基因编辑技术(gene editing technology)是指可以对基因组进行定点编辑的技术[1],该技术始于基因打靶技术,随后经历了锌指核酸内切酶技术(zinc-finger nuclease, ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶技术(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)和规律性成簇间隔的短回文重复序列/CRISPR相关蛋白技术(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated, CRISPR/Cas)三次革命性的突破,基因定点修饰的效率不断提高,给基因编辑技术的应用带来了全新的发展方向。第三代基因编辑技术CRISPR/Cas系统是一种适应性免疫系统,科研人员研究发现,根据不同Cas蛋白的序列和结构之间的差异, 可以将CRISPR/Cas系统分为3种类型,每种类型的CRISPR/Cas系统又可细分为A、B、C 3种亚型[2],目前应用最为广泛的CRISPR/Cas9系统属于Type Ⅱ类、A型,其余类型的CRISPR/Cas系统由于免疫机制非常复杂,并未应用于基因组工程中。
CRISPR/Cas9系统来自于酿脓链球菌(streptococcus pyogenes),即A群链球菌(group A streptococcus, GAS)和嗜热链球菌(streptococcus thermophilus),是现今应用最为广泛的可以靶向基因组DNA特定位点并进行修饰的工具[3]。利用CRISPR/Cas9系统可以在不同物种以及多种细胞类型中进行定点、精确的基因编辑。该系统具有应用成本低、适用编辑范围广、打靶效率高、操作简单、可支持多位点操作等优点,已成功应用于多种家畜高繁殖性状、生产性能以及强抗病性状的培育和改良、试验动物疾病模型的构建和病毒学等诸多领域[4],并取得了许多重要成果。对于家畜育种而言,遗传进展慢和育种成本高是限制我国自主化良种家畜培育的“卡脖子”问题。而新的基因精准编辑技术的产生与应用对家畜育种和疾病防控等产生了巨大和深远的影响。目前,家畜基因编辑育种已成为世界各国进行技术和种质资源创新的研究制高点,我国也先后在猪、牛等家畜品种中创建了基因编辑育种技术体系,创制了一批基因编辑牛羊育种新材料。本文就最新一代CRISPR/Cas9基因编辑技术在提高家畜繁殖性能、生产性能、抗病性能等方面的研究应用进行综述,重点介绍该系统在家畜育种学研究中已取得的最新进展,并就CRISPR/Cas9基因编辑技术在家畜育种应用中现存的问题及其应用前景进行简要论述。
1 CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展历程与研究现状CRISPR/Cas9基因编辑技术的研究始于20世纪80年代,随着研究的一步步深入,CRISPR/Cas9基因编辑技术不断被人们所熟知并广泛应用(图 1),在应用的过程中为强化系统优势,消除自身存在的一些弊端,CRISPR/Cas9基因编辑系统仍处于不断被优化的过程中,不断的创新性研究推动其发展成为一个高度动态的微生物学技术,在此过程中该技术的效率也在不断提升。
1987年,Ishino等[5]在研究K12型大肠杆菌中的碱性磷酸酶同工酶(alkaline phosphatase isozyme,IAP)时,首次发现了一种不知其功能的特殊的DNA回文序列。但直到2000年,Mojica等[6]才发现这些重复序列在细菌中发挥着重要的调控作用,并将其命名为规律性成簇间隔的短回文重复序列,简称:CRISPR。并且在这一过程中还发现了一些与CRISPR位于同一基因簇的核酸酶,统称为CRISPR-associated蛋白,即Cas蛋白。此后随着科研人员研究的不断深入,CRISPR/Cas9系统在细菌内的作用机制被揭示,并于2012年成功在体外构建了CRISPR/Cas9系统,实现了对DNA的精准编辑[7-8]。2015年,Ran等[1]将CRISPR/Cas9系统成功应用于小鼠体内。此后CRISPR/Cas9系统迈入迅猛发展的时代,短短几年时间便成功应用于不同物种的多种领域。CRISPR/Cas9系统还被构建成CRISPR/Cas9文库,在体内和体外实现功能性基因的筛选[9]。2017年,Xu等[10]将CRISPR文库构建在piggyBac载体上,在小鼠肝内成功筛选到与肝癌相关的基因。
1.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术的改造和优化进展人类对CRISPR/Cas9系统不断的研究推动其发展成为一个高度动态的微生物学技术,为强化系统优势和消除其自身存在的弊端,科研人员对其组成部分Cas9蛋白[11-12]和sgRNA[13]进行了一系列的创新性改造(图 1),以期达到提高Cas9保真性、效率、使用范围以及降低脱靶效率等目的,多种多样的变体正在不断涌现。此外,为提高Cas9蛋白的效率,人们尝试将Cas9蛋白的分子量缩小,先后发现的SpCas9、SaCas9、NmCas9等不同种属的分子量更小的Cas9变体蛋白均已成功得到应用[14-15]。但研究发现,它们依然存在一定的问题,如CRISPR/SaCas9系统的活性不高,且需要复杂的启动相关的基因序列,因此,限制了该系统的使用范围[16]。随后,人们通过在Cas9核酸酶结构域(RuvC)引入单碱基突变(D10A或H840A)使该结构域发生失活进而制备出仅能切割一条DNA链的Cas9切口酶(Cas9 nickase,Cas9n)。研究发现,将Cas9n与两条不同的sgRNA结合使用,可以增加CRISPR/Cas9n系统的特异性,还可以增加基因编辑的使用范围,实现较大基因片段的编辑[17]。当Cas9两个结构域(RuvC和HNH)都发生突变时,可以得到没有切割活性只有结合活性的dCas9蛋白(nickase-dead Cas9,dCas9),而CRISPR/dCas9系统可以在不损伤基因组DNA的情况下,在转录、表达水平对基因组的特定位点进行调控[18]。此外,科研人员还发现,通过调控Cas9蛋白的活性也可有效提高CRISPR/Cas9系统的编辑效率,目前已经发现多种办法可以成功调控Cas9的活性,包括改变运输方式和引入适体核酸(aptazyme)组件等,均可在一定程度上提高CRISPR/Cas9系统的效率[19-20]。
传统的CRISPR/Cas9系统都是通过引入DNA双链断裂(DNA double-strand break,DSBs)从而进行基因编辑的,这种方式容易导致过度的DNA损伤或细胞死亡[21]。随着人们探索的不断深入,2016年,Komor等[22]首次将胞嘧啶脱氨酶APOBEC1与CRISPR/Cas9系统融合,获得可高效诱导DNA由胞嘧啶(cytosine, C)向胸腺嘧啶(thymine, T)单碱基转换的系统,并将其命名为胞嘧啶单碱基编辑器(cytosine base editor, CBE),该技术可在不发生双链断裂和没有供体模板的情况下实现对目标基因的编辑。2017年,Gaudelli等[23]又成功研发出可实现DNA由腺嘌呤(adenine, A)向鸟嘌呤(guanine, G)精确转换的腺嘌呤单碱基编辑器(adenine base editor, ABE)。单碱基编辑器技术的问世,实现了在不发生DNA双链断裂也不引入重组修复模板的情况下,对基因组的单个碱基进行编辑的可能,使CRISPR/Cas9技术更加安全、高效和精准。然而,Zuo等[24]和Jin等[25]分别在小鼠胚胎基因组和水稻基因组编辑中发现,CBE存在严重脱靶效应。而这可能是因为普遍存在的五碱基对编辑窗口中存在不止一个C时,现有的碱基编辑器会产生不必要的C→T转换的可能,进而导致单碱基编辑有可能产生大量无法预测的脱靶突变,为此,科学家开始尝试提高单碱基编辑器的精度,从而降低脱靶效率,2018年,Gehrke等[26]设计了一种根据TCR>TCY> VCN层次结构优先对特定基序中胞嘧啶去氨基化的APOBEC3A-Cas9单碱基突变(APOBEC3A-Cas9 base editor)技术,通过密码子优化和加入额外的核定位序列,极大地降低了单碱基突变脱靶率和错误率。2020年,Wang等[27]研发并验证了利用腺嘌呤碱基编辑介导的起始密码子突变实现高效基因沉默(i-Silence)的新方法,该方法通过单碱基编辑器介导起始密码子从ATG突变到GTG或ACG,进而实现基因沉默。研究表明,该方法可以在不产生不必要编辑的情况下精确地诱导目标基因沉默,是更安全、高效的基因敲除方法,具有广阔的应用前景。
在降低脱靶效率方面,2019年,Zuo等[24]首先建立了新型脱靶检测技术GOTI(genome-wide off-target analysis by two-cell embryo injection),以此来提升基因编辑技术脱靶检测的敏感性,尤其是在发现基因编辑完全随机的脱靶位点上具有更高的准确性。2019年,Anzalone等[28]成功研发了一种超精确的新型基因编辑工具并将其命名为Prime Editor,该工具可将Cas9切口酶和反转录酶融合在一起,反转录酶可以依据提供的模板序列将突变精确写入到靶位点。Prime Editor技术在不需要依赖供体模板和DNA双链断裂的情况下,实现了所有4种单碱基的自由转换,在该研究中实现了44个碱基的插入和80个碱基的删除。Prime Editor技术的问世有效解决了单碱基编辑器存在的不能随意编辑所有碱基以及较为严重的脱靶效应的问题,同时,极大地提高了CRISPR/Cas9系统的使用范围、编辑准确度和效率。
2 CRISPR/Cas9基因编辑技术的作用机理 2.1 CRISPR/Cas9系统的组成CRISPR/Cas9系统的基因座主要包括以下几部分:CRISPR相关蛋白基因座(CRISPR Cas genes)、前导序列(leader)以及由不连续的重复序列(repeat)和间隔序列(spacers)间隔排列组合而成的CRISPR簇(CRISPR array)[1],见图 2。
当病毒侵染细菌时,CRISPR/Cas系统主要通过以下几个步骤发挥作用(图 3)。适应阶段: 宿主捕获、识别到病毒的外源DNA中由NGG(N为任意碱基)3~7个碱基组成的,主要参与Cas蛋白识别外源基因工作的原间隔序列(protospacer adjacent motif,PAM),并将病毒DNA整合到CRISPR簇中,形成重复序列。转录阶段: 当宿主再次检测到入侵者时,首先,CRISPR簇转录生成前体RNA转录物(pre-CRISPR RNA,pre-crRNA),与此同时获得反式激活的CRISPR重复区互补的反式编码RNA(trans-activating crRNA,tracrRNA),随后,pre-crRNA与tracrRNA结合进一步加工为成熟的、较小的、能够发挥功能的crRNA。干扰阶段:crRNA和tracrRNA通过碱基互补形成双链RNA结构,Cas蛋白在双链RNA的介导下识别再次入侵的病毒DNA靶序列,并对靶序列进行切割和降解。研究发现,尽管不同种CRISPR/Cas系统的Cas蛋白不尽相同,但是当病毒入侵细菌时所有的CRISPR/Cas系统大多通过以上3个步骤来抵御入侵。
研究发现,只有成熟的crRNA和tracrRNA通过碱基互补配对形成双链RNA结构后,才能引导Cas9蛋白靶向到基因的特定位点,发挥内切酶活性进行切割[8]。为操作方便,科学家将crRNA和tracrRNA进行适当的改造,整合成一条单链RNA,即单链引导RNA(single guide RNA,sgRNA),从而将CRISPR/Cas9系统简化为两部分:sgRNA和Cas9蛋白,其中,作为应用最为广泛的CRISPR/Cas9系统,它的工作原理(图 4):1)具有核酸酶活性的Cas9蛋白在sgRNA的引导下,特异性识别原间隔序列相邻基序。2)当Cas9蛋白靶向到靶DNA指定位点后,发挥核酸酶作用,完成对DNA双链的切割,造成双链断裂(double-strand break,DSB)。3)当靶DNA双链断裂后,细胞启动自我修复机制,利用非同源末端连接修复(non-homology end joining,NHEJ)和同源重组修复(homology dependent repair,HDR)两种方式对基因进行修复。在此环节,科研人员引入外源基因,通过同源重组的方式将目的基因整合到靶基因中,随后,外源基因便可在受体细胞中进行表达,从而实现基因编辑的效果[21]。
CRISPR/Cas9系统自问世以来,广泛应用于微生物、动植物等诸多物种,展现出极大的应用前景。家畜基因编辑育种已成为世界各国进行技术和种质资源创新的研究制高点,我国也先后在猪、牛等家畜品种中创建了基因编辑育种技术体系,创制了一批基因编辑牛、羊、猪等育种新材料(表 1),在培育具有世界竞争力的家畜品种,提高我国畜牧产业的国际竞争力等方面具有重大的应用前景。
转基因技术的问世,为解决家畜诸多方面尤其是繁殖方面的问题提供了全新的思路和方法,但是对于猪、牛、羊等大型家畜来说,转基因技术在育种、繁殖方面的应用进展缓慢,而CRISPR/Cas9系统的问世,极大程度地改变了这一局面,科研人员利用CRISPR/Cas9系统在不同家畜的繁殖育种方面均取得了突破性进展[29-31]。CRISPR/Cas9系统可以高效地操纵特定基因,根据需求实现物种内品种间的一个或多个主效应基因的转移,从而达到高效育种、繁殖的目的,有效提高牧场的经济效益。
研究发现,在雌性动物卵泡发育过程中BMP15和GDF9基因均扮演重要角色,冯万有[29]利用CRISPR/Cas9靶向基因编辑技术突变BMP15和GDF9基因,进而提高水牛繁殖性能。Xist是一种非编码RNA,可以使雌性小鼠的两条X染色体中的一条失活,它在克隆小鼠胚胎中X(Xa)染色体上的异位表达严重影响了克隆效率。2010年,Inoue等[30]通过敲除雄性体细胞Xist成功将克隆效率提高了8~9倍。Matoba等[31]通过RNAi降低了克隆胚胎中Xist的表达水平,将克隆效率提高了10倍以上。相信将来CRISPR/Cas9系统对Xist的精确编辑将有效提高家畜Xist的敲除效率,进一步提高家畜克隆效率。
3.2 在高生产性能育种新材料创制中的应用利用CRISPR/Cas9系统进行基因敲除或敲入可极大改良家畜的生产性能,在改善肉品质、提高产肉量和提升被毛质量等方面都具有显著成效。
IGF2是重要的胰岛素样生长因子,对家畜胚胎和出生后的生长及肌肉细胞增殖均有重要调控作用。研究发现,IGF2经由肝产生后作用于靶细胞可促进细胞迁移、增殖和分化[32]。2018年,Xiang等[33]使用CRISPR-Cas9技术编辑IGF2内含子3的3 072位点,获得了在该调控元件周围12个不同等位基因发生突变的猪,该猪及子代猪在不影响肉质的情况下生长速度显著提高,通过该试验可提高巴马猪的产肉量,且首次证明编辑非编码区域可以改善家畜的经济性状。2019年,Liu等[34]利用CRISPR/Cas9系统在中国本土猪品种梁光小斑点猪的猪胚胎成纤维细胞(PEFs)中,对IGF2内含子3中ZBED6结合位点基序有效破坏,从而有效提高了该品系的瘦肉率,具有重要的商业价值。肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)广泛存在于猪、牛、羊等动物体内,起到抑制骨骼肌发育和生长的作用,可以显著增加肌纤维的直径、提高肌纤维数量[35],属于转化生长因子-β(transforming growth factor-β superfamily,TGF-β)超家族。研究表明,MSTN的基因功能异常是导致动物具有双肌性状的遗传基础[36]。2014年,Ni等[37]利用CRISPR/Cas9系统在山羊原代成纤维细胞中进行基因编辑,获得了同时敲除肌肉生长抑制素、核孔蛋白155(NUP)、朊蛋白(PrP)和β-乳球蛋白(BLG)4个基因的单克隆细胞系,成功获得了MSTN敲除羊,为改良羊肉品质奠定了基础。2015年,Wang等[38]成功敲除山羊MSTN使之呈现双肌表型,从而加速了优质山羊的培育进程。随后,张驹[39]利用CRISPR/Cas9技术对山羊的MSTN基因进行敲除,同时,在一特定位点中插入了Fat-1基因以替代MSTN基因,从而得到了既可以在体内高表达Fat-1基因,又有效提升羊肉中ω-3含量,还能增加羊肉产量的绒山羊。此后,诸多科学家利用CRISPR/Cas9系统敲除MSTN,成功培育出高产肉量的猪、牛、羊[40-41]。
毛皮一直是牧场经济收入来源的一个重要方面,如何有效提高家畜毛皮质量一直是牧场及科研工作者探索的方向。随着控制家畜毛皮基因的不断发现,使利用CRISPR/Cas9系统快速提升家畜毛皮质量成为可能。2015年,Wang等[40]利用CRISPR/Cas9技术敲除了山羊的FGF5和MSTN基因,获得了被毛长度显著增加、且呈现双肌表型特点的山羊个体,该试验实现了在山羊体内同时敲除多个基因,为获得优质绒山羊提供了新的思路和理论依据。Zhang等[42]利用CRISPR/Cas9技术编辑毛色基因ASIP,首次获得不同毛色的遗传修饰绵羊。在规模养殖中,牛角的存在极易造成牛只的意外伤害甚至流产,而传统的去角方法不仅给牛只带来巨大痛苦还会造成牛只出现严重的应激反应,不仅不符合动物福利还会给牧场带来较大的经济损失[43]。因此,科研人员致力于通过现代基因编辑技术进行无角牛的培育。研究发现,控制无角性状的基因位于1号染色体,为202 bp的重复,被称为Pc(polledness of celtic origin)位点。该位点与牛的生产性能等均不相关,具有较为简单的遗传性,比较适合进行基因编辑。2020年,谷明娟等[44]利用CRISPR/Cas9技术, 将Pc位点P202ID基因型定点整合到有角蒙古牛(bos taurus)胎儿成纤维细胞基因组中, 得到4株定点整合入细胞基因组的阳性单克隆细胞。该试验为培育无角体细胞克隆牛提供了试验材料和技术支撑, 为研究牛角的发生发育机制提供了基础材料。
3.3 在抗病育种新材料创制中的应用家畜疾病如疯牛病、猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟等一直给养殖人员造成巨大的困扰,给养殖业带来了严重的经济损失,疾病已然成为制约畜牧业发展的重要因素之一。不仅如此,某些家畜疾病及其不当治疗在一定程度上还会对人类的生命安全造成影响,如人畜共患病的暴发、食品质量安全、药物残留等问题。研究发现,很多家畜疾病依靠防疫和药物治疗等传统方法无法得到解决。随着基因编辑技术的不断发展和应用,科研人员发现,将CRISPR/Cas9系统应用于抗病家畜的制备具备良好的应用前景。
2016年,Bevacqua等[45]利用CRISPR/Cas9系统在牛胎儿成纤维细胞和IVF胚胎中诱导引起疯牛病的PRNP基因的敲除和等位基因的敲入,为治愈疯牛病奠定了基础。2017年,Gao等[46]利用CRISPR/Cas9系统介导的同源重组技术证明了单个Cas9n诱导的单链断裂可以刺激自然抗性相关巨噬细胞蛋白-1 (NRAMP1)基因的插入,显著降低了脱靶效应发生的机率,同时通过体细胞核移植,获得了增加抵抗结核病能力的转基因牛。猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的接触性传染病,严重制约了养猪业的发展[47]。研究发现,CD163是PRRSV侵染的主要受体,它很大程度上决定了病毒对细胞的敏感性[48]。随后,人们对其进行研究,以期获得抗PRRSV的猪。2019年,Chen等[49]利用CRISPR/Cas9系统结合供体载体,将猪CD163的第7外显子替换为人CD163-like 1 (hCD163L1)的相应外显子,显著抑制了PRRSV病毒的复制,保护猪免受HP-PRRSV感染,该研究为利用基因编辑技术培育抗PRRSV猪提供了新的方向。猪瘟(classical swine fever, CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起的严重危害养猪行业发展的疾病之一,具有极大的危害性和普遍性。2018年,Xie等[50]通过CRISPR/Cas9介导的敲入策略将筛选出的能有效抑制猪瘟病毒复制的shRNA基因精确地整合到了猪内源Rosa26位点,从而获得了抗CSFV猪,试验证明,利用该方法可有效限制CSFV在猪体内的复制表达,同时还减轻了CSF的临床症状,降低了死亡率,并且发现,抗CSFV猪还可以将抗病性稳定地传给F1代,该试验为防治猪瘟提供了新的思路。
3.4 在基因修饰疾病模型制备中的应用利用CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术可快速建立和模拟基因突变的动物或细胞模型,从而揭示基因突变与生物功能发生变化的关系,同时通过构建动物模型也可揭示与疾病相关基因的具体功能,为治疗家畜乃至人类疾病提供理论基础[51]。2014,Hai等[52]利用CRISPR/Cas9系统对vWF进行编辑,成功构建出血管性血友病动物模型,为该病的发病机制、遗传基础以及治疗方法的研究提供了很好的试验动物模型。2017年,Huang等[53]将CRISPR/Cas9系统应用于美国巴马小型猪,同时靶向敲除载脂蛋白E (apo lipoprotein E, ApoE)和低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor,LDLR)基因,成功获得双等位基因敲除猪,所构建的动物模型对治疗人类心血管疾病和相关转化研究具有重要参考意义。2018年,Yan等[54]利用CRISPR/Cas9基因编辑和体细胞核移植技术,成功培育出世界首例人突变亨廷顿基因(HTT)敲入猪,精准地模拟出人类神经退行性疾病,成功建立了神经退行性疾病亨廷顿病猪疾病模型。同年,Zhu等[55]结合CRISPR/Cas9和体细胞核移植技术,成功培育出世界首例亨廷顿舞蹈病基因敲入迷你猪,为研发治疗亨廷顿舞蹈症新药提供了稳定可靠的动物模型。
此外,基因修饰猪是解决移植器官短缺的重要途径,猪的异种器官移植一直是科学家探索的方向,但是猪内源性逆转录病毒(PERVs)跨物种传播对人体来说存在患新型疾病的潜在风险。2017年,Niu等[56]利用CRISPR/Cas9系统在猪原代细胞系中灭活了所有的PERV,并通过体细胞核移植成功获得了PERV灭活猪,一举解决临床异种移植的安全性问题。
4 CRISPR/Cas9系统存在的问题随着基因编辑技术的日趋成熟,畜牧行业的发展将会更多地应用到基因编辑技术尤其是最新一代的CRISPR/Cas9系统[57-61]。但同时,CRISPR/Cas9系统还存在一些问题正制约着其发展和应用,如CRISPR/Cas9系统对PAM序列有较高的依赖性、存在较为严重的脱靶效应、还容易导致过度的DNA损伤等一系列的技术安全性问题,这就给基因编辑技术在家畜应用上带来了一系列的争议。如何规范基因编辑动物的制备和生产,如何使大众对基因编辑动物放心、安心,已逐渐成为人们关注的重点。笔者认为若想有效解决这一问题则需要政府有关部门建立一套更加适合基因编辑动物的健全的安全监管体系,在保障基因编辑动物安全生产应用的同时也要确保基因编辑动物的安全审批效率,这不仅有利于规范市场还可以为基因编辑技术在我国的发展提供良好的环境,进而更加高效、便捷、安全地应用于家畜生产,促进我国畜牧行业更好更快的发展。
5 前景展望目前,我国已经先后启动了多项种质自主培育联合攻关重大专项,力求突破一批关键技术,培育出具有世界竞争力的家畜品种,降低我国对家畜核心种质的对外依存度,提高我国种业的国际竞争力。CRISPR/Cas9基因编辑技术的产生与应用是生命科学的又一次技术革命,对育种和疾病防控等研究产生了巨大和深远的影响。相信随着基因编辑技术效率的不断提高,CRISPR/Cas9技术将会在家畜育种新材料创制等方面发挥更重要的作用。
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