2. 甘肃农业大学生命科学技术学院, 兰州 730070
2. College of Life Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China
脑红蛋白(neuroglobin, NGB)是德国科学家Burmester等[1]在2000年首次发现的存在于脊椎动物体内的一种新型携氧球蛋白。现有研究表明，脊椎动物神经系统对缺氧极其敏感[2]，而NGB具有可逆性结合氧及清除氧化应激产物的功能，在脑低氧适应性中发挥着重要作用，对其功能的深入探讨也为缺血缺氧性疾病(如新生儿缺血缺氧性脑病)的研究和治疗带来了新的思路和方法[3-6]。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)是一种可在缺氧条件下发挥转录活性的重要调节因子，在脑缺血缺氧的反应调节中起关键调控作用[7]。有研究表明，在缺血缺氧性脑损伤中，HIF-1α可以促进NGB生成[8]，也有试验发现，在神经元(HN33)中使用shRNA介导HIF-1α低表达或慢病毒载体介导HIF-1α过表达，均会影响NGB的表达水平[9]，但迄今为止，NGB和HIF-1α之间的确切关联机制仍未得到直接证实。牦牛(Bos grunniens)是分布于青藏高原及其毗邻的高山、亚高山地区的牛种之一，对高寒低氧环境具有极强的适应性[10]。后脑(hindbrain)作为哺乳动物脑组织分区的重要组成部分，具有调节呼吸和循环活动，控制机体运动、平衡及骨骼肌群共济调节等功能[11]，其主要区域包括延髓、脑桥和小脑(小脑又分为小脑半球皮质、小脑半球白质、蚓前叶、蚓后叶、蚓小叶)，其中，延髓和脑桥主要控制机体运动、呼吸及心血管活动等；小脑主要接受与运动相关的信息及所有感觉信息，由于小脑内部具有广泛的传入、传出联系，因此，小脑各区域又可与延髓、脑桥等区域进行协同调节，共同完成后脑执行的相关活动。在牦牛长期适应高寒低氧环境的生活中，后脑必然也发挥着极其重要的调节作用。
目前，国内外关于高原牦牛脑组织NGB与HIF-1α分布及表达的研究报道并不多见[12-14]，且研究结果相对单一，研究部位缺乏系统性。鉴于后脑在调节脊椎动物机体重要生理活动中的复杂性与重要性，本研究以高原牦牛后脑作为研究部位，采用RT-qPCR、Western blot、苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining, HE)及免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)技术对NGB和HIF-1α在后脑不同区域的分布与表达特征进行系统研究，探索NGB和HIF-1α在牦牛后脑不同区域的分布规律、表达水平及其与低氧环境之间的关联，研究结果可为进一步探讨牦牛脑组织低氧适应性机制提供有价值的理论参考。
1 材料与方法 1.1 试验动物及取样自甘肃省甘南藏族自治州合作市牛羊定点屠宰场采集2~5岁龄健康成年牦牛共计5头份，公母不限。迅速开颅获取完整脑组织，按图 1所示，采集后脑各部位的组织样本，包括延髓、脑桥、小脑半球皮质、小脑半球白质、蚓前叶、蚓后叶及蚓小叶。分别置液氮和4%多聚甲醛中保存备用。
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A. 背侧观；B. 腹侧观；C. 中央矢状面观 A. Dorsal view; B. Ventral view; C. Central sagittal view 图 1 牦牛后脑大体解剖学位置 Fig. 1 The gross anatomy of the hindbrain in yak |
RT-qPCR试剂及耗材：AG RNAex Pro RNA提取试剂、SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒、Evo M-MLV反转录试剂盒(含去除gDNA试剂)、Rox染料均购自北京瑞真生物技术有限公司。
Western blot试剂及耗材：兔抗NGB多克隆抗体(bs-1859R)、兔抗HIF-1α多克隆抗体(bs-0737R)、兔抗β-actin多克隆抗体(bs-0737R)、羊抗兔IgG/HRP(bs-0295G-HRP)均购自北京博奥森生物技术有限公司，RIPA组织/细胞快速裂解液购自Biotopped，0.22 μm聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜、4×蛋白上样buffer(含DTT)、彩虹245广谱蛋白Marker(11-245KD)、ECL超敏发光液均购自索莱宝生物科技有限公司(北京)，其他试剂均为国产分析纯。
免疫组织化学试剂及耗材：SP试剂盒(包括试剂1：内源性过氧化物酶阻断剂；试剂2：封闭用正常山羊血清工作液；试剂3：生物素标记山羊抗兔IgG；试剂4：辣根酶标记链霉卵白素工作液)购自北京中山金桥生物技术有限公司，增强型HRP-DAB底物显色试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。
1.3 牦牛后脑不同区域NGB和HIF-1α mRNA RT-qPCR检测严格按照Trizol法步骤及Evo M-MLV反转录试剂盒说明书进行样品总RNA提取及cDNA反转录。
根据NCBI已收录的牦牛NGB、HIF-1α、内参基因(β-actin)序列，利用Primer premier 5.0设计引物，并送生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息列于表 1。使用QuantStudio5仪器进行RT-qPCR试验。反应体系(20 μL)：SYBR Green Pro Taq 10 μL、上、下游引物(浓度为0.2 μmol·mL－1)各0.8 μL、Rox染料0.4 μL、模板cDNA 2 μL、ddH2O 6 μL。反应参数：50 ℃ 2 min预热；95 ℃ 2 min预变性；95 ℃ 10 s变性，60 ℃ 34 s退火，40个循环。每组设计3个试验重复，利用Excel 2010整理试验数据，根据每个样品的循环阈值(cycle threshold, Ct)，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对转录量。
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表 1 RT-qPCR引物信息 Table 1 Information of primers used in RT-qPCR |
取牦牛后脑不同区域组织样品各0.25 g，分别加入等量RIPA组织/细胞快速裂解液(1 mL RIPA+ 10 μL苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)，摇床冰浴2 h (120 r·min－1)，于4 ℃ 12 000 r·min－1离心10 min，取30 μL，加入10 μL 4×蛋白上样buffer(含DTT)，100 ℃煮沸10 min，冷却至室温，保存于－20 ℃，备用。
蛋白样品经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE)电泳后，根据条带大小切胶，并在1×电转液的作用下，转印至PVDF膜上。用5 g·L－1脱脂奶粉4 ℃过夜封闭；分别加入一抗(NGB：1∶800、HIF-1α：1∶500、β-actin：1∶2 000稀释)，室温摇床孵育3 h，PBST洗10 min×3次；加入二抗(1∶4 000稀释)，室温摇床孵育1 h，PBST洗10 min×3次，ECL底物显色试剂各1 mL覆盖PVDF膜，暗室中曝光，X光片显影、定影。每组蛋白重复3次，Image J分析扫描蛋白条带，测定灰度值分析蛋白表达情况(蛋白表达量＝目的灰度数值/内参灰度数值)。
1.5 牦牛后脑不同区域NGB和HIF-1α蛋白免疫组织化学染色对牦牛后脑不同区域组织样本进行固定(4%多聚甲醛)，修块(2 cm × 2 cm)，常规梯度酒精脱水，石蜡包埋制成组织蜡块，经连续切片(厚度4 μm)、展片、贴片、烤片处理，HE常规染色、镜检。
采用免疫组织化学SP(strepta-vidin-perosidase)法进行染色。石蜡切片常规脱蜡，梯度酒精分化；高压修复抗原后，滴加试剂1，37 ℃孵育15 min，PBS洗10 min×3次；随后滴加试剂2，37 ℃孵育15 min，倾去勿洗；每张切片分别滴加50 μL一抗(NGB 1∶400、HIF-1α 1∶400稀释)，37 ℃孵育4 h，PBS洗10 min×3次(阳性、阴性分开洗)；滴加试剂3，37 ℃孵育15 min，PBS洗10 min×3次；滴加试剂4，37 ℃孵育15 min，PBS洗10 min×3次，最后滴加新鲜配制HRP-DAB显色液，常规脱水透明、封片、镜检。阴性对照以PBS替代一抗染色。
1.6 数据统计分析利用SPSS 19.0软件对NGB和HIF-1α基因与蛋白进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，按后脑不同采样区域设组(每组个体数量均为5头)，每个体试验数据设置3个重复，P < 0.05表示差异显著，所有数据均采用“x±sx ”表示。用Graphpadprism 5.0绘图。
2 结果 2.1 NGB基因与蛋白在牦牛后脑不同区域的表达以β-actin基因作为内参，对牦牛后脑不同区域NGB进行RT-qPCR检测，结果显示(图 2)，NGB mRNA在牦牛后脑各区域均有表达。其中，蚓前叶表达量最高，显著高于其他区域(P < 0.05)，其后依次为小脑半球皮质、蚓后叶、脑桥、小脑半球白质、延髓和蚓小叶。小脑半球白质、延髓、蚓小叶间差异不显著，其余区域彼此间差异显著(P < 0.05)，蚓小叶表达量最低。
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内参基因为β-actin；不同小写字母代表差异显著(P < 0.05)。下同 Reference gene is β-actin. Different lowercase letters represent significant differences (P < 0.05). The same as below 图 2 牦牛后脑不同区域NGB RT-qPCR检测 Fig. 2 The RT-qPCR results of NGB in different regions of yak's hindbrain |
以β-actin蛋白作为内参，对牦牛后脑不同区域NGB进行Western blot检测，结果显示(图 3)，NGB蛋白在牦牛后脑不同区域均有表达，蚓前叶表达量为最高，显著高于其他区域(P < 0.05)，其他依次为小脑半球皮质、蚓后叶、脑桥、延髓、小脑半球白质和蚓小叶。延髓与脑桥之间、小脑半球白质与蚓小叶之间差异不显著，其余区域彼此间差异显著(P < 0.05)，蚓小叶表达量最低。
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A. NGB蛋白检测结果；B. NGB蛋白相对表达量 A. Detection results of NGB protein; B. Relative expression of NGB protein 图 3 牦牛后脑不同区域NGB蛋白Western blot检测 Fig. 3 The Western blot results of NGB in different regions of yak's hindbrain |
以β-actin基因作为内参，对牦牛后脑不同区域HIF-1α进行RT-qPCR检测，结果显示(图 4)：HIF-1α mRNA在牦牛后脑不同区域均有表达，其中，在蚓前叶表达量为最高，显著高于其他区域(P < 0.05)，其后依次为小脑半球皮质、蚓后叶、小脑半球白质、蚓小叶、脑桥、延髓。小脑半球白质与蚓小叶、延髓与脑桥之间差异不显著，其余区域彼此间差异显著(P < 0.05)，延髓表达量最低。
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内参基因为β-actin Reference gene is β-actin 图 4 牦牛后脑不同区域HIF-1α RT-qPCR检测 Fig. 4 The RT-qPCR results of HIF-1α in different regions of yak's hindbrain |
以β-actin蛋白作为内参，对牦牛后脑不同区域HIF-1α进行Western blot检测，结果显示(图 5)：HIF-1α蛋白在牦牛后脑不同区域均有表达，其中，在蚓前叶表达量为最高，显著高于其他区域(P < 0.05)，其他依次为小脑半球皮质、蚓后叶、小脑半球白质、脑桥、延髓和蚓小叶，小脑半球皮质与蚓后叶、脑桥与小脑半球白质之间差异不显著，其余区域彼此间差异显著(P < 0.05)，蚓小叶表达量最低。
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A. HIF-1α蛋白检测结果；B. HIF-1α蛋白相对表达量 A. Detection results of HIF-1α protein; B. Relative expression of HIF-1α protein 图 5 牦牛后脑不同区域HIF-1α蛋白Western blot检测 Fig. 5 The Western blot results of HIF-1α in different regions of yak's hindbrain |
牦牛后脑延髓区域主要由神经核团、神经胶质细胞以及神经纤维的髓鞘和轴突构成；脑桥内部也含有大量运动神经核团及神经胶质细胞，构成与延髓类似(图 6 A1~A2)。免疫组织化学结果显示，NGB和HIF-1α蛋白主要分布于延髓和脑桥神经元胞质中，神经胶质细胞、髓鞘及轴突无明显阳性反应着色，HIF-1α蛋白免疫阳性反应强度整体高于NGB蛋白(图 6 B1、B2、C1、C2)。
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A. HE染色结果；B. NGB蛋白免疫组织化学结果；C. HIF-1α蛋白免疫组织化学结果；D. 阴性对照；标尺均为50 μm。1~7. 延髓、脑桥、小脑半球皮质、小脑半球白质、蚓前叶、蚓后叶、蚓小叶。NCB. 神经元细胞；NgC. 胶质细胞；MN. 运动神经元；MS. 髓鞘；Ax. 轴突；BV. 血管；ML. 分子层；PCL. 浦肯野细胞层；GL. 颗粒层；M. 髓质；PjC. 浦肯野细胞；Bac. 篮状细胞；Go. 高尔基细胞；fa. 纤维状星形胶质细胞；Dn. 齿状核；Gc. 颗粒细胞 A. HE staining results; B. Immunohistochemical results of NGB protein; C. Immunohistochemical results of HIF-1α protein; D. Negative control. The scale is 50 μm. 1-7. Medulla oblongata, pons, cerebellar cortex, corpus medullane, archicerebellum, neocerebellum, palaeocerebellum. NCB. Nerve cell; NgC. Nerve glial cell; MN. Motor neuron; MS. Myelin sheath; Ax. Axon; BV. Blood vessel; ML. Molecular layer; PCL. Purkinje cell layer; GL. Granular layer, M. Medulla; PjC. Purkinje cell; Bac. Basket cell; Go. Golgi cell; fa. Fibrous astrocyte; Dn. Dentate nucleus; Gc. Granule cell 图 6 牦牛后脑不同区域HE及免疫组织化学结果 Fig. 6 The HE and immunohistochemical results in different regions of yak's hindbrain |
牦牛小脑半球皮质由外向内可分为明显的三层结构，依次为分子层、浦肯野细胞层和颗粒层(图 6 A3)。其中，分子层主要包括无髓神经元纤维及少量神经元，如篮状细胞；浦肯野细胞胞体呈梨形，排列整齐有序；颗粒层则由密集排列的颗粒细胞构成。免疫组织化学结果显示，牦牛小脑半球皮质分子层可见有散乱分布的NGB和HIF-1α阳性反应着色，篮状细胞内也存在少量阳性表达；浦肯野细胞的树突细胞胞质有较强的NGB和HIF-1α阳性表达；颗粒细胞胞质中亦有较强的NGB和HIF-1α阳性表达，NGB和HIF-1α蛋白免疫阳性着色定位主要在神经元胞质，HIF-1α蛋白免疫阳性反应强度整体高于NGB蛋白(图 6 B3、C3)。小脑半球髓质区主要由无髓神经纤维构成，其中散在分布有少量神经核团(齿状核等)及神经胶质细胞(图 6 A4)。免疫组织化学结果显示，牦牛小脑半球髓质区神经元胞质中可见NGB和HIF-1α阳性表达，神经胶质细胞中也有少量表达(图 6 B4、C4)。
HE结果显示，牦牛小脑蚓前叶、蚓后叶、蚓小叶皮质区均有分层现象，结构与小脑半球皮质类似(图 6 A5~A7)。其中，蚓前叶分子层、颗粒层较薄，分子层交织形成一条带状区域，其内散在分布有大量浦肯野细胞、颗粒细胞以及少量篮状细胞；蚓后叶分子层呈垂直走向，浦肯野细胞胞体较大，树突较短，颗粒层较厚，髓质呈水平走向，含少量神经胶质细胞；蚓小叶分子层厚而均匀，呈水平走向，浦肯野细胞成排分布，间距不等，靠近浦肯野细胞层分布有篮状细胞，颗粒层含有大量颗粒细胞，髓质呈垂直走向，含少量神经胶质细胞。免疫组织化学结果显示，小脑蚓部各叶浦肯野细胞、篮状细胞、颗粒细胞胞质均有NGB和HIF-1α阳性表达，其中，浦肯野细胞阳性反应着色最强；髓质神经胶质细胞中亦可见少量NGB和HIF-1α阳性表达(图 6 B5~B7、C5~C7)。NGB和HIF-1α蛋白免疫阳性着色均定位于神经元胞质中，HIF-1α蛋白免疫阳性反应强度整体高于NGB蛋白。
3 讨论脑红蛋白(NGB)是在脊椎动物神经系统中首次发现的一类特殊携氧球蛋白，在清除活性氧(reactive oxygen species, ROS)，维持脑组织氧化还原稳态，保护脑组织免受缺氧性损伤中发挥着重要作用[15]。本研究首次将牦牛后脑部位单独作为研究对象进行NGB表达的检测，结果显示，NGB基因和蛋白在牦牛后脑不同区域均有表达，且表达趋势总体一致，与Haines等[9]研究结果类似。其中，小脑蚓前叶NGB基因和蛋白的表达量均为最高，且显著高于延髓、脑桥及小脑其他区域(P < 0.05)，表明NGB主要集中分布在蚓前叶，这一方面说明在适应高寒低氧过程中蚓前叶需要大量NGB协助维持其氧化还原稳态，是后脑中代谢最旺盛的区域，同时，由于蚓前叶含有大量来自大脑皮质感觉运动区的传入神经[11]，NGB基因和蛋白的高表达，提示其可能在牦牛机体运动过程中也发挥着重要的稳态调节作用；另一方面，蚓前叶可以接受来自大脑皮质的信息并进行处理[11]，NGB在大脑皮质和小脑中的表达量较脑部其他区域要高[16]，推测二者在功能衔接过程中，蚓前叶区域可能发挥着至关重要的作用。此外，小脑半球皮质NGB基因和蛋白的表达量仅次于蚓前叶，也显著高于其他区域(P < 0.05)，这与李同方等[16]研究结果相一致，小脑半球皮质通常可通过红核、齿状核等核团与大脑皮质形成双向性联系，在调节肌肉张力、肌肉运动等方面发挥重要功能[11]，推测此处NGB基因与蛋白的高表达同样也是为了保障其正常功能行使过程中有充足的氧气供应。蚓小叶是后脑NGB表达最低的区域，说明蚓小叶可能是牦牛后脑耗氧量较低，耐受性较弱的部位。由于NGB除具有携氧能力外，也具有清除氧化自由基等作用[4]，牦牛后脑各区域中NGB表达的差异性可能是其在长期适应低氧环境过程中，根据其特定功能发挥的不同而导致基因选择性表达的结果。
缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是目前发现的唯一能在特异性缺氧状态下发挥转录活性的转录因子，其表达变化直接与下游分子激活相关[17]。本试验结果显示，HIF-1α基因和蛋白在牦牛后脑不同区域均有表达，基因与蛋白表达趋势总体一致，说明HIF-1α在牦牛后脑中表达和执行相关功能时对下游分子的转录调控均处在一恒定水平，且对低氧环境的适应具有一定的稳定性。此外，HIF-1α基因和蛋白在蚓前叶表达量最高，显著高于延髓、脑桥及小脑其他部位(P < 0.05)，这与NGB在后脑的表达规律一致。在缺氧应激状态下，HIF-1α可作为上游的重要分子开关，激活下游血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、促红细胞生成素(erythropoietin, EPO) 等目的基因的转录，促进血管和红细胞生成，提高携氧能力，进而使缺氧的组织细胞保持氧稳态并耐受低氧环境[18-19]。脑区NGB的表达在低氧应激性适应过程中发挥着重要功能，蚓前叶中HIF-1α的高表达，提示其在适应缺氧应激过程中，HIF-1α和NGB可能存在某种直接或间接的调控联系，共同对蚓前叶起保护作用。同时，HIF-1α在蚓前叶的高表达也进一步证实在适应高寒低氧过程中，蚓前叶是小脑中功能性最强的组织区域，这可能也与其不同于其他区域的神经元构成有关。小脑半球皮质HIF-1α的表达结果与NGB的表达规律相近，进一步说明此类功能联系广泛、代谢旺盛的区域，在适应低氧环境过程中需要大量的神经保护因子来协助其完成正常的生理活动。另外，区别于NGB蛋白，HIF-1α在蚓后叶、小脑半球白质、脑桥、延髓等区域的表达量非常接近，也提示在牦牛长期适应低氧环境的过程中，已将此类缺氧应激性神经保护因子维持在一个相对稳定的表达水平。
利用HE染色、IHC法对牦牛后脑不同区域NGB和HIF-1α蛋白分布特征的研究结果表明，二者的分布规律总体一致，这与Giulio等[20]对人神经元中NGB和HIF-1α蛋白分布特征的研究结果相似。延髓、脑桥中NGB和HIF-1α蛋白主要分布在神经元胞质，也与李同方等[16]、曹亮[21]和拜占春等[22]对牦牛神经元中NGB或HIF-1α蛋白分布特征的研究结果相一致。结合延髓与脑桥对机体呼吸、运动、感觉等生理功能的调节作用[11]，说明NGB和HIF-1α在这些区域神经元的功能发挥中担负着重要作用，且对缺氧具有较高的耐受性。在小脑不同区域的皮质层中，分子层越靠近浦肯野细胞层的部分，NGB和HIF-1α表达量越高，说明分子层在功能上与浦肯野细胞层存在关联，此外，NGB和HIF-1α均主要集中表达于浦肯野细胞胞质，提示浦肯野细胞作为小脑神经网络中唯一的传出神经元对缺氧耐受性最高。在小脑不同区域的髓质中，神经核团有不同程度的NGB和HIF-1α蛋白阳性表达，而轴突未见明显阳性反应着色。小脑髓质深层分布有神经核团，细胞之间通过轴突和胞质将整个小脑的神经组成网络，轴突不具有合成蛋白质的功能，因此，需要将所需蛋白通过胞质合成后利用“轴浆运输”运送到轴突及其终末[23]，结合本研究结果，提示小脑髓质区NGB和HIF-1α蛋白可能存在“轴浆运输”现象，其相关机制还有待进一步探讨。此外，髓质区神经胶质细胞均有少量NGB和HIF-1α表达，与Dellavalle等[24]和Avivi等[25]的研究结果类似，考虑NGB和HIF-1α在此类神经胶质细胞中的表达可能也与该细胞适应低氧环境有关。
4 结论NGB和HIF-1α基因与蛋白在牦牛后脑不同区域均有表达，且表达量存在明显差异，其中，小脑蚓前叶的表达量最高，蚓小叶的表达量最低。两种蛋白主要集中分布在后脑神经元胞质中，髓质区也见有少量表达。NGB和HIF-1α蛋白在牦牛后脑不同区域适应低氧环境过程中均发挥着重要作用，不同部位的表达差异，推测是在其行使特定功能过程中NGB和HIF-1α差异性选择表达的结果，小脑蚓前叶和蚓小叶可能分别是牦牛后脑中对缺氧耐受度最高和最低的两个区域。
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