, CUI Xinxin, PAN Liangqi, XU Fengxiang, LI Shuo, WU Meihua, ZHU Xuhui, YU Yanan, LI Mingliang, LIU Yang, QU Xiaoyun, LIAO Ming, SUN Hailiang
1992年, H9N2禽流感病毒(AIV)在广东地区首次暴发，随后向其他地区蔓延[1]，1998年，迅速扩散到中国大部分省份[2]，已成为鸡群中流行的禽流感病毒的主要亚型[3]。H9N2 AIV不但给养禽业造成了巨大的经济损失，而且跨宿主传播感染哺乳动物和人，给公共卫生安全构成严重威胁。1998年，从香港地区猪身上分离到H9N2 AIV，随之陆续有猪感染H9N2 AIV的报道[4-7]。1998年，首次出现人感染H9N2 AIV的病例[8]，近年来不断有人感染H9N2 AIV的报道[9-12]，血清学研究结果表明从事家禽行业的人群H9N2 AIV抗体率高达15%[13-15]。据WHO统计，2015年12月—2020年8月28日，中国已经累计33人感染H9N2 AIV。另外，新型H7N9和H10N8 AIV的内部基因均来自H9N2 AIV[16-17]，导致人员感染并引起死亡，给公共卫生安全造成严重威胁。因此，加强对H9N2 AIV的监测，解析病毒致病性和跨宿主传播能力的变化，对于流感病毒的综合防控具有重要意义。
1 当前中国H9N2 AIV的流行分布为了解中国H9N2 AIV的流行分布情况，作者对NCBI上2016—2020年，3 014株H9N2 AIV的分离时间、地域和宿主进行了分析。结果显示，2016—2020年，中国H9N2 AIV分布在山东、广东、安徽、广西、湖南、湖北、福建、江西、云南、江苏、浙江、重庆、黑龙江、山西、西藏、青海、宁夏、四川、北京、天津、上海、贵州等地。其中，H9N2 AIV分布较为密集地区为江西、广东、贵州、江苏，其次为云南、上海等(表 1)。从病毒的分离来源来看，2016—2020年，中国流行的H9N2 AIV主要来自鸡，少数来自鹌鹑、鸭、鹅，极少数分离自人。
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表 1 2016—2020年中国H9N2禽流感病毒流行分布 Table 1 Distribution of H9N2 avian influenza virus in China in 2016-2020 |
H9N2 AIV全球广泛分布，主要分为北美、欧亚两个分支，其中欧亚分支进一步分为BJ/94-like(或Y280-like)、G1-like、Y439-like、F/98-like等[18-19]。在中国，早期H9N2禽流感主要发生在香港和广东地区，1995—2000年传播到内陆地区[20]。参考HA进化分支方法[21]，中国H9N2 AIV主要分布在h9.4.2分支。2007年之前，中国主要流行h9.4.2.1-h9.4.2.4分支的H9N2 AIV，2007年之后，h9.4.2.5分支的H9N2 AIV逐渐成为主流，大约在2010年，h9.4.2.6分支的H9N2 AIV也扩展到全国各地，但是h9.4.2.5分支的H9N2 AIV比h9.4.2.6分支更加普遍[19]。先前H9N2 AIV NA分为BJ/94-like、G1-like和Korea-like 3个分支[22-23]。现在中国流行的H9N2 AIV NA演化为4个分支(Clade 0~3)，并且Clade 2分支的病毒在2010年后占据了主导地位[24]。
为了解中国当前流行的H9N2 AIV的遗传演化情况，对NCBI上2016—2020年中国H9N2 AIV的HA、NA序列进行遗传演化分析，HA系统发育树结果表明，当前中国流行的H9N2 AIV绝大部分毒株隶属于h9.4.2.5分支，极少部分毒株隶属于h9.4.2.1分支，h9.4.2.6分支的病毒已经不再流行(图 1)。NA系统发育树结果表明，当前中国流行的H9N2 AIV绝大部分毒株隶属于BJ/94分支中的Clade 2亚分支(图 2)。综上所述，当前中国流行的H9N2 AIV主要为h9.4.2.5分支的病毒。
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图 1 2016—2020年中国H9N2 AIV HA遗传演化 Fig. 1 Genetic evolution of H9N2 AIV HA in China from 2016 to 2020 |
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图 2 2016—2020年中国H9N2 AIV NA遗传演化 Fig. 2 Genetic evolution of H9N2 AIV NA in China from 2016 to 2020 |
当前H9N2禽流感病毒受体结合特性主要表现为双嗜性和优先结合α-2, 6 SA受体，增强了病毒跨宿主传播感染哺乳动物的能力。中国早期的H9N2 AIV优先结合α-2, 3 SA受体[25-26]，伴随着病毒的持续流行，病毒的受体结合特性也发生了变化，近些年流行的H9N2 AIV表现出双嗜性，并且结合α-2, 6 SA受体的能力高于结合α-2, 3 SA受体的能力，或者优先结合α-2, 6 SA受体的特性[26-32] (表 2)。
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表 2 H9N2 AIV受体嗜性演化情况 Table 2 Phylogenetic evolution of H9N2 AIV receptor |
HA蛋白的突变会改变病毒与受体的结合嗜性和结合强度。据报道，N313D、N496S、A180T/V、HA2-D46E突变增强病毒与α-2, 6 SA和α-2, 3 SA受体的能力[26, 33-34]。220-loop缺失以及Q226L突变增强病毒与α-2, 6 SA受体结合的能力[35-36]，而Q227P突变增强病毒与α-2, 3 SA受体结合的能力。Q226L突变可以增强绝大多数H9N2 AIV结合α-2, 6 SA受体的能力，也有一些病毒虽然拥有226L，但是与α-2, 6 SA受体的结合能力较差[37-38]。中国2016—2020年流行的H9N2 AIV中，99.5% (2 998/ 3 014) 毒株的HA蛋白第226位为L，这表明当前中国流行的H9N2 AIV普遍增强与α-2, 6 SA受体结合的能力，增加病毒跨宿主感染哺乳动物的风险。
4 当前H9N2禽流感病毒抗原性分析H9N2 AIV持续暴发给养禽业造成了巨大损失，为进一步防控H9N2 AIV，中国自1998年开始使用疫苗[39]。伴随H9N2 AIV持续流行，病毒的抗原也发生了一定的变化。1998—2007年, 全国分离的20株H9N2 AIV中，有18株病毒与A/CK/SD/6/96疫苗株的抗血清反应不佳(HI≤640)，有4株2007年的病毒与A/CK/SH/F/98疫苗株抗血清反应较差(HI≤80)[40]。2012—2013年，山东分离的6株H9N2 AIV与A/CK/GD/SS/94疫苗株抗血清反应较差(HI≤320)，与它们本血清反应良好(HI≥1 280)[41]。2002年和2006—2014年，上海分离的14株H9N2 AIV，虽然起源于A/CK/SH/F/98，但是与其存在抗原距离[42]。对2011—2014年分离的28株H9N2 AIV和疫苗株SH/F/98和GD/SS/94进行分析，结果显示，其中，4株病毒的抗血清与疫苗株H9N2 AIV及大多数分离株的反应较差[43]。对2013—2016年西南地区分离的12株H9N2 AIV与A/CK/GD/SS/94和A/CK/SD/6/96疫苗株进行分析，结果显示，2014—2016年，分离毒株比2013年分离毒株与疫苗株的抗原性差异更显著[44]，2017—2018年，山东地区分离的H9N2 AIV与A/CK/SH/F/98和A/CK/GD/SS/94疫苗株抗血清反应中等或者较差[45]。综上所述，与早期病毒相比，近些年流行的H9N2 AIV已经出现了抗原变异的现象。
HA蛋白是诱导产生中和抗体的主要抗原。H9N2 AIV HA蛋白的一些位点也陆续被揭示与抗原变异相关。Kaverin定义了两个抗原位点，位点Ⅰ(147、165、170)，位点Ⅱ(145、197、206)，以及重叠位点(153、201、234)[46]。Wan等[47]揭示了两个独立的抗原位点“H9-1”(147、164、167、168)和“H9-2”(153、196、200、201、207)。HA蛋白218位糖基化位点缺失，同时，313位糖基化位点的出现增加了病毒与抗体的结合，中度阻止了病毒对同源抗血清中和作用的逃逸[48]。HA蛋白N166D突变降低了病毒对鸡的免疫原性[49]，而D200N突变提高了病毒与单克隆抗体的反应滴度[50]，N166D突变降低病毒鸡的弱抗体反应。另外，92、90、166、133、138、141、143、149、157、180、230、234、252等位点也被证实与抗原相关[46, 51-54](表 3)。
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表 3 2016—2020年中国H9N2 AIV HA蛋白关键位点氨基酸的自然突变 Table 3 Natural mutations of amino acids at key sites of H9N2 AIV HA protein in China from 2016 to 2020 |
为了解中国当前H9N2 AIV抗原变异情况，对NCBI上2016—2020年中国H9N2 AIV序列进行分析，结果显示，在已经报道的抗原位点中，除了165和170位点的氨基酸比较保守外[46, 52]，其他位点的氨基酸都出现了多态性，其中，90、141、143、147、163、234、235位点的氨基酸呈现双态性，剩余位点的氨基酸为3态及以上。218和313糖基化位点的缺失也改变病毒的抗原。综上所述，当前中国H9N2 AIV的抗原正在发生着改变。
5 H9N2禽流感病毒的致病性当前，H9N2 AIV持续在鸡群暴发, 给养禽业造成了巨大损失。H9N2为低致病性AIV，但近年来，致病性和跨宿主传播能力呈现出增强的趋势，出现了感染猪和人的案例，给公共卫生安全带来一定的挑战。早期的H9N2 AIV毒株感染鸡，主要在呼吸道复制，偶尔可以从泄殖腔拭子中检测到病毒，只具有通过直接接触方式在鸡群中传播的能力，1998年的毒株具备了通过气溶胶在鸡群中传播的能力[55]。2013—2015年的H9N2 AIV，泄殖腔排毒的能力增强，通过泄殖腔的排毒量明显高于通过口咽，感染鸡群表现临床症状，随之出现死亡现象。病毒除了在呼吸道复制以外，还可以在脾、肝、肾和脑中复制[31, 56]。2017年的毒株可导致小家禽(鹌鹑)的喉头、气管、肺和心出现较为严重的病理损伤[57](表 4)。
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表 4 H9N2 AIV的致病性变化 Table 4 Pathogenicity changes of H9N2 AIV |
H9N2 AIV对哺乳动物的致病性也在发生变化。H9N2 AIV感染小鼠后，主要在肺进行复制，引起肺的病理变化，并引起小鼠体重的减轻，有些病毒还可以在鼻甲中进行复制[28, 31, 58-60]。H9N2 AIV感染豚鼠后，可以通过鼻腔向外排毒，但不具备通过直接接触方式进行传播的能力[26, 31]。H9N2 AIV感染雪貂，主要在鼻甲、气管和肺等呼吸道复制，有的病毒还可以在脾中复制[28](表 4)。H9N2 AIV的某些蛋白发生突变，增强了病毒在哺乳动物细胞上的复制能力，增强病毒对哺乳动物的致病性。PB2蛋白E627K突变增强病毒对小鼠的致病性，Q591K突变增强病毒对小鼠的致病性，增强病毒在人气管上皮细胞的复制能力，D195N、I292V、D253N突变增强病毒在人胚胎肾细胞(293T)或者人肺癌细胞(A549) 上的复制能力[26, 61-64]。PB1蛋白K577E突变增强病毒对小鼠的毒力以及在293T细胞上的聚合酶活性。PA蛋白K356R突变增强病毒对小鼠的致病性以及在A549和MDCK细胞上的复制能力[67]。HA蛋白N132D、N198S、T190V突变增强病毒对小鼠的毒力[27, 61]。HA2蛋白D46E增强病毒的热稳定性，致使病毒具备了通过直接接触方式在豚鼠间进行传播的能力。HA1蛋白Q227P和NP蛋白E434K突变，增强了病毒在293T细胞上的聚合酶活性，促使病毒可以通过直接接触方式在豚鼠间传播[26](表 5)。
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表 5 突变对H9N2 AIV复制及致病性的影响 Table 5 Effects of mutation on replication and pathogenicity of H9N2 AIV |
作者对NCBI上2016—2020年中国H9N2 AIV序列进行分析，结果显示，PB2蛋白第292位氨基酸为V的比例为87%(34/154)，第195位氨基酸为N和第627位氨基酸为K的比例均为1.3%(2/154)；PA蛋白第356位氨基酸为R的比例为94.2%(47/154)；HA蛋白第190位氨基酸为V的比例为2.8%(85/3 014)。这表明，当前中国流行的H9N2 AIV PB2、PA和HA蛋白获得了一定的适应性突变，增强了在哺乳动物细胞上的复制能力，增强对小鼠的致病性，增加了跨宿主传播甚至感染人的风险。
6 小结与展望H9N2 AIVs不断发生变异和重组，受体结合特性趋于双嗜性或者优先结合人类受体，致病性有增强的趋势，抗原特性也在发生着改变，增加了跨宿主传播甚者感染人的风险。目前，疫苗接种仍然是防控AIVs的主要手段。但是近年来出现了H9N2疫苗免疫后仍然排毒的情况，这使得H9N2 AIVs的防控变得更为棘手。一方面，可以通过遴选新抗原毒株、研制新型疫苗，开发新型佐剂等，提高H9N2疫苗的免疫效果。另一方面，应该强化生物安全防控理念，提高生物安全防控技术，采用生物安全防控手段控制疾病的发生。切实做好H9N2等低致病性AIVs的防控，保障养禽业的健康发展和公共卫生的安全。
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