术后慢性疼痛是指由手术引起、继发于术后急性疼痛且持续时间超过3个月的慢性疼痛[1]。其病因复杂,机制未明,尚缺乏科学的干预手段和有效治疗方案,对动物机体康复不利,导致医疗资源浪费,还严重影响生活质量,产生不良后果[2]。为明析术后慢性疼痛的机制和致病因素,实现动物“疼痛最小化”,兽医工作者进行了大量研究。术后疼痛的实质是神经递质和受体等物质参与的多维神经调节的结果,涉及多种物质变化[3],但目前尚不明确究竟何种物质在其发生、传递和调制的过程中起决定作用。严重的术后急性疼痛是术后慢性疼痛的重要预测因素[4-5],因此,甄别引发术后急性到慢性疼痛转化这一复杂过程的关键物质,对术后慢性疼痛机制的深入研究和治疗靶点的选择尤为重要。
近年来,代谢组学技术的应用促进了疼痛相关物质研究的发展[6-8],因此,本试验拟用GC-MS代谢组学技术探讨大鼠术后急性疼痛和慢性坐骨神经紧缩损伤疼痛模型(CCI)的相关代谢变化,以期筛选出术后急性向慢性疼痛转化的关键物质及其相关代谢通路,为术后慢性疼痛的研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂Agilent GC-MS气质联用仪(7890B-5977A);Agilent DB-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);电子测痛仪;L-2-氯苯丙氨酸(上海恒创生物);HPLC级氯仿、甲醇和正己烷(CNW,德国);超纯水由Milli-Q超纯水仪制备,其余试剂均为市售分析纯。
1.2 方法1.2.1 实验动物分组及模型构建 SPF级SD大鼠65只,体重(250±10)g,南方医科大学实验动物中心提供,饲养于华南农业大学实验动物中心。大鼠随机分为空白对照组(n=5)、假手术组(n=30)和手术组(n=30)。参照Bennett等[9]的方法制作大鼠CCI模型,具体方法:大鼠经腹腔注射水合氯醛麻醉后剔除右侧大腿被毛,消毒备皮。平行股骨外侧作长约1 cm切口,拨开皮肤、筋膜和肌肉暴露坐骨神经主干。挑起坐骨神经主干并结扎,共4道,间距2 mm,结扎力度以小腿肌肉轻微颤动为宜,关闭切口;假手术组暴露坐骨神经但不结扎,其余操作同手术组;空白对照组不作任何处理。
1.2.2 机械缩足反射阈值测量 Von Frey电子测痛仪测定大鼠机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT),大鼠于测痛装置内适应环境30 min,将Von Frey刺激大鼠术侧足底,力度由小到大,直至出现躲避反射即为其MWT值,重复测定5次,结果取平均值。
1.2.3 样本采集与预处理 术前和术后第1、3、5、7、14、21天,大鼠经乙醚麻醉后,断头法处死,取下丘脑及胸椎T3~T5段脊髓经PBS冲洗后,液氮中保存。称取样品于离心管中,加入内标L-2-氯苯丙氨酸20 μL和600 μL甲醇水溶液,-80 ℃放置2 min,研磨;加入120 μL氯仿。冰水浴超声提取,4 ℃静置。离心10 min(12 000 r·min-1, 4 ℃),吸取400 μL上清液转入衍生瓶中,挥干样本。加入甲氧胺盐酸盐吡啶溶液80 μL进行肟化反应,随后加入80 μL BSTFA衍生试剂和20 μL的正己烷。70 ℃孵育60 min,室温冷却后用于GC-MS检测。每10个样品中插入1个由所有样本的提取液等体积混合制备的质控样品(QC)。
1.2.4 气相色谱-质谱检测及数据分析 GC-MS检测条件参考文献[10]的方法并结合本试验适当更改,质谱的离子源温度为230 ℃,质量扫描范围为50~500 m·z-1;气相色谱进样口温度为260 ℃, 升温程序见表 1。GC-MS的原始数据由Anal-ysisBaseFileConverter和MS-DIAL软件进行预处理,将手术组或假手术组在相同取样时间的样品数据归为同一组,即手术组(D1、D3、D5、D7、D14、D21组),假手术组(S1、S3、S5、S7、S14、S21组);将数据导入SIMCA-P软件中进行多元统计分析,找到组间差异代谢物,并将筛选出的差异代谢物以KEGG数据库为背景,经MBRole进行代谢通路富集分析。
大鼠机械缩足反射阈值结果见图 1,结果显示,大鼠MWT术前基础值比较无显著差异。模型建立后,手术组大鼠MWT较术前显著降低,随后逐渐恢复,直至术后第21天MWT值仍低于术前基础值,差异显著(P < 0.05),提示CCI模型建模成功。
质控样品的TIC叠加图及单个代表性样品TIC图见图 2,结果表明,采用的分析方法具有良好的重复性和稳定性,分析程序合理。
样本PCA模型得分图如图 3所示,QC样本紧密分布,表明试验具有较好的稳定性和重复性。为更直观观察组间差异,进一步建立每两分析组间共11组的PCA、PLS-DA、OPLS-DA模型。PCA得分图表明,组间分离趋势明显;PLS-DA模型解释能力参数R2Y(0.842~0.995),预测能力参数Q2 (0.584~0.937);OPLS-DA模型参数R2Y(0.842~ 0.991),Q2(0.474~0.805);在建立的OPLS-DA模型下进行200次响应排序检验考察模型的质量,各组模型预测能力参数Q2均在-0.925~-0.156;除D21/S21组的PLS-DA模型参数(R2X=0.491,R2Y=0.842,Q2=0.181)外,模型稳定性、预测能力均符合分析要求,模型未出现过拟合。以手术组D3和D5组两组样本的分析为例,见图 4。
经多元统计分析、T检验和变异倍数分析(VIP>1,P<0.05,∣log2FC∣≥2),从224种代谢物中筛选出35种代谢物作为候选差异代谢物,其中,24个显著下调,9个显著上调,见表 2。为表征候选差异代谢物间的聚落关系,对代谢物的定量信息进行层次聚类,见图 5;在候选差异代谢物中,N-乙酰天冬氨酸、泛酸、天冬氨酸、葡萄糖、β-丙氨酸、3-羟基丁酸与疼痛密切相关,可能是术后急性疼痛向慢性疼痛转化的潜在生物标志物,为表征代谢物在不同时间的变化趋势,对6种代谢物的平均表达量绘制箱线图,见图 6。
将差异代谢物映射到KEGG数据库中,通过MBRole通路分析功能进行通路富集分析,结果35种候选差异代谢物参与了45个代谢途径。代谢通路的P值表示该代谢通路富集的显著性,以10为底取对数绘制代谢通路富集图,P值越小,-lg(P-value)越大;图中红线和蓝线分别示意P值为0.01和0.05(图 7)。
本试验成功建立了大鼠术后急性疼痛和慢性坐骨神经紧缩损伤疼痛模型,并应用GC-MS代谢组学技术比较手术组与对照组、手术组D1、D3、D5、D7、D14、D21各组间的差异代谢物,鉴定出包括N-乙酰天冬氨酸(NAA)、泛酸、天冬氨酸、β-丙氨酸、3-羟基丁酸、葡萄糖等35种差异代谢物及45条潜在代谢通路可能参与了术后急性向慢性疼痛的转化。
N-乙酰天冬氨酸是衡量神经细胞破坏程度的标志物[11],浓度降低提示神经元丢失、结构破坏或功能异常[12-13]。应用核磁共振波谱技术(MRS),发现慢性疼痛患者经颅直流电刺激治疗后,疼痛程度减轻,且脑代谢物中NAA浓度较治疗前显著升高[14-15]。进一步研究发现NAA的浓度与疼痛的强度呈负相关[16],本试验中,NAA浓度在术后D1 vs D3组和D14 vs D21组中表达下调,与这些研究结果相同,其平均表达量与MWT值变化趋势一致,说明NAA在急性向慢性疼痛转化的过程中发挥了作用。
泛酸以辅酶A的生物活性形式挥发其功能,参与含碳架物质的能量代谢[17],其表达失调表明机体能量失衡。神经损伤后释放大量ATP,作用于P2X3受体参与伤害性信息的传递和痛觉敏化[18-19]。本试验中泛酸浓度下调,其代谢紊乱引起的能量失衡可能导致信号传导异常或细胞内外离子交换障碍,从而在术后急性疼痛向慢性疼痛转化过程发挥作用。辅酶A也是机体应激反应重要观测指标皮质醇的必需辅助因子[20],伤害性信号促使下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴兴奋增强,皮质醇等应激激素水平升高,引起术后应激反应,进而导致糖代谢紊乱[21]。葡萄糖是脑细胞能量代谢的最主要的直接来源,本试验中葡萄糖浓度下调,可能是手术伤害性刺激引起神经元的活性增强、代谢旺盛,从而参与疼痛的形成。
β-丙氨酸为不参与蛋白质合成的氨基酸,与主要的抑制性神经递质甘氨酸和γ-氨基丁酸结构相似,能够激活甘氨酸和γ-氨基丁酸受体,进而影响突触的可塑性[22-23]。伤害感受器可塑性变化在急性疼痛向慢性疼痛转化中具有重要作用[24]。试验结果发现β-丙氨酸代谢紊乱,说明其可能通过调控神经系统的可塑性变化从而参与了术后急性向慢性疼痛转变的过程。
天冬氨酸是重要的兴奋性氨基酸类神经递质,参与维持神经系统的结构与功能,浓度过高会介导神经元的死亡。本试验天冬氨酸浓度升高,提示手术引起的伤害性刺激传入脊髓背角使神经突触和胶质细胞释放大量的天冬氨酸[25],天冬氨酸等兴奋性氨基酸过度释放会导致NMDA受体上调,使突触的可塑性出现长时程易化,造成中枢敏化[26],从而参与了术后慢性疼痛的形成。
3-羟基丁酸具有多种生物活性,可以为神经胶质细胞提供能量,并通过抗氧化、线粒体保护和增加脑源性神经营养因子的表达等方式对神经起到保护作用[27],同时还可以抑制神经胶质细胞的凋亡。胡华辉等[28]发现3-羟基丁酸在急性脊髓损伤模型大鼠脊髓中浓度降低,与本试验中3-羟基丁酸在手术组D7 vs D14组中表达下调相似,说明其参与了疼痛形成过程中神经保护与修复的过程。3-羟基丁酸还可以作为表观遗传修饰调控因子发挥功能,预示其可能在疼痛的表观遗传调控中发挥功能[29-30]。
4 结论使用GC-MS代谢组学技术对大鼠术后急性疼痛和慢性坐骨神经紧缩损伤疼痛模型的下丘脑和脊髓代谢物进行初步研究,筛选出N-乙酰天冬氨酸、泛酸、天冬氨酸、β-丙氨酸、3-羟基丁酸、葡萄糖等35种物质可能与术后急性疼痛向慢性疼痛转变密切相关。但由于试验条件和试验设计的限制,这些差异代谢物在术后疼痛中的作用及其具体机制仍有待进一步深入研究。
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