属浴12 h)，随后，将连接产物加入复苏后的大肠杆菌感受态细胞DH5α中，并均匀涂布至含有卡那霉素抗性的LB平板上，过夜培养后，用枪头挑取平板中的白色斑点至装有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，摇晃扩大培养16 h(37 ℃，200 r·min-1)。待菌液浑浊后，进行菌液PCR反应，筛选出阳性菌液进行测序验证，将测序比对正确的阳性菌液扩大培养并进行无内毒素质粒的提取，随后使用EcoR I与Xho I对质粒进行双酶切检测，判断pEGFP-N3-CTSD真核表达载体是否构建成功。
1.3.4 黔北麻羊卵泡颗粒细胞的分离培养 黔北麻羊卵泡颗粒细胞的分离培养方法参考文献[20]，即在超净工作台中，使用75%酒精、蒸馏水与PBS缓冲液对卵巢组织进行冲洗，10号针头扎破卵巢表面的大卵泡，使卵泡液流入含有青链霉素的DMEM/F-12培养基中，并用吸头吸取DMEM/F-12培养基反复冲洗卵巢组织，使卵巢中的卵泡液尽可能被冲出以提高细胞数量，然后将含有卵泡液的DMEM/F-12移至10 mL灭菌离心管中，静置10~20 min沉淀细胞，800 r·min-1离心10 min，弃除上层液体，再加入适量的DMEM/F-12培养基吹打混匀，制成悬液。随后将其转移至25 cm2透气细胞培养瓶中，向瓶中加入由10%胎牛血清、2%青链霉素、88%DMEM/F-12组成的完全培养基，置于细胞培养箱中培养，待细胞贴壁生长后方可第一次换液，第一次换液后每隔48 h对细胞进行换液。
1.3.5 pEGFP-N3-CTSD真核表达质粒转染细胞 待细胞培养瓶中细胞密度达到90%时，用胰酶消化细胞并铺至6孔板内，按Lipofecta mineTM 3000 Reagent试剂盒说明书分别将空载体pEGFP-N3、真核表达质粒pEGFP-N3-CTSD导入细胞，每孔设置3个重复。细胞转染24 h后，在细胞倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白数量以初步判断转染效率。
1.3.6 细胞增殖检测 细胞转染24 h后，将6孔板取出，用PBS缓冲液清洗3次，每孔加入500 μL胰酶37 ℃消化3~5 min，待细胞消化80%~90%后加入完全培养基终止消化，吹打混匀后铺至96孔板，并设置不同细胞浓度梯度，以确定细胞生长曲线，每组设置5个重复，随后将96孔板放入细胞培养箱中培养至完全贴壁，每孔加入10 μL CCK-8试剂，再放入细胞培养箱中培养4 h，以保证CCK-8试剂完全与细胞发生反应，反应结束后，在酶标仪中分别测定细胞在0、6、12、24、48、72 h的吸光值以判断细胞增殖情况。
1.3.7 细胞周期检测及数据分析 本研究采用流式细胞技术检测pEGFP-N3-CTSD真核表达质粒对黔北麻羊卵泡颗粒细胞凋亡及周期的影响，细胞转染48 h后，弃去各孔中的旧培养基，用预冷的PBS清洗3遍，用0.25%不含EDTA的胰酶消化细胞，待细胞从孔壁脱落时，加入完全培养基终止消化并将其收集至离心管中，4 ℃ 2 000 r·min-1离心5 min，弃上清，再使用预冷的75%乙醇重悬细胞，4 ℃过夜固定，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清，使用PBS缓冲液清洗细胞使其成为细胞悬液，1 000 r·min-1离心5 min，在避光条件下加入500 μL用PBS配置的PI染色液，4 ℃避光保存，1 h后通过流式细胞仪检测细胞周期，检测完毕后使用Excel软件记录细胞不同周期的数量，用T-TEST判断显著性, 并使用Graphpad prism 6软件进行绘图。
1.3.8 细胞凋亡检测及数据分析 与细胞周期检测类似，在细胞转染24 h时，通过倒置荧光显微镜观察细胞转染效率并更换完全培养基继续培养至48 h，使用凯基生物技术公司的Annexin V-EGFP/PI双染细胞凋亡检测试剂盒进行检测，用0.25%不含EDTA的胰酶消化细胞后，转至离心管中800 r·min-1离心5 min，弃上清，用预冷的PBS缓冲液反复清洗管底细胞，800 r·min-1离心5 min，弃上清，先后加入500 μL Binding Buffer悬浮细胞、5 μL Annexin V-EGFP与5 μL Propidium Iodide，混匀后室温避光反应30 min，反应结束后使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。数据分析与细胞周期类似。
1.3.9 细胞水平实时荧光定量PCR检测分析 分别将pEGFP-N3-CTSD真核表达质粒与pEGFP-N3空载体导入细胞24 h后，提取细胞中的总RNA并进行定量，随后进行逆转录，方法见“1.3.2”，逆转录结束后，以cDNA第一链为模板结合相关引物进行实时荧光定量PCR反应，反应预混液体系为20 μL：上、下游引物(10 μmoL·L-1)各0.6 μL，cDNA模板1 μL，2× RealStar Green Fast Mixture 10 μL，ddH2O补充至20 μL。检测pEGFP-N3-CTSD真核表达质粒对目的基因CTSD，功能基因 BMPR-IB、FSHR 、INHA，细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3及细胞周期蛋白因子Cyclin A1、Cyclin D2、Cyclin E在转录水平的表达变化，反应结束后，使用2-ΔΔCt对相关基因在细胞水平的实际表达量进行计算，用单因素方差分析及T-TEST计算差异是否达到显著水平，分别以P < 0.05、P < 0.01作为差异显著与极显著的判断标准。
1.3.10 细胞总蛋白的提取 细胞转染48 h后，将6孔板取出，弃去培养基，PBS清洗后，每孔加入200 μL细胞RIPA裂解液(含2 μL PMSF，以防止蛋白快速降解)，置于冰上裂解35 min，期间使用枪头或细胞刮可能将贴壁细胞刮至裂解液中以提高蛋白浓度，裂解完毕后，收集裂解液于1.5 mL离心管中，13 000 r·min-1离心15 min，将上清液转移至新的离心管中，-80 ℃冰箱保存。
1.3.11 Western blot检测及数据分析 根据BCA蛋白定量试剂盒说明书对所提取的蛋白进行定量分析，定量后加入蛋白上样缓冲液(蛋白∶蛋白上样缓冲液=4 ∶1), 置于水浴锅中99 ℃煮沸10 min，每孔加入20 μg蛋白与5 μL蛋白彩虹Marker，并设置3个重复，60 V电泳30 min、110 V电泳70 min，随后进行转PVDF膜(100 mA，2 h)、封闭(5%脱脂奶粉TBST溶液，37 ℃、2 h)，在将PVDF膜放入TBST稀释的兔抗CTSD(1∶2 000)、兔抗β-actin(1∶3 000)、兔抗BMPR-IB(1∶2 000)、兔抗FSHR(1∶1 500)、兔抗INHA(1∶1 000)一抗溶液中4 ℃孵育16 h。第二天回收一抗，TBST洗膜3次，每次10 min。在将PVDF膜放入按1∶2 000稀释比稀释的HRP标记山羊抗兔的二抗溶液中，37 ℃孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，最后加入ECL超敏化学发光液进行显色，并将PVDF膜置于凝胶成像系统中进行成像，使用Image J软件对目的条带进行灰度值分析，SPSS 19.0软件对差异表达量进行统计分析。
2 结果 2.1 PCR扩增检测相关引物特异性以卵巢组织cDNA第一链为模板，RT-PCR扩增CTSD基因CDS区。以细胞cDNA第一链为模板，PCR扩增检测功能基因、细胞凋亡因子与细胞周期蛋白因子的荧光定量引物特异性，琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。由图 1可知，PCR扩增出的CTSD基因CDS区引物条带较亮，片段大小一致，可进行胶回收试验。功能基因、细胞凋亡因子与细胞周期蛋白因子引物大小与预测大小一致，条带单一、明亮且无非特异性扩增，可用于RT-qPCR分析。
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图 1 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物 Fig. 1 Agarose gel electrophoresis to detect PCR amplification products |
将从卡那霉素的LB平板中挑取的白斑进行菌液PCR反应，初步验证并筛选真核表达载体是否构建成功，结果发现(图 2A)，PCR扩增出与CTSD基因CDS区大小一致的目的片段，初步筛选该菌液为阳性菌液，测序比对后发现，黔北麻羊CTSD基因CDS区片段与山羊CTSD基因CDS区片段完全吻合，序列比对正确率达100%(图 2B)，双酶切结果表明，酶切产物具有上、下两个条带，其上条带4 729 bp处代表pEGFP-N3空载体片段，而下条带1 239 bp处则代表黔北麻羊CTSD基因CDS区片段，菌液PCR、测序结果及双酶切验证表明, pEGFP-N3-CTSD真核表达载体构建成功。
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A.菌液PCR检测结果；B. pEGFP-N3-CTSD真核表达载体部分测序结果，其中B1表示山羊CTSD基因CDS区原序列、B2表示扩增出的黔北麻羊CTSD基因的CDS区序列；C. pEGFP-N3-CTSD真核表达载体双酶切结果 A. The result of PCR detection of bacterial liquid; B. The partial sequencing result of pEGFP-N3-CTSD eukaryotic expression vector, B1 represents the original sequence of the CDS region of the CTSD gene of goat, B2 represents the sequence of the amplified CDS region of the CTSD gene of Qianbei Ma goat; C. The result of double enzyme digestion of pEGFP-N3-CTSD eukaryotic expression vector 图 2 pEGFP-N3-CTSD真核表达载体的鉴定结果 Fig. 2 Identification results of eukaryotic expression vector of pEGFP-N3-CTSD |
分别在黔北麻羊原代卵泡颗粒细胞培养的6、12、24、48 h进行拍照记录其形态变化，由图 3A可知，在细胞培养6 h时，已基本贴壁，但大都成“点”状，部分成“条”状，细胞轮廓不明显。细胞培养至12 h时，已基本定形，轮廓开始明显。到24 h时，细胞开始变大、变圆，纺锤形已十分明显，数量也成倍增加。48 h时，细胞数量已占满细胞培养瓶的70%~80%，隔天便可进行消化铺板或传代试验。
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A.细胞分离培养6 h；B.细胞分离培养12 h；C.细胞分离培养24 h；D.细胞分离培养48 h A. Cell isolation and culture for 6 h; B. Cell isolation and culture for 12 h; C. Cell isolation and culture for 24 h; D. Cell isolation and culture for 48 h 图 3 黔北麻羊卵泡颗粒细胞分离培养的形态变化(100×) Fig. 3 Morphological changes of follicular granulosa cells from Qianbei Ma goat (100×) |
细胞转染24 h后，荧光显微镜下观察发现，未转染质粒的空白组呈现一片漆黑(图 4A)，pEGFP-N3空载体转染组、pEGFP-N3-CTSD重组质粒转染组因含有绿色荧光蛋白GFP在蓝色光源的激发下，细胞中发出大量的绿色荧光(图 4B和4C中高亮部分)，且细胞6孔板中无漂浮的死细胞，阳性细胞数量占比80%以上，初步证实pEGFP-N3空载体与pEGFP-N3-CTSD重组质粒已导入细胞，但还需要进一步从转录与翻译水平上进行判断。
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A.空白组；B.pEGFP-N3组；C.pEGFP-N3-CTSD组 A. Blank group; B. pEGFP-N3 group; C. pEGFP-N3-CTSD group 图 4 重组质粒转染颗粒细胞荧光图(100×) Fig. 4 Fluorescence of granulosa cells transfected with recombinant plasmid (100×) |
本研究使用RT-qPCR与Western blot技术分别在转录与翻译水平上检测重组质粒的真核表达效率。由图 5可知，相对于空载体pEGFP-N3，重组质粒pEGFP-N3-CTSD转染后在转录与翻译水平上均能够极显著上调CTSD mRNA与蛋白在颗粒细胞中的表达(P < 0.01)，说明重组质粒的真核表达效率较高，可用于下一步分析与检测。
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图 5 重组质粒表达效率检测 Fig. 5 Recombinant plasmid expression efficiency detection |
CCK-8细胞增殖检测结果显示(图 6)，pEGFP-N3-CTSD转染后在被检测的6个时间段内颗粒细胞的增殖水平均低于pEGFP-N3空载体组，且除了0与6 h外，在其余4个时间段的增殖检测结果发现，重组质粒pEGFP-N3-CTSD对颗粒细胞增殖的抑制作用均达到了极显著水平(P < 0.01)，说明CTSD的高表达可以抑制颗粒细胞的增殖。
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图 6 pEGFP-N3-CTSD转染后颗粒细胞的增殖情况 Fig. 6 Proliferation of granulosa cells after pEGFP-N3-CTSD transfection |
细胞凋亡检测结果见图 7。流式细胞仪检测发现，相比于pEGFP-N3，pEGFP-N3-CTSD转染后能够极显著促进颗粒细胞的凋亡(P < 0.01)，说明CTSD的高表达会促进颗粒细胞的凋亡。同时，为进一步阐明其促凋亡机制，本试验研究了细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达，pEGFP-N3-CTSD在转染后能极显著上调促凋亡基因Bax与Caspase-3的表达(P < 0.01)，对抗凋亡基因Bcl-2起到了显著的下调作用(P < 0.05)。
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A1~A3. pEGFP-N3对颗粒细胞凋亡的检测结果；B1~B3. pEGFP-N3-CTSD对颗粒细胞凋亡的检测结果；C. pEGFP-N3-CTSD转染后的细胞凋亡率；D. pEGFP-N3-CTSD对细胞凋亡相关因子表达的影响 A1-A3. The detection results of pEGFP-N3 on granulosa cell apoptosis; B1-B3. The detection results of pEGFP-N3-CTSD on granulosa cell apoptosis; C. The apoptosis rate after pEGFP-N3-CTSD transfection; D. The effect of pEGFP-N3-CTSD on the expression of apoptosis-related factors 图 7 重组质粒pEGFP-N3-CTSD对颗粒细胞凋亡及相关基因表达的影响 Fig. 7 Effect of recombinant plasmid pEGFP-N3-CTSD on apoptosis of granulosa cells and related genes expression |
利用流式细胞仪检测重组质粒pEGFP-N3-CTSD对细胞周期的影响，结果见图 8，相比于pEGFP-N3空载体组，pEGFP-N3-CTSD转染后能极显著上调G0/G1期及G2/M期的细胞数量，同时极显著下调S期的细胞数量(P < 0.01)，为进一步了解重组质粒pEGFP-N3-CTSD对细胞周期的影响机制，本研究还发现，pEGFP-N3-CTSD转染后能极显著上调细胞周期相关因子Cyclin A1基因的表达(P < 0.01)，能极显著下调Cyclin D2基因的表达(P < 0.01)，对Cyclin E基因的表达也起到了下调作用，但并未达到显著水平(P>0.05)。
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A1~A3. pEGFP-N3对颗粒细胞周期的检测结果；B1~B3. pEGFP-N3-CTSD对颗粒细胞周期的检测结果；C. 细胞在各个周期所占的比率；D. pEGFP-N3-CTSD对细胞周期蛋白因子表达的影响 A1-A3. The detection results of pEGFP-N3 on the granulosa cell cycle; B1-B3. The detection results of pEGFP-N3-CTSD on the granulosa cell cycle; C. The percentage of cells in each cycle; D. The effect of pEGFP-N3-CTSD on the expression of cyclin factors 图 8 重组质粒pEGFP-N3-CTSD对颗粒细胞周期及相关基因表达的影响 Fig. 8 The effect of recombinant plasmid pEGFP-N3-CTSD on granulosa cell cycle and related genes expression |
为了检测CTSD对颗粒细胞中多胎性状候选基因表达的影响，本研究使用RT-qPCR与Western blot技术检测重组质粒pEGFP-N3-CTSD转染后对BMPR-IB、FSHR与INHA在转录与翻译水平的表达变化，由图 9可知，相比于pEGFP-N3空载体组，pEGFP-N3-CTSD转染后均能极显著下调颗粒细胞中多胎性状候选基因BMPR-IB、FSHR与INHA mRNA与蛋白的表达(P < 0.01)，提示，颗粒细胞中CTSD的上调对多胎性状候选基因的表达起到了抑制作用。
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A. pEGFP-N3-CTSD转染后对BMPR-IB、FSHR与INHA基因表达的影响；B、C. pEGFP-N3-CTSD转染后对BMPR-IB、FSHR与INHA蛋白表达的影响 A. The effect of pEGFP-N3-CTSD on the expression of BMPR-IB, FSHR and INHA genes after transfection; B, C. The effect of pEGFP-N3-CTSD on the expression of BMPR-IB, FSHR and INHA proteins after transfection 图 9 重组质粒pEGFP-N3-CTSD转染颗粒细胞后对功能基因与蛋白表达的影响 Fig. 9 Effects of recombinant plasmid pEGFP-N3-CTSD transfected granulosa cells on the expression of functional genes and proteins |
产羔性状是山羊重要的繁殖性状与经济性状之一，而排卵率是衡量山羊产羔数量高低的重要指标，有关绵羊的遗传学研究表明，产羔数量与排卵率可以通过不同的基因进行调控[21]。此外，排卵率还受到哺乳动物卵巢卵泡的增殖分化、颗粒细胞的生长发育、多种激素以及生长因子相互调控的影响[22]。转化生长因子β家族(TGFβ)的生长因子在卵泡发育过程中起着重要作用，骨形态发生蛋白(BMPs)是TGF-β超家族的成员。它们在原型上参与骨骼的形成，但也显示出它们是能够调节细胞增殖、分化、形态发生和凋亡的多功能细胞因子[23]。在动物体内BMPs主要通过其受体(BMPRs)来发挥作用。早期研究表明，BMPR-IB可以影响垂体和卵巢的生理活动，影响颗粒细胞的分化和排卵卵泡的成熟。同时，BMPR-IB编码区的突变与Booroola绵羊的繁殖力完全相关(FecB突变)，FecB突变对增加羊的排卵数和产仔数具有促进作用[24]。携带FecB突变的母羊能获得更加优良的多胎性能，故BMPR-IB可促进山羊的产羔。抑制素(inhibin)也是TGF-β家族成员之一，INHA是抑制素家族中的亚型，由卵巢卵泡的颗粒细胞分泌，有研究发现，INHA的表达量随着卵泡的发育而增加，在排卵前的卵泡颗粒细胞中也能够检测到INHA的存在，说明INHA是影响卵泡生长发育的重要因子[25]。目前大量研究均集中于INHA基因的遗传变异，其编码区碱基位点的突变均能够促进不同物种的产羔(仔)数量[26-27]。卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor，FSHR)是一种G蛋白偶联受体，主要在哺乳动物卵巢中表达。最新的研究证实，FSHR还可以广泛表达于颗粒细胞[28]和脂肪细胞[29]等各类细胞中，其表达量与哺乳动物各类卵泡的发育呈正相关，FSHR基因编码区的突变也对不同羊种的产羔数具有正向意义，故研究学者多通过研究FSHR基因来探究卵泡的发育及排卵。目前，针对CTSD对山羊产羔性状影响机制的研究较少。假设CTSD对山羊的产羔数有重要影响，故本研究构建重组质粒pEGFP-N3-CTSD导入细胞后验证其对多胎性状候选基因BMPR-IB、INHA与FSHR表达的影响，发现在颗粒细胞中上调CTSD后能够极显著降低山羊多胎性状候选基因BMPR-IB、INHA与FSHR在转录与翻译水平的表达(P < 0.01)，即上调CTSD能够下调BMPR-IB、INHA与FSHR的表达，提示CTSD可能通过影响颗粒细胞中多胎性状候选基因的表达水平进而间接地调节卵泡发育，进而调控山羊的产羔性状。
近年来，排卵被描述为一个复杂的生理过程，在哺乳动物卵泡发育的过程中，超过99%的卵泡会发生闭锁而凋亡退化，只有极少数的卵泡能够发育成熟、破裂进而排卵[30]，而排卵能上调细胞凋亡相关基因的表达[31]。本研究使用流式细胞技术发现，在颗粒细胞中上调CTSD后，能够在被检测的4个时间段(12、24、48、72 h)极显著地抑制细胞的增殖，同时极显著促进细胞凋亡(P < 0.01)。早在1996年，Deiss等[32]首次在研究中提出，CTSD参与了细胞凋亡的调控，可以通过不同的机制发挥作用或诱导细胞凋亡。现如今大量研究均已证实，CTSD能够促进细胞的凋亡[33]，这与本研究中流式细胞仪所展现的结果相符。为了进一步研究其影响机制，本研究选取了Bcl-2(抗凋亡基因)、Bax、Caspase-3(促凋亡基因)，验证颗粒细胞中上调CTSD后对凋亡相关基因表达的影响，结果发现，CTSD的高表达能够显著降低Bcl-2基因的表达(P < 0.05)，极显著提高Bax、Caspase-3基因的表达(P < 0.01)，这更加确定了流式细胞仪检测颗粒细胞凋亡的结果。研究表明，CTSD可以通过两种途径诱导细胞凋亡，当溶酶体中CTSD释放到细胞质后，引发线粒体功能障碍导致线粒体中胱天蛋白酶激活剂的释放，进一步激活Caspase-3因子，导致细胞凋亡[34]，此机制与本研究结果一致。此外，Bcl-2家族(包括抗凋亡成员Bcl-2以及促凋亡成员Bax)是通过连接所产生的存活和细胞死亡信号来调控凋亡的主要调节剂，它们之间可以通过相互作用使线粒体膜通透性升高导致细胞凋亡[35]，故推测，CTSD主要通过线粒体途径引发山羊颗粒细胞的凋亡。
细胞周期检测结果发现，在颗粒细胞中上调CTSD后，能极显著上调G0/G1期与G2/M期细胞比例(P < 0.01)，极显著下调S期比例(P < 0.01)，这提示我们，CTSD的高表达能够明显地将颗粒细胞阻滞在了G0/G1期与G2/M期。一般认为，S期与G2/M期所占的比例之和能够反映细胞的增殖能力，在本研究中，pEGFP-N3-CTSD转染后颗粒细胞在S期下降的比例高于G2/M期升高的比例，故S期+G2/M期颗粒细胞的总数量降低，即CTSD的高表达对颗粒细胞的增殖起到了抑制作用，这与CCK-8试剂检测结果一致。为了进一步探究CTSD高表达对细胞周期的影响，本研究选取了细胞周期相关因子Cyclin A1、Cyclin D2、Cyclin E，并检测它们在转录水平中的表达变化，结果发现，pEGFP-N3-CTSD在转染后能够极显著地提高推动细胞从S期向G2/M期转换的周期因子Cyclin A1[36]的表达。极显著降低Cyclin D2的表达，Cyclin D2是细胞周期相关因子Cyclin D家族中的一个亚型，主要在细胞的G0/G1期发挥作用，在G1期的早期合成，在G1期的晚期高表达[37]，并在G1期与G1/S交界处起重要的推进作用。故推测在本研究中Cyclin D2表达量的降低可能是细胞被阻滞在G0/G1期的主要原因，但CTSD的高表达对调控细胞从G0/G1期向S期转换的周期因子Cyclin E[38]的表达变化却不显著，细胞周期相关因子的表达变化均在本研究的流式细胞结果中得到了体现，故推测，CTSD的高表达主要是通过调控细胞中Cyclin A1、Cyclin D2的表达影响颗粒细胞的增殖、分化与生理功能，进而影响卵泡的生长发育与排卵。
4 结论本研究发现，CTSD的高表达会抑制细胞增殖、促进凋亡并提高细胞凋亡相关因子Bax与Caspase-3的表达，降低细胞抗凋亡因子Bcl-2的表达。在颗粒细胞中上调CTSD后能通过提高细胞周期因子Cyclin A1，降低Cyclin D2的表达将颗粒细胞阻滞在G0/G1期与G2/M期，降低细胞在S期的数量，同时，颗粒细胞中上调CTSD后能极显著下调多胎性状候选基因BMPR-IB、FSHR、INHA在转录与翻译水平的表达量。本研究提示，CTSD可能对山羊卵泡颗粒细胞的生物学行为及山羊的多胎性状具有重要作用，为今后进一步探讨CTSD的生物学功能及揭示CTSD在卵泡发育过程中的作用奠定基础。
| [1] |
孙振梅. 黔北麻羊BMP4和BMPR-IB基因克隆表达及其多态性与繁殖性状的关联分析[D]. 贵阳: 贵州大学, 2017.
SUN Z M. Cloning expression and polymorphisms analysis of BMP4 and BMPR-IB genes associated with reproductive traits in Qianbei Ma goat[D]. Guiyang: Guizhou University, 2017. (in Chinese) |
| [2] |
翁吉梅. 黔北麻羊FTO基因多态性及其表达与肉质性状的关联性研究[D]. 贵阳: 贵州大学, 2019.
WENG J M. Association study for polymorphism and expression of FTO gene with meat quality traits in Qianbei brown goat[D]. Guiyang: Guizhou University, 2019. (in Chinese) |
| [3] | MAN S M, KANNEGANTI T D. Regulation of lysosomal dynamics and autophagy by CTSB/cathepsin B[J]. Autophagy, 2016, 12(12): 2504–2505. DOI: 10.1080/15548627.2016.1239679 |
| [4] | CHENG X W, HUANG Z, KUZUYA M, et al. Cysteine protease cathepsins in atherosclerosis-based vascular disease and its complications[J]. Hypertension, 2011, 58(6): 978–986. DOI: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.111.180935 |
| [5] | PATEL S, HOMAEI A, EL-SEEDI H R, et al. Cathepsins: proteases that are vital for survival but can also be fatal[J]. Biomed Pharmacother, 2018, 105: 526–532. DOI: 10.1016/j.biopha.2018.05.148 |
| [6] |
曾广智, 谭宁华, 贾锐锐, 等. 组织蛋白酶及其抑制剂研究进展[J]. 云南植物研究, 2005, 27(4): 337–354.
ZENG G Z, TAN N H, JIA R R, et al. Cathepsins: structures, functions and inhibitors[J]. Acta Botanica Yunnanica, 2005, 27(4): 337–354. DOI: 10.3969/j.issn.2095-0845.2005.04.001 (in Chinese) |
| [7] | ROSSI A, DEVERAUX Q, TURK B, et al. Comprehensive search for cysteine cathepsins in the human genome[J]. Biol Chem, 2004, 385(5): 363–372. |
| [8] | ZAIDI N, MAURER A, NIEKE S, et al. Cathepsin D: a cellular roadmap[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 376(1): 5–9. DOI: 10.1016/j.bbrc.2008.08.099 |
| [9] |
周瑞. Cathepsin D缺陷小鼠的行为学及其机制的研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2015.
ZHOU R. Behavioral phenotype of Cathepsin D-deficient mice[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2015. (in Chinese) |
| [10] | RUSSO V, FONTANESI L, SCOTTI E, et al. Single nucleotide polymorphisms in several porcine cathepsin genes are associated with growth, carcass, and production traits in Italian large white pigs[J]. J Anim Sci, 2008, 86(12): 3300–3314. DOI: 10.2527/jas.2008-0920 |
| [11] | SONG G, SPENCER T E, BAZER F W. Cathepsins in the ovine uterus: regulation by pregnancy, pro-gesterone, and interferon tau[J]. Endocrinology, 2005, 146(11): 4825–4833. DOI: 10.1210/en.2005-0768 |
| [12] | CAO W, LI Y, LI M, et al. Txn1, Ctsd and Cdk4 are key proteins of combination therapy with taurine, epigallocatechin gallate and genistein against liver fibrosis in rats[J]. Biomed Pharmacother, 2017, 85: 611–619. DOI: 10.1016/j.biopha.2016.11.071 |
| [13] | GAO Y H, GAO Y T, HUANG B, et al. Reference gene validation for quantification of gene expression during ovarian development of turbot (Scophthalmus maximus)[J]. Sci Rep, 2020, 10(1): 823. DOI: 10.1038/s41598-020-57633-3 |
| [14] | MANCHANDA M, DAS P, GAHLOT G P S, et al. Cathepsin L and B as potential markers for liver fibrosis: insights from patients and experimental models[J]. Clin Transl Gastroenterol, 2017, 8(6): e99. DOI: 10.1038/ctg.2017.25 |
| [15] | RIBECA C, BONFATTI V, CECCHINATO A, et al. Association of polymorphisms in calpain 1, (mu/I) large subunit, calpastatin, and cathepsin D genes with meat quality traits in double-muscled Piemontese cattle[J]. Anim Genet, 2013, 44(2): 193–196. DOI: 10.1111/j.1365-2052.2012.02370.x |
| [16] |
梅盈洁, 李加琪, 陈瑶生, 等. 猪CTSD全长cDNA的克隆和表达分析[J]. 畜牧兽医学报, 2007, 38(5): 432–436.
MEI Y J, LI J Q, CHEN Y S, et al. Cloning and expression of porcine Cathepsin D gene full-length cDNA[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2007, 38(5): 432–436. DOI: 10.3321/j.issn:0366-6964.2007.05.003 (in Chinese) |
| [17] |
邓桂馨. 牛溶酶体组织蛋白酶家族及其抑制基因的克隆、表达及遗传效应分析[D]. 北京: 中国农业科学院, 2011.
DENG G X. Cloning, expression and genetics effect analysis of Cathepsin family genes and their inhibitor of cattle[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2011. (in Chinese) |
| [18] |
王念璐. 天府肉羊CTSD和CSTB基因克隆及其组织表达测定[D]. 成都: 四川农业大学, 2014.
WANG N L. cDNA cloning and tissue expression of CTSD, CSTB in Tianfu goat[D]. Chengdu: Sichuan Agricultural University, 2014. (in Chinese) |
| [19] |
周志楠, 陈祥, 敖叶, 等. 黔北麻羊RARRES1基因的克隆表达及功能初步研究[J]. 畜牧兽医学报, 2020, 51(7): 1548–1562.
ZHOU Z N, CHEN X, AO Y, et al. Cloning and expression of RARRES1 gene in Qianbei Ma goat and preliminary study on its function[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2020, 51(7): 1548–1562. (in Chinese) |
| [20] |
敖叶, 陈祥, 周志楠, 等. SMAD1基因对黔北麻羊卵巢颗粒细胞的影响及组织表达分析[J]. 畜牧兽医学报, 2020, 51(7): 1607–1618.
AO Y, CHEN X, ZHOU Z N, et al. Effect of SMAD1 gene on ovarian granulosa cells and its tissue expression analysis in Qianbei Ma goats[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2020, 51(7): 1607–1618. (in Chinese) |
| [21] | ZI X D, LU J Y, ZHOU H, et al. Omparative analysis of ovarian transcriptomes between prolific and non‐prolific goat breeds via high‐throughput sequencing[J]. Reprod Domest Anim, 2018, 53(2): 344–351. DOI: 10.1111/rda.13111 |
| [22] | SHIMIZU T, MURAYAMA C, SUDO N, et al. Involvement of insulin and growth hormone (GH) during follicular development in the bovine ovary[J]. Anim Reprod Sci, 2008, 106(1-2): 143–152. DOI: 10.1016/j.anireprosci.2007.04.005 |
| [23] | QUINN R L, SHUTTLEWORTH G, HUNTER M G. Immunohistochemical localization of the bone morphogenetic protein receptors in the porcine ovary[J]. J Anat, 2004, 205(1): 15–23. DOI: 10.1111/j.0021-8782.2004.00311.x |
| [24] | MAHDAVI M, NANEKARANI S, HOSSEINI S D. Mutation in BMPR-IB gene is associated with litter size in Iranian Kalehkoohi sheep[J]. Anim Reprod Sci, 2014, 147(3-4): 93–98. DOI: 10.1016/j.anireprosci.2014.04.003 |
| [25] | KEMPISTY B, JACKOWSKA M, WOŹNA M, et al. Expression and cellular distribution of INHA and INHB before and after in vitro cultivation of porcine oocytes isolated from follicles of different size[J]. J BioMed Biotechnol, 2011, 2012: 742829. |
| [26] | YOON S H, CHOI Y M, HONG M A, et al. Inhibin α gene promoter polymorphisms in Korean women with idiopathic premature ovarian failure[J]. Hum Reprod, 2012, 27(6): 1870–1873. DOI: 10.1093/humrep/des107 |
| [27] | CUI Z F, LIU L B, ZHAO X L, et al. Analysis of expression and single nucleotide polymorphisms of INHA gene associated with reproductive traits in chickens[J]. Biomed Res Int, 2019, 2019: 8572837. |
| [28] | SUN D, BAI M Z, JIANG Y Y, et al. Roles of follicle stimulating hormone and its receptor in human metabolic diseases and cancer[J]. Am J Transl Res, 2020, 12(7): 3116–3132. |
| [29] | LIU P, JI Y T, YUEN T, et al. Blocking FSH induces thermogenic adipose tissue and reduces body fat[J]. Nature, 2017, 546(7656): 107–112. DOI: 10.1038/nature22342 |
| [30] | HAN P, XIN H Y, PENG J Y, et al. Identification and expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein during follicular development in goat ovary[J]. Theriogenology, 2017, 98: 30–35. DOI: 10.1016/j.theriogenology.2017.04.048 |
| [31] | FENG X, LI F Z, WANG F, et al. Genome-wide differential expression profiling of mRNAs and lncRNAs associated with prolificacy in Hu sheep[J]. Biosci Rep, 2018, 38(2): BSR20171350. DOI: 10.1042/BSR20171350 |
| [32] | DEISS L P, GALINKA H, BERISSI H, et al. Cathepsin D protease mediates programmed cell death induced by interferon-gamma, Fas/APO-1 and TNF-alpha[J]. Embo J, 1996, 15(15): 3861–3870. DOI: 10.1002/j.1460-2075.1996.tb00760.x |
| [33] | ABOELENAIN M, KAWAHARA M, BALBOULA A Z, et al. Status of autophagy, lysosome activity and apoptosis during corpus luteum regression in cattle[J]. J Reprod Dev, 2015, 61(3): 229–236. DOI: 10.1262/jrd.2014-135 |
| [34] | MINAROWSKA A, MINAROWSKI L, KARWO-WSKA A, et al. Regulatory role of cathepsin D in apoptosis[J]. Folia Histochem Cytobiol, 2007, 45(3): 159–163. |
| [35] |
曹晓涵. Bcl-2相关的凋亡基因在绵羊繁殖器官中的表达特征及Bad基因在绵羊发情周期中的作用[D]. 北京: 中国农业科学院, 2018.
CAO X H. Expression of the Bcl-2-associated of cell death genes in the sheep reproductive organs and the functional analysis of Bad gene during the reproductive cycle[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2018. (in Chinese) |
| [36] | XU X G, ZHANG H L, ZHANG Q, et al. Porcine epidemic diarrhea virus N protein prolongs S-phase cell cycle, induces endoplasmic reticulum stress, and up-regulates interleukin-8 expression[J]. Vet Microbiol, 2013, 164(3-4): 212–221. DOI: 10.1016/j.vetmic.2013.01.034 |
| [37] |
熊永洁. ATF6在小鼠胚胎植入期子宫和卵巢颗粒细胞凋亡过程中的作用研究[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2017.
XIONG Y J. Study on function of ATF6 in mouse periimplantation uterus and granulosa cell apoptosis[D]. Yangling: Northwest A&F University, 2017. (in Chinese) |
| [38] |
陈任真. Cx43与AKAP95竞争性结合cyclinE调控细胞G1-S期转变[D]. 厦门: 厦门大学, 2019.
CHEN R Z. Cx43 and AKAP95 regulate cell G1-S transition by competitively binding to cyclinE[D]. Xiamen: Xiamen University, 2019. (in Chinese) |