2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193
, AN Bingxing2, DU Lili2, CHANG Tianpeng2, LIANG Mang2, YANG Baigao1, GAO Huijiang2
, E Guangxin1
2. Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
纵向性状指的是表型值随着时间(生命周期、年龄、胎次等)或其他定量因素(生产水平、生理状态和环境条件等)变化的性状[1]。动物的重要经济性状如产奶性状、育肥性状和产蛋性状等都属于纵向性状[2-4]。与一般的只有单个记录的表型性状相比较而言，纵向性状更好地描述了畜禽的生长和生产规律。目前的研究通常拟合生长曲线来反映个体发育速度与成熟速率之间的相互关系[5-7]，这是反映畜禽生长发育规律的主要方法之一[8-9]。这些模型一般通过几个参数来描述家畜的体重变化规律，例如成熟体重(A)、达到最大生长率的时间(b)、成熟率(K)等，这些参数度量个体整个发育时期的特性[10-11]。对于特定的群体，需通过拟合度来选择最佳模型拟合生长曲线[12]。已有的研究中，普遍假定参数(如A和K)作混合线性模型的表型，使用全基因组关联分析(genome wide association study, GWAS) 定位影响生长曲线的数量性状基因座(quantitative trait loci，QTL)。全基因组关联分析是扫描全基因组范围内的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNPs), 以识别与目标性状变异关联的遗传变异的分析方法[13]。Das等[14]提出了一种基于随机回归的方法，该模型能够利用多个时间点之间的非加性效应和特定的协方差函数来描述SNP效应标记随时间的变化。尽管这些基于随机回归的模型是目前评估GWAS纵向性状最复杂和最灵活的工具[15-16]，但它不能直接提供动物育种项目中通常需要的成熟重量(A)和成熟率(K)等生物学可解释的参数。
自Fitzhugh[5]提出对于动物育种中生长曲线的研究以来，肉牛育种中已有大量的研究考虑参数(主要是A、b和K)和QTL的遗传相关，这些遗传相关性可能归因于对多个参数具有多效性或紧密连锁的SNP。Crispim等[17]利用5种常用的生长曲线模型对婆罗门牛的体重数据进行生长曲线的拟合认为，Brody模型的拟合效果最好，并且发现，RAB28、BTG1、IL2、APEX2等基因与婆罗门牛的胎儿和肌肉发育有关[18-21]；Soares等[22]通过5种常用的生长曲线模型对婆罗门牛的阴囊周长数据进行拟合发现，von Bertalanffy模型拟合效果最好，并且认为LYN、CHD7、SOX9、IGF-1等可以作为婆罗门牛繁殖性状的候选基因[23-26]。中国西门塔尔牛群体适应性好，抗病力强，耐粗饲，在我国多种生态条件下均能表现出良好的生产性能，肉用西门塔尔牛占中国肉牛市场的70%左右[27]，然而尚无对中国西门塔尔牛的多时间点体重性状进行生长曲线的拟合研究。因此，本研究首先通过3种模型来模拟中国肉用西门塔尔牛的体重生长曲线，评价拟合度来选择拟合效果最佳的模型。利用最佳模型估计的参数作为GWAS中的表型，鉴定与中国西门塔尔牛生长发育性状显著相关的SNPs，为中国西门塔尔牛基因组育种提供可用的突变信息。
1 材料与方法 1.1 试验动物表型的描述性统计试验动物来自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所在内蒙古自治区锡林郭勒盟乌拉盖管理区构建的中国肉用西门塔尔牛资源群体。本研究挑选了同时包含0、6、12、18月龄体重测量数据的个体，共808头。表 1为表型数据的描述性统计信息。
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表 1 中国肉用西门塔尔牛4个发育时期体重的描述性统计 Table 1 The descriptive statistics of body weight at 4 growth stages of Chinese Simmental beef cattle |
采集所有个体血样，利用TIANGEN基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京，中国) 从血样中提取基因组DNA，利用Illumina BovineHD(770K)芯片进行基因分型。然后采用PLINK v1.07软件进行质量控制，质量控制标准为：SNPs检出率>90%；最小等位基因频率>10%；哈代-温伯格平衡检验(P>10-6)；个体基因型缺失率 < 0.1%。质控后共有808个个体和671 991个SNPs用于关联分析。
1.3 生长曲线的拟合利用3种最常用的非线性模型(表 2)来描述动物的生长曲线，使用SAS 9.4软件中的NLIN过程对整理后的数据进行曲线模型方程参数的最优估计，采用Gauss-Newton的方法迭代求解[28]，使估计的参数残差平方和最小，收敛标准为10-8。
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表 2 生长曲线模型 Table 2 Growth curve model |
R2用来评价生长曲线模型拟合程度的高低[29]，即拟合度：
| $ {R^2} = 1 - \sum {\frac{{{{(W - \widehat W)}^2}}}{{{{(W - \bar W)}^2}}}} $ |
式中，W代表观测体重值，$\widehat W$代表拟合曲线估计体重值，W代表观测体重均值。R2越接近1说明曲线拟合效果越好。
选择拟合效果最好的模型，再次通过SAS 9.4软件中的NLIN过程估计每个个体的参数A、b、K。
1.4 全基因组关联分析选择最合适体重数据的生长曲线模型，将获得的生长曲线参数A、b、K用于全基因组关联分析(GWAS)，分析之前首先使用线性模型对固定因素(场和出生年/月/日)进行校正，校正模型如下：
| $ y=X \beta+y^{*} $ |
其中，y是观测表型(A、b、K估计值向量)，β代表固定效应向量(场和出生年/月/日)，X为对应的设计矩阵，y*用于后续的关联分析模型中。
然后使用R v3.4.2中的基因组关联与预测集成工具(GAPIT)包(http://www.maizegenetics.net/gapit)进行主成分分析(PCA)和亲缘关系矩阵的计算[30]，GWAS模型如下：
| $ y^{*}=X \beta+W s+Z_{\mu}+e $ |
其中，β代表固定效应向量(PCA前3个特征向量)，X为固定效应向量的关联矩阵；W是SNP基因型指示载体，3种基因型AA、AB、BB被编码为0、1、2；s代表SNP效应向量；Z为多基因效应向量的关联矩阵；μ代表微效多基因效应向量，服从正态分布(0, Kσ2)；e表示随机残差，并且服从正态分布N(0, Iσ2)。
利用错误发现率(false discovery rate, FDR)多重检验方法对GWAS分析得到的P值进行检验，矫正P值的公式为：
| $ P=\mathrm{FDR} \times n / m $ |
其中，n代表小于FDR值的SNP个数，m代表SNP总个数，FDR设定值为0.05。
1.5 基因功能注释依据生物信息学网站Ensembl中的BioMart模块将检测到的显著SNPs比对到牛的基因组(Bostaurus UMD 3.1) (http://www.animalgenome.org)中，依据SNPs的物理位置在其上、下游寻找相关候选基因。然后通过NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Gene数据库查找相关基因的生物学功能，并结合相关文献报道对候选基因进行功能注释。
2 结果 2.1 生长曲线的拟合表 3给出了3种生长曲线模型的拟合参数结果和R2，R2最高的为Gompertz模型，达到了0.954，Logistic模型和Brody模型的R2均为0.951；Gompertz、Logistic和Brody模型参数A的值依次为617.900、551.000和1 458.500，参数b的值依次为2.740、9.304和0.976，参数K的值依次为0.153、0.273和0.024；图 1显示了3种模型曲线与体重均值曲线的吻合程度，可以看出Gompertz模型和体重均值的曲线基本吻合，而其他两种模型曲线有所偏差。表 4给出了Gompertz模型参数的描述性统计，结果显示，成熟体重(A) 的最大值为985.10，最小值为388.94，平均成熟体重为629.11，标准差为88.71；达到最大生长率的时间(b)最大值与最小值分别为9.17和2.24，平均值为2.82，标准差为0.43；成熟率(K) 的最大值和最小值分别为0.40和0.08，平均值为0.16，标准差为0.03。
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表 3 群体生长曲线模型各指标的相关估计值 Table 3 Estimated values of parameters in growth curve model for population |
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图 1 生长曲线模型趋势图 Fig. 1 Pattern trend chart of growth curve model |
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表 4 肉用中国西门塔尔牛个体Gomportz模型参数描述性统计 Table 4 The descriptive statistics of Gompertz model parameters for Chinese Simmental beef cattle individual |
图 2为基于前两个主成分将个体聚类的群体结构图，从图 2中可以明显看出，试验动物群体被分在5个区域，表明个体之间存在比较明显的群体分层现象，绝大多数个体位于右下角区域，其他4个区域有少量个体分布，所以选取前两个主成分作为协变量来消除群体分层对关联分析的影响。
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图 2 根据PCA绘制群体结构图 Fig. 2 Population structure identified by principal components analysis |
图 3给出了利用线性混合模型对生长曲线参数性状进行GWAS结果的Q-Q图，其中，横坐标表示期望P值的负对数，纵坐标表示实际观察P值的负对数。可以看出，成熟体重性状(A)的Q-Q图效果最好，大多数点都位于对角线上，表明观察值与期望值的吻合度很好，末尾SNPs的显著性也比较好；达到最大生长率的时间(b)的Q-Q图末端与对角线的吻合度有部分偏差；成熟率(K)的Q-Q图SNPs的显著性略差。
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图 3 性状A、b、K进行GWAS结果的Q-Q图 Fig. 3 Q-Q plots of GWAS for A, b, K |
图 4为利用线性混合模型对生长曲线参数性状进行GWAS结果的Manhattan图。对于性状成熟体重(A)，共检测到了9个显著的SNPs，主要分布在4、7、10、11、15和22号染色体上，临近或坐落于PLIN3、BSN、KCNS等基因；其中P值最小的SNP位点是ARS-BFGL-NGS-14531，位于7号染色体，P值为9.55×10-7。对于达到最大生长率的时间(b)来说，共检测到了49个显著的SNPs，主要分布在1、3、5、9、12、14和23号染色体上，临近或坐落于TMCO1、ANGPTL2、IGF-1等基因；其中P值最小的位点是BovineHD0900028514，位于9号染色体上，P值为4.43×10-8。对于成熟率(K)，共检测到了7个显著的SNPs，集中位于22和25号染色体上，临近或坐落于GRM7和SHISA9基因；P值最小的位点为BovineHD2200005378，位于22号染色体上，P值为3.24×10-6。具体信息如表 5所示。
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图 4 性状A、b、K进行GWAS的Manhattan图 Fig. 4 Manhattan plots of GWAS for A, b, K |
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表 5 性状A、b、K的GWAS结果 Table 5 The result of GWAS for A, b, K |
表 3给出了3种曲线模型的拟合结果，3种模型的拟合度R2都在0.95以上，模拟效果最好的是Gompertz模型，R2达到了0.954，而其他两种模型R2虽然也有0.951，但是根据参数发现，两种模型的成熟体重分别为551.0和1 458.5 kg，而中国肉用西门塔尔牛的成熟体重在600~800 kg[27]，两种模型的成熟体重偏差较大，说明Logistic模型和Brody模型可能不适合本次肉用中国西门塔尔牛体重数据的拟合。从图 1中也可以看出，拟合效果最好的是Gompertz模型，其曲线与原始数据曲线基本重合，这与梁永虎等[29]对于体重数据所选的生长曲线模型相一致。表 4给出了Gompertz模型参数的描述性统计，模型中参数A代表成熟体重，然而，A也出现了一些极值个体，如388.94 kg，对比原始记录中18月龄体重仅为346 kg，分析原因可能是个体发育异常，生长速度较慢等；参数b代表达到最大生长率的时间，说明中国肉用西门塔尔牛在3月龄左右生长速度最快，最大值为9月龄，最小值在2月龄，而乌拉盖地区的肉用西门塔尔牛在出生到1周岁这一时期内生长速度最快，符合本研究结果，因此选择Gompertz模型获得的参数A、b、K作为表型来进行GWAS。
3.2 GWAS和候选基因的功能分析参数A、b、K的Q-Q图整体效果都较好，大多数点都位于对角线上，表明观察值和期望值的吻合度很高；Manhattan图显示出成熟体重(A)性状检测到了9个显著的SNPs，多数位于7和11号染色体上，对于性状达到最大生长率的时间(b)来说，共检测到了49个显著的SNPs，对于成熟率(K)来说，检测到了7个显著的SNPs，集中分布于22和25号染色体上。
通过基因功能注释筛选到了与显著SNPs关联的基因，并且其中有部分基因已经被鉴定出与生长发育性状有关系。对于成熟体重(A)来说，ARS-BFGL-NGS-14531位点的显著性最好，它临近PLIN3基因，PLIN3基因是脂肪组织中脂肪分解和甘油三酯储存的重要调节因子[31]，与皮脂腺脂肪生成相关的脂肪生成途径交织在一起，如去饱和甘油三酯的合成[32]；3个显著的SNPs都临近KCNS3基因，而KCNS3基因被证明与脂肪百分比(%BF)性状显著关联[33]，可作为发育性状的候选基因；在性状达到最大生长率的时间(b)中，有两个显著的SNPs坐落于TMCO1基因内，其与PRKAG3基因有显著的相互作用，这种作用可能会影响肌肉发育[34]；2个显著SNPs临近ANGPTL2基因，有研究表明，其可能作为新型的脂肪细胞因子[35]，与动物的脂肪发育有显著关联；1个显著SNP坐落于CFB基因内，CFB基因被鉴定出与猪的出生仔猪数有关[36]；4个显著的SNPs坐落于或临近IGF-1基因，而IGF-1基因被认为在生长发育中起着中心作用[37]；4个显著的SNPs坐落于或临近ALPL基因，有研究表明，肥胖者的白细胞中ALPL的基因表达水平明显高于瘦者，表明ALPL基因可能与肥胖有关[38]；有1个显著的SNP临近ASPH基因，而ASPH基因参与调控肉牛胴体和肉质性状[39]；2个显著的SNPs坐落于EPHA4基因内，其是猪生殖性状的潜在候选基因之一[40]；成熟率(K)的7个显著SNPs集中分布于22和25号染色体上，并且发现了两个关联基因，分别为GRM7和SHISA9基因，其中SHISA9基因被发现与生长发育有关[41]。
4 结论本研究首先分别利用Gompertz、Logistic、Brody 3种生长曲线模型对中国肉用西门塔尔牛的体重进行生长曲线的拟合，选择R2最高的Gompertz模型所获得的参数A、b、K作为表型进行GWAS，定位到了一些与生长发育性状相关的候选基因，为其他纵向数据的研究提供了参考，也为调控肉牛生长发育进而提高产肉量的育种工作提供了新的候选分子标记。
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