2. 新疆维吾尔自治区动物卫生监督所, 乌鲁木齐 830011;
3. 陆军军医大学第一附属医院全军临床病理学研究所, 重庆 400000
2. Animal Health Supervision Institute of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830011, China;
3. Institute of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Army Medical University, Chongqing 400000, China
牛结节性皮肤病(lumpy skin disease，LSD)是由牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus，LSDV)所导致的传染病，其临床表现为病牛发热、淋巴结肿大、局部形成结节或溃疡，奶牛和小牛易感[1]；该病的发病率在2%~45%，致死率高达20%[2]。LSD可导致流产，公牛和母牛不育，体重下降以及牛奶产量急剧下降，皮张利用价值低，从而造成严重的经济损失[1]。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的疫病[3]。
LSD最早暴发于非洲，自2012年以来，该病已在中东、巴尔干地区、高加索南部和俄罗斯联邦的部分地区迅速传播[4]，2015年，从土耳其传播到希腊东北部。并于2016年春季再次暴发，这次疫情波及到东南欧的多个国家[5]。2019年8月，LSD首次传入我国新疆伊犁州，这种远距离的跨境传播方式无疑加大了防控难度。目前，疫苗接种是最有效的预防LSD的方法，但迄今并无有效的治疗方法和疫苗产品。因此，鉴于我国首次暴发疫情，掌握我国流行毒株的特性及其与宿主细胞的相互作用将有利于加快新型疫苗的研发。
本研究中作者从暴发地采集了牛皮肤病变组织，接种MDBK细胞进行了病毒分离，并采用透射电镜观察病变组织及病毒感染后的MDBK细胞，同时，对感染后24 h的MDBK细胞进行转录组学分析，筛选差异表达基因并将其按功能分类，分析它们参与的细胞信号通路。本研究将为阐明LSDV与宿主相互作用及其致病机制提供线索，从而为疫苗产品的研发提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 主要材料牛病变皮肤组织采自新疆伊犁州，MDBK细胞由重庆市畜牧科学院保存。牛结节性皮肤病病毒荧光PCR检测试剂盒购自北京森康生物技术有限公司。PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。荧光定量PCR引物及Tagman探针委托上海生工生物工程有限公司合成。
1.2 病毒分离与鉴定将无菌采集的牛病变皮肤组织做超薄切片，负染后用投射电子显微镜观察病变组织。同时将病变组织在无菌条件下研磨，用PBS(含10%青链霉素)重悬，10 000 g离心10 min，上清经0.22 μm无菌过滤。取1 mL滤液于30 mL无血清的DMEM培养基中，加入已长成单层的MDBK细胞，5% CO2，37 ℃孵育1 h，弃上清，并用PBS洗3次，添加含2% FBS的DMEM继续培养，至90%细胞出现成团、挤压等细胞病变(CPE)时，反复冻融细胞液3次，10 000 g离心10 min收集上清备用。
将保存的细胞上清液进行连续梯度稀释(10-1~10-7)，取部分稀释梯度样品用牛结节性皮肤病病毒荧光PCR检测试剂盒进行鉴定。同时取各稀释梯度样品各100 μL加入已接入MDBK细胞的96孔板，连续培养观察6 d，通过Reed-Muench法计算病毒TCID50效价。取100TCID50的LSDV接种对数生长期的MDBK细胞，培养24 h后固定细胞，通过透射电子显微镜观察病毒粒子形态。
1.3 细胞培养取对数生长期的MDBK细胞铺于6孔细胞培养板，当单层细胞汇合度约80%时，接种100TCID50的LSDV，孵育1 h后，更换含2% FBS的维持液，24 h后收获细胞并命名为LSDV-1、LSDV-2和LSDV-3；未接毒的细胞作为对照组，并命名为NC-1、NC-2和NC-3。
1.4 总RNA提取从组织样本中提取总RNA，采用琼脂糖凝胶电泳初步检测RNA完整性及是否有DNA污染，通过Agilent 2100 bioanalyzer精确检测RNA完整性，利用Nano-Photometer Spectrophotometer检测RNA纯度。
1.5 文库构建与测序采用建库试剂盒NEBNext® UltraTM RNA Library Prep Kit构建cDNA文库。首先通过Oligo(dT)磁珠富集带有polyA尾的mRNA，并用二价阳离子将得到的mRNA随机打断。以片段化的mRNA为模板，随机寡核苷酸为引物合成cDNA第一条链，随后以第一链为模板合成cDNA第二条链。纯化双链cDNA，然后经过末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPure XP beads筛选250~300 bp的cDNA，PCR扩增，纯化后获得文库。最后使用Agilent 2100 bioanalyzer对文库的插入片段大小(insert size)进行检测，符合预期后，qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量。质检合格的文库采用Illumina Next Seq500进行双末端测序。
1.6 数据质控为了保证数据分析的质量及可靠性，需对原始数据进行过滤。主要包括去除带接头(adapter)的reads、去除含N(N表示无法确定碱基信息)的reads、去除低质量reads(Qphred≤20的碱基数占整个read长度的50%以上的reads)。同时，对clean data进行Q20、Q30和GC含量计算。
1.7 差异基因筛选使用DESeq2软件(1.16.1)进行两个比较组合之间的差异表达分析(每个组3个生物学重复)。使用Benjamini和Hochberg来调整所得P值以控制错误发现率。以P值< 0.05、|log2(fold change)|＞1为标准筛选差异表达基因。
1.8 差异基因富集分析通过Cluster Profiler(3.4.4)软件从生物学过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)进行差异表达基因的GO(Gene Ontology)富集分析，当校正后的P值小于0.05时，认为该GO功能存在显著富集情况。同样采用Cluster Profiler(3.4.4)分析信号通路数据库KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)中差异表达的基因，并以校正的P值小于0.05为条件判断信号通路的显著性。
1.9 差异表达基因的RT-qPCR验证为进一步验证转录组分析结果，本试验在显著富集的信号通路中随机选取了5个上调表达、5个下调表达的差异表达基因进行RT-qPCR验证。病毒感染细胞后24 h，提取总RNA，并将其反转录成cDNA；然后根据TaKaRa RT-PCR试剂盒说明书进行扩增，qPCR引物与Tagman探针委托上海生工生物工程有限公司合成。以GAPDH作为内参基因，扩增结果根据公式2-ΔΔCt计算各基因的相对表达量，采用GraphPad Prism 8统计作图。
2 结果 2.1 病毒分离与鉴定LSDV属于痘病毒科、羊痘病毒属，由核心、侧体和包膜组成。牛皮肤病变组织制备超薄切片后进行负染，通过电镜观察可见病变组织中存在具备典型痘病毒形态的病毒粒子(图 1A)。将病变组织研磨后的上清液接入MDBK细胞培养，再通过电镜观察，可见典型的椭圆形痘病毒样粒子，大小约340 nm ×250 nm，与痘病毒的平均长、短径值320 nm×260 nm基本相符；并且可以明显看到病毒粒子的包膜和核心结构(图 1B)。利用牛结节性皮肤病病毒荧光PCR检测试剂盒检测不同稀释梯度的细胞培养上清，结果如图 2所示，细胞上清液中LSDV检测结果为阳性。综合电镜观察与荧光PCR检测结果可知，本试验成功从牛病变组织中分离到LSDV。
|
图 1 透射电镜观察LSDV Fig. 1 Transmission electron microscope observation of LSDV |
|
图 2 LSDV荧光PCR鉴定结果 Fig. 2 Identification results of LSDV by fluorescence PCR |
感染组和对照组原始测序数据经过滤后(表 1)，Q20(%)和Q30(%)值均大于90%，表明质控后得到了高质量的测序数据。
|
表 1 测序数据统计分析 Table 1 Statistical analysis of sequencing data |
采用edgeR软件筛选出P-value＜0.05，|log2FC|＞1的显著差异表达基因，结果显示(图 3)，病毒感染细胞24 h后，差异表达基因共499个，其中112个基因上调表达，387个基因下调表达。
|
图 3 差异表达基因火山图 Fig. 3 Volcano map of differentially expressed genes |
利用Goatools数据库对差异表达基因进行功能富集分析，结果发现这些差异基因富集的GO terms共有4 054个，其中显著富集的有259个，涉及BP、CC和MF 3大类。图 4为前30条显著富集的GO terms，由图可知，与生物过程有关的GO terms最多，高达22个，富集最显著的是蛋白激酶活性调节，其次是细胞对异源刺激的应答以及血管内皮生长因子的调节和囊泡运输过程调节。CC中GO富集最显著的是内质网输出位点，此外，与囊泡相关的差异基因富集较多。MF中差异表达基因主要富集在胶原结合、泛素蛋白连接酶活性和GTP酶结合等terms。
|
图 4 前30条显著富集的GO terms Fig. 4 Top 30 highly enriched GO terms |
采用KOBAS对差异表达基因进行KEGG信号通路富集分析，发现它们富集到247条信号通路中，前20个富集的信号通路如图 5所示。在富集的信号通路中有11条信号通路存在显著性变化(P-value＜0.05)，如表 2所示，MAPK信号通路(MAPK signaling pathway，ID：bta04010)的变化最大，其次是不饱和脂肪酸合成(biosynthesis of unsaturated fatty acids，ID：bta01040)与胆汁分泌(bile secretion，ID：bta04976)，富集的差异基因分别有15、3和4个。同时与免疫相关的差异基因主要集中在变化最大的MAPK信号通路中，主要有丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶3(PPP3CA)、促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶1(MAP3K1)、白介素1α(IL1A)与白介素1β(IL1B)，这一结果可为进一步研究LDSV的免疫源性奠定基础。
|
图 5 前20条富集的KEGG信号通路 Fig. 5 The first 20 enriched KEGG signaling pathways |
|
|
表 2 显著富集信号通路及其差异表达基因 Table 2 Significantly enriched signaling pathways and differentially expressed genes |
为了进一步验证转录组差异分析结果的准确性，本文从显著性变化的11条信号通路中随机筛选了5条上调表达与5条下调表达的基因进行RT-qPCR验证，结果如图 6所示，IL1A、IL1B、MAP3K1、HSD17B12和STAT4基因表达下调，NGF、NROB2、WNT11、AXIN2和CYP46A1基因表达上调，结果与转录组测序一致，证明了此次结果的可靠性。
|
图 6 差异表达基因的RT-qPCR验证 Fig. 6 RT-qPCR verification of differentially expressed genes |
世界动物卫生组织(OIE)将牛结节性皮肤病列入法定报告传染病清单，表明其具有快速传播潜力，且有能力造成严重的经济损失。LSD起源于非洲，后在中东、巴尔干地区、高加索南部和俄罗斯联邦、土耳其、希腊东北部及东南欧的多个国家流行。2019年8月，LSDV首次传入我国新疆伊犁州，刘平等[6]调查发现，此次疫情分布于察布查尔县、伊宁市和霍城县等3个地区的17个乡镇或场点，发病率为17.0%~36.2%。本研究首次将中国境内分离到的LSDV感染MDBK细胞，然后进行转录组分析，以期为后续疾病检测及疫苗研发提供理论依据。
通过GO和KEGG分析得知，差异表达基因主要富集在MAPK信号通路，MAPK是将信号从细胞表面传导至细胞核内部的重要传递者，是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，表明细胞被攻击后发生了一系列的信号转导。其次不饱和脂肪酸及胆汁分泌两个信号通路也发生了显著变化，表明病毒入侵后，细胞的代谢也受到了影响。
在这些主要信号通路中，显著变化且参与天然免疫应答的基因有MAP3K1、PPP3CA、IL1A和IL1B。MAP3K1是MAP3K家族成员之一，是1个196 ku的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，可被生长因子、促炎细胞因子、激素、神经递质、低温、高渗等多种因子(素)激活[7-8]，MAP3K1调控着真核细胞的生存、凋亡、运动与迁移[9-10]，且大量研究表明，其在肿瘤细胞分化、侵袭和转移中发挥着重要作用。本研究发现，LSDV感染后，MAP3K1在MDBK细胞中的表达显著下调，提示病毒感染影响着细胞的命运。与MAP3K1的磷酸化作用相反，PPP3CA是一个丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶，其脱磷酸化作用可以调节细胞因子介导的T细胞活化[11-12]。同时，PPP3介导的信号通路可调节细胞增殖、血管平滑肌细胞分化、心血管形态发生、心肌肥大和免疫应答等多种生理过程[13-14]。本研究中，PPP3CA的显著变化可能参与了细胞的免疫防御。
此外，参与免疫应答的差异表达基因还有HIF1A、RORA、LRRK2、AP3B1和ANO6等，其中HIF1A和RORA与血管内皮生长因子调节相关，LRRK2、AP3B1和ANO6与细胞器及内质网小泡介导的蛋白转运相关。HIF1A可被乏氧及炎症细胞因子所激活，与炎症和癌症具有密切关系；转录因子RORA不仅表达于多种器官组织，还在巨噬细胞、淋巴细胞和髓细胞中表达[15]，在细胞增殖分化、机体稳态、代谢调控及免疫调节中发挥重要作用[16-17]。因此，HIF1A和RORA的差异表达可能是细胞抵御外来病毒，增强免疫应答作出的响应。研究表明，LRRK2可与Sec16A相互作用从而调节内质网出口位点的蛋白输出功能[18]；AP3是一种衔接蛋白复合体，主要负责对高尔基体合成的特定蛋白进行筛选和包装，然后转运至多种溶酶体相关细胞器[19-20]。AP3B1编码AP3蛋白复合体的β 3A亚基，其突变会影响膜泡运输过程，从而导致高尔基体合成的蛋白无法到达特定部位发挥功能。本研究中，LRRK2和AP3B1显著下调，表明病毒入侵细胞后，细胞通过阻止某些蛋白的运输从而发生一系列复杂的变化。
4 结论通过转录组分析，发现MDBK细胞在感染LSDV后，有499个基因发生差异性表达。其中，上调表达的基因有112个、下调表达的基因有387个。通过对基因注释发现，差异表达基因主要集中在丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路，而且参与天然免疫且涉及细胞凋亡的MAP3K1基因表达呈现显著下调，提示LSDV感染会影响MDBK细胞的迁移与凋亡等过程。除此之外，LSDV也引起MDBK细胞的不饱和脂肪酸及胆汁分泌两个信号通路发生了显著变化。本研究丰富了LSDV的转录组信息，而且为LSDV的致病机制与MDBK细胞的抗病毒研究也提供了基础。
| [1] | FAY P C, COOK C G, WIJESIRIWARDANA N, et al. Madin-Darby bovine kidney (MDBK) cells are a suitable cell line for the propagation and study of the bovine poxvirus lumpy skin disease virus[J]. J Virol Methods, 2020, 285: 113943. DOI: 10.1016/j.jviromet.2020.113943 |
| [2] | TUPPURAINEN E S M, VENTER E H, COETZER J A W, et al. Lumpy skin disease: attempted propagation in tick cell lines and presence of viral DNA in field ticks collected from naturally-infected cattle[J]. Ticks Tick Borne Dis, 2015, 6(2): 134–140. DOI: 10.1016/j.ttbdis.2014.11.002 |
| [3] | TUPPURAINEN E S M, OURA C A L. Review: lumpy skin disease: an emerging threat to Europe, the Middle East and Asia[J]. Transbound Emerg Dis, 2012, 59(1): 40–48. DOI: 10.1111/j.1865-1682.2011.01242.x |
| [4] | SPRYGIN A, PESTOVA Y, WALLACE D B, et al. Transmission of lumpy skin disease virus: A short review[J]. Virus Res, 2019, 269: 197637. DOI: 10.1016/j.virusres.2019.05.015 |
| [5] | CALISTRI P, DECLERCQ K, GUBBINS S, et al. Lumpy skin disease: Ⅲ. Data collection and analysis[J]. EFSA J, 2019, 17(3): e05638. |
| [6] |
刘平, 李金明, 陈荣贵, 等. 我国首例牛结节性皮肤病的紧急流行病学调查[J]. 中国动物检疫, 2020, 37(1): 1–5.
LIU P, LI J M, CHEN R G, et al. The first outbreak investigation of lumpy skin disease in China[J]. China Animal Health Inspection, 2020, 37(1): 1–5. (in Chinese) |
| [7] | XIA Y, MAKRIS C, SU B, et al. MEK kinase 1 is critically required for c-Jun N-terminal kinase activation by proinflammatory stimuli and growth factor-induced cell migration[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97(10): 5243–5248. DOI: 10.1073/pnas.97.10.5243 |
| [8] | YUJIRI T, SATHER S, FANGER G R, et al. Role of MEKK1 in cell survival and activation of JNK and ERK pathways defined by targeted gene disruption[J]. Science, 1998, 282(5395): 1911–1914. DOI: 10.1126/science.282.5395.1911 |
| [9] | UHLIK M T, ABELL A N, CUEVAS B D, et al. Wiring diagrams of MAPK regulation by MEKK1, 2, and 3[J]. Biochem Cell Biol, 2004, 82(6): 658–663. DOI: 10.1139/o04-114 |
| [10] | HAGEMANN C, BLANK J L. The ups and downs of MEK kinase interactions[J]. Cell Signal, 2001, 13(12): 863–875. DOI: 10.1016/S0898-6568(01)00220-0 |
| [11] | GARCIA A, CAYLA X, GUERGNON J, et al. Serine/threonine protein phosphatases PP1 and PP2A are key players in apoptosis[J]. Biochimie, 2003, 85(8): 721–726. DOI: 10.1016/j.biochi.2003.09.004 |
| [12] | ROSKOSKI JR R. Src kinase regulation by phosphorylation and dephosphorylation[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 331(1): 1–14. DOI: 10.1016/j.bbrc.2005.03.012 |
| [13] |
李天祝, 向本琼. 蛋白磷酸酶PP2A的结构及其肿瘤抑制因子功能[J]. 生物化学与生物物理进展, 2009, 36(2): 133–142.
LI T Z, XIANG B Q. The structure of protein phosphatase 2A and its inhibition of tumorigenesis[J]. Progress in Biochemistry and Biophysics, 2009, 36(2): 133–142. (in Chinese) |
| [14] |
王凯. 神经钙调蛋白磷酸酶PPP3CA特异性siRNA对VEGF和FGF2诱导的羊胎盘动脉血管内皮细胞增殖的影响[D]. 大连: 大连医科大学, 2008.
WANG K. Effect of PPP3CA siRNA on VEGF-and FGF 2-stimulated cell proliferationin ovine fetoplacental artery endothelial cells[D]. Dalian: Dalian Medical University, 2008. (in Chinese) |
| [15] | HAMILTON B A, FRANKEL W N, KERREBROCK A W, et al. Disruption of the nuclear hormone receptor RORα in staggerer mice[J]. Nature, 1996, 379(6567): 736–739. DOI: 10.1038/379736a0 |
| [16] | GOLD D A, GENT P M, HAMILTON B A. RORα in genetic control of cerebellum development: 50 staggering years[J]. Brain Res, 2007, 1140: 19–25. DOI: 10.1016/j.brainres.2005.11.080 |
| [17] | BESNARD S, HEYMES C, MERVAL R, et al. Expression and regulation of the nuclear receptor RORα in human vascular cell[J]. FEBS Lett, 2002, 511(1-3): 36–40. DOI: 10.1016/S0014-5793(01)03275-6 |
| [18] |
杨璇, 刘小鹏, 宋彬彬, 等. Lrrk2缺失损害内质网蛋白输出的机制研究[J]. 脑与神经疾病杂志, 2019, 27(10): 611–614.
YANG X, LIU X P, SONG B B, et al. The study of mechanism of impaired endoplasmic reticulum export induced by Lrrk2 deficiency[J]. Journal of Brain and Nervous Diseases, 2019, 27(10): 611–614. (in Chinese) |
| [19] | CHAPUY B, TIKKANEN R, MüHLHAUSEN C, et al. AP-1 and AP-3 mediate sorting of melanosomal and lysosomal membrane proteins into distinct post-Golgi trafficking pathways[J]. Traffic, 2008, 9(7): 1157–1172. DOI: 10.1111/j.1600-0854.2008.00745.x |
| [20] | DELL'ANGELICA E C. AP-3-dependent trafficking and disease: the first decade[J]. Curr Opin Cell Biol, 2009, 21(4): 552–559. DOI: 10.1016/j.ceb.2009.04.014 |