奶牛乳腺炎是指在不同理化因素刺激下奶牛乳腺的炎性反应，常由病原微生物的入侵引发[1]。作为奶牛4大疾病之一，奶牛乳腺炎严重影响了奶牛的健康和牛乳的产量及质量，因而制约了奶牛养殖业的发展[2]。目前，奶牛乳腺炎主要依赖抗生素治疗。但抗生素的滥用，引发的病原菌耐药性和牛奶中抗生素的残留问题日趋严重[3]。因此，阐明奶牛乳腺炎的病理本质，寻找有效的治疗手段非常必要。乳腺上皮细胞是乳房中乳汁的合成场所，更是血乳屏障的主要构成者[4]。在乳腺炎的发生过程中，乳腺上皮细胞通过诱发炎症而保护周围组织[5]，但过度的炎症反应则往往会损伤乳腺[6-7]。炎症反应通常由炎症因子调节，乳腺中已检测出多种炎症因子[8-9]，但乳腺炎中炎症因子的功能尚不清楚。
异体移植炎症因子1 (allograft inflammatory factor-1，AIF-1)是一种主要由单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞产生的17 ku的炎性细胞因子[10-11]。首次从猪小肠中纯化[12]，并在大鼠心移植排斥物中鉴定[13]。在人类，AIF-1基因定位于主要组织相容性复合物Ⅲ区域，临近肿瘤坏死因子α(TNF-α)、肿瘤坏死因子β(TNF-β)和核因子κB(NF-κB)，提示其与免疫相关[14]。炎症过程尤其是细菌感染，诱发了AIF-1的表达[15]。在患胰岛炎的小鼠血液中，AIF-1的含量升高，而其抗体则阻止了胰岛炎的发生[16]。多项研究发现，AIF-1通过影响免疫细胞增殖、迁移[17-18]，细胞因子的产生[19]在炎症发生中扮演核心角色[20]。另一方面，AIF-1在进化上高度保守，提示其功能的相似性[21]。考虑到AIF-1的免疫调节属性，本研究探索了其对牛乳腺上皮细胞产生免疫介质的影响。
1 材料与方法 1.1 主要材料试剂：Trizol、SYBRⓇ Premix Ex TaqTM (2×)、pMD-19T载体购自TaKaRa公司，Taq DNA聚合酶、Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit、PierceTM BCA蛋白分析试剂盒均购自Thermo公司，感受态细胞DH5α购自天根生化科技有限公司，胶回收试剂盒购自Axygen公司；牛血清白蛋白购自Sigma公司；高糖培养基DMEM购自Hyclone公司；胎牛血清、0.25% Trysin购自美国Gibco公司；磷酸化IκBα抗体购自Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗体、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和单核细胞趋化蛋白1 ELISA试剂盒购自Bioswamp公司；牛异体移植炎症因子1分析试剂盒购自成都鹏世达实验用品有限公司。核因子κB的抑制剂BAY 11-7085购自MedChemExpress公司。
仪器：全自动化学发光分析仪购自上海天能公司；酶标仪购自芬兰雷勃公司；超净工作台购自苏州智净净化设备有限公司。
1.2 方法1.2.1 牛AIF-1基因的克隆与序列分析 牛脾样品采集于成都市青白江屠宰场。按照Trizol试剂盒说明书提取脾组织总RNA，紫外分光光度计测得总RNA的OD值为1.8~2.0。然后，按照反转录试剂盒说明书以Oligo (dT) 为引物合成cDNA。利用Primer Premier 5.0软件，根据牛AIF-1 cDNA序列信息(GenBank登录号NM_173985)，以5′-AGCCATGAGCGAACTAGG-3′和反义5′-TCAGGGCAACTCAGAGATAG-3′为引物, 通过RT-PCR扩增牛AIF-1的开放阅读框。PCR扩增程序：94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s，57 ℃ 45 s和72 ℃ 45 s，共32个循环; 72 ℃ 10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物, 胶回收后, 将目标片段克隆到pMD19-T质粒中, 并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中, 进行DNA测序。
以ExPASy-Tools(http://www.expasy.org/tools)预测牛AIF-1氨基酸序列、等电点和分子量。使用SignalP4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信号肽，TMpred (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)预测跨膜区定位。用InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/)鉴定结构域的结构模型, 用STRING (http://www.string-db.org/) 推导其相互作用蛋白。
1.2.2 牛AIF-1蛋白纯化 利用NdeⅠ和Xho Ⅰ限制性核酸内切酶, 将牛AIF-1基因的开放读码框亚克隆至pET32a中。对重组质粒pET32a-AIF1进行DNA测序, 并转化大肠杆菌感受态细胞BL21 (DE3)。过夜培养后, 当吸光度达到0.6时, 用0.8 mmol·L-1异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组牛AIF-1的表达，并用HisTrapTM HP亲和层析柱纯化重组牛AIF-1蛋白。
1.2.3 牛乳中AIF-1含量测定 从成都一牧场采集56头健康奶牛的牛乳、75头患乳腺炎奶牛的牛乳和23头患乳腺炎后康复的奶牛牛乳。离心去除牛乳中脂质。根据说明书，利用牛AIF-1检测试剂盒测定牛乳中AIF-1的含量，在450 nm处检测光吸收值。
1.2.4 牛乳腺上皮细胞的培养和处理 牛乳腺上皮细胞由南京农业大学苗晋锋教授惠赠。培养在添加10%胎牛血清的含双抗DMEM高糖培养基中，并放置在37 ℃、5% CO2培养条件下孵育。每3 d传1代，至第3代开始试验。将1×105·mL-1 MAC-T细胞接种至96孔细胞培养板中，随机分为4组，每组3个重复。待细胞汇合度达到70%，分别加入浓度为0.0、0.1、1.0、10.0 nmol·L-1牛AIF-1处理48 h。
1.2.5 肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和单核细胞趋化蛋白1含量测定 AIF-1处理牛乳腺上皮细胞48 h后，轻轻吸取细胞上清，6 000 r·min-1离心，去除细胞杂质。分别利用肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和单核细胞趋化蛋白1ELISA检测试剂盒测定细胞外液中这3种细胞因子的含量，同样在450 nm处检测光吸收值。
1.2.6 Western blot检测牛乳腺上皮细胞IκBα的磷酸化水平 用含1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟的细胞裂解缓冲液(50 mmol·L-1 Tris-HCl，pH7.5，10% 甘油，2% 巯基乙醇)制备细胞总蛋白。使用PierceTM BCA蛋白分析试剂盒测定蛋白质浓度。SDS-PAGE分离蛋白，并转移到硝酸纤维素膜上。再将硝酸纤维素膜在室温下用含有5%牛血清白蛋白的TBST (20 mmol·L-1 Tris-HCl，pH 7.6，0.14 mol·L-1 NaCl，0.1% Tween 20) 封闭1 h。然后，将膜与IκBα的磷酸化抗体(1∶1 000)在4 ℃孵育过夜，并用TBST彻底清洗，然后用辣根过氧化物酶偶联二抗。用化学发光法检测免疫复合物，以GAPDH为检测内参。
1.2.7 统计分析 用SPSS Statistics V17.0软件对数据进行统计分析，并表示为x±sx。用单因素方差分析确定牛AIF-1干预组与对照组在所有试验中差异的显著性。P < 0.05表示具有统计学意义。
2 结果 2.1 牛AIF-1基因的克隆与鉴定利用RT-PCR技术克隆牛AIF-1基因，测序后发现其脱氧核苷酸序列与GenBank登录的NM_173985序列一致。
该基因编码1个147个氨基酸的多肽，含有1个QXXER基序和1个Ca2+结合的EF-Hand，分别位于19—23位氨基酸和58—69位氨基酸，与人AIF-1蛋白具有91.2%的相似性，如图 1所示。预测其牛AIF-1蛋白分子量为16.86 ku，等电点为6.04。经SignalP4.0分析，该蛋白不是跨膜蛋白，未发现信号肽。InterProScan提示牛AIF-1是1种钙离子结合蛋白，并可与肌动蛋白相互作用。但STRING没有发现牛AIF-1的配体。
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—.EF-hand位置; --.OXXER基序 —.EF-hand site; --.OXXER motif 图 1 牛异体移植炎症因子1开放读码框和氨基酸序列 Fig. 1 Open reading frame and deduced amino acid sequence of bovine AIF-1 |
为了进一步检测牛AIF-1与乳腺炎的相关性，本研究纯化了牛重组AIF-1蛋白。首先利用0.8 mmol·L-1异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组牛AIF-1的表达，接着使用镍离子亲和层析，并用100 mmol·L-1咪唑洗脱融合蛋白。将洗脱组分进行SDS-PAGE分离(图 2)。
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M. 蛋白质相对分子质量标准；1. 上样前细胞总蛋白；2. 上样后0 mmol·L-1咪唑洗脱组分；3.20 mmol·L-1咪唑洗脱组分；4~8.100 mmol·L-1咪唑洗脱组分；9~10.500 mmol·L-1洗脱组分 M. Protein standard; 1. Total proteins before affinity chromatography; 2. The fraction eluted by 0 mmol·L-1 imidazole; 3. The fraction eluted by 20 mmol·L-1 imidazole; 4 to 8. The fraction eluted by 100 mmol·L-1 imidazole; 9 and 10. The fraction eluted by 500 mmol·L-1 imidazole 图 2 牛异体移植炎症因子蛋白纯化SDS-PAGE图谱 Fig. 2 Preparation of bovine AIF-1 protein |
夹心ELISA检测显示，患乳腺炎奶牛牛乳中AIF-1的平均含量为(426.2±9.4)μg·L-1，显著高于健康奶牛的(173.1±6.8) μg·L-1 (P < 0.001)，而抗生素治愈的奶牛牛乳中AIF-1的平均含量为(207.7±4.3)μg·L-1，与治疗前有显著差异(P < 0.001，图 3)。这些结果提示，牛AIF-1是1种分泌型蛋白，可能与乳腺炎相关。
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***. P < 0.001 图 3 牛奶样品中异体移植炎症因子1的含量 Fig. 3 The concentrations of AIF-1 in milks |
本试验利用ELISA法检测牛AIF-1对肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和单核细胞趋化蛋白1分泌的影响。如图 4所示，牛AIF-1以浓度梯度依赖的模式促进了肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和单核细胞趋化蛋白1的分泌。这些细胞因子的上调可能募集免疫细胞到达乳腺，引发乳腺炎症反应。
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A. 肿瘤坏死因子α；B. 白细胞介素6；C. 单核细胞趋化蛋白1；***. P < 0.001 A. TNF-α; B. IL-6; C. Monocyte chemoattractant protein 1; ***. P < 0.001 图 4 细胞外液中牛乳腺上皮细胞肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和单核细胞趋化蛋白1的含量 Fig. 4 Inflammatory cytokines secretion from bovine mammary epithelial cells induced by AIF-1 |
为了进一步了解牛AIF-1诱发乳腺上皮细胞炎症因子释放的机制。本试验采用Western blot检测了IκBα的磷酸化。结果见图 5，牛AIF-1提高了IκBα的磷酸化水平，提示这些细胞因子的上调可能与核因子κB的激活相关。
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***. P < 0.001 图 5 利用Western blot检测牛乳腺上皮细胞IκBα的磷酸化水平 Fig. 5 Phosphorylation of IκBα (Ser 32) was analyzed by Western blot |
为了探明AIF-1诱导的炎性细胞因子分泌与核因子κB激活的关系。本试验选用2.5 mg·L-1 BAY11-7085抑制核因子κB的激活。结果(图 6)显示，BAY11-7085抑制了10.0 nmol·L-1的AIF-1所造成的肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和单核细胞趋化蛋白1的分泌增加。这些结果说明AIF-1刺激的炎性细胞因子分泌是通过核因子κB引发的。
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A. 肿瘤坏死因子α；B. 白细胞介素6；C. 单核细胞趋化蛋白1；***. P < 0.001 A. TNF-α; B. IL-6; C. Monocyte chemoattractant protein 1; ***. P < 0.001 图 6 BAY11-7085对异体移植炎症因子1刺激的细胞因子分泌的影响 Fig. 6 The effect of BAY11-7085 on inflammatory cytokines secretion from bovine mammary epithelial cells induced by AIF-1 |
奶牛乳腺炎是奶牛乳房的炎症反应, 许多细胞因子都作为炎症介质参与了免疫反应的调节[22]。但与奶牛乳腺炎相关的关键细胞因子尚未鉴定。AIF-1已被证实在免疫调节中发挥核心作用，并在多种炎症相关疾病如异体移植排斥[23]、自身免疫疾病[24]、炎症性血管病变[25]和癌症[26]中大量表达。在本研究中，奶牛患乳腺炎后，牛乳中AIF-1的浓度也大幅增加。而奶牛痊愈后，牛奶中AIF-1的浓度也回落到正常水平，提示AIF-1可能与奶牛乳腺炎相关。
为了进一步探讨AIF-1与奶牛乳腺炎的关系，本研究克隆了牛AIF-1基因。结果显示，牛AIF-1氨基酸序列与人AIF-1相似性极高(91.2%)，提示了其也可能具有免疫调节的功能。利用基因亚克隆和亲和层析技术，本研究纯化了牛AIF-1蛋白，为其功能研究奠定了基础。
由于乳腺上皮细胞在乳腺的健康和疾病的防御中扮演重要角色。而在乳腺炎的发生过程中，乳腺上皮细胞将分泌炎性细胞因子和趋化因子[27]，进而激活免疫细胞并募集免疫细胞到达乳房[28]，加速乳腺炎的发生[29]。因此，本研究检测了牛AIF-1对乳腺上皮细胞肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和单核细胞趋化蛋白1分泌的影响。结果也证实牛AIF-1促进了这3种细胞因子的分泌。Watano等[19]报道了小鼠AIF-1上调巨噬细胞白细胞介素6和单核细胞趋化蛋白1的产生，这与本研究结果相一致。
炎症因子的激活通常与核因子κB通路密切相关[30]。小鼠AIF-1激活了腹膜间皮细胞的核因子κB通路[31]。在本研究中，牛AIF-1也刺激了核因子κB的磷酸化，进而激活了核因子κB。另一方面，抑制核因子κB信号，阻断了AIF-1诱导的炎性细胞因子释放。
由此推断，牛AIF-1是通过核因子κB信号激活炎症因子TNF-α、IL-6和单核细胞趋化蛋白1的分泌。
4 结论奶牛患乳腺炎后，牛乳中异体移植炎症因子1的水平显著升高，而奶牛痊愈后，其牛乳中异体移植炎症因子1的浓度回落到正常水平，提示异体移植炎症因子1与乳腺炎可能相关。重组牛异体移植炎症因子1通过核因子κB信号激活了炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和单核细胞趋化蛋白1的分泌，这些结果提示牛异体移植炎症因子1可能具有与乳腺炎相关的免疫属性。
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