2. 全国畜牧总站, 北京 100125
, SUI Heming2, HAO Haisheng1, HU Zhihui1, PANG Yunwei1, ZOU Huiying1, DU Weihua1, ZHAO Xueming1, ZHU Huabin1
2. National Animal Husbandry Station, Beijing 100125, China
澳洲和牛(Australian Wagyu beef)原产于日本，是世界公认的适合生产优质高档雪花牛肉的理想肉牛品种[1]。据统计，日本和牛年饲养量高达180万头，可以满足1亿人对于雪花牛肉的消费需求。目前，虽然日本政府全面禁止和牛遗传物质(包括活牛、精液和胚胎)出口，但是美国和澳大利亚等国家之前已经进口了相当数量的纯种和牛。近年来，随着我国消费优质高档雪花牛肉人群的不断增加，国内一些企业先后从澳大利亚引进了纯种和牛胚胎和活牛[2-4]。但是，牛是单胎动物，每年通常只能成功繁殖1头犊牛，加之规模化基础母牛繁育场成本高，肉牛繁殖率低等原因，应用本交或人工授精的常规繁殖方法无法满足生产者快速建立核心群以及消费者对高档和牛肉的需要。
超数排卵-胚胎移植(multiple ovulation and embryo transfer，MOET)是快速扩繁良种牛的重要技术途径，MOET可在较短时间内获得大量的优质胚胎用于移植，因此，该技术可以快速、高效地挖掘与传播优良肉牛品种的优秀基因，从而最大程度地扩繁优秀家畜。据国际胚胎移植协会统计，2018年世界范围共利用外源促性腺激素超排供体母牛76 076万头，获得可用胚胎469 967万枚，头均6.2枚·次-1[5]。因此，MOET技术仍是优秀家畜快速扩繁的重要技术手段，相信未来在我国自主肉牛品种培育和扩繁中仍将发挥重要的作用[6]。
实际生产中，供体牛的超排效果受多种因素的影响，例如供体牛类型、超排次数以及激素剂量等均是影响供体牛超排效果的重要因素[4, 7-12]。此外，MOET技术在奶牛和一些主要肉牛品种中应用比较广泛[13-14]。但是，国内关于澳洲和牛超数排卵方面的研究较少，仅见毕江华等[9]研究了超数排卵次数对和牛体内胚胎生产的影响，隋鹤鸣等[4]研究了不同FSH剂量对和牛胚胎移植后代超数排卵效果的影响，赵明礼等[11]研究了超排前卵巢上的有腔卵泡数量多少对青年和牛体内胚胎生产效率的影响，但是上述研究的内容较为单一，且部分研究的试验动物头数少(n=9)。因此，本试验从不同供体牛类型、同期发情方法、FSH剂量以及超排次数等多角度研究其对澳洲和牛供体牛超排和胚胎生产效率的影响，旨在为澳洲和牛优质体内胚胎的生产以及核心生产群的快速建立提供一定的应用参考。
1 材料与方法 1.1 试验动物供体母牛为华北地区某纯种和牛良繁场提供的16~22月龄纯种青年和牛和产犊后90 d以上的纯种经产和牛母牛，所有牛只系谱信息完整，生殖器官正常，发情周期正常。精液为山东奥克斯畜牧种业有限公司同批次生产，经镜下抽检计数，精液活力≥35%，符合国标《牛冷冻精液》(GB 4143—2008)的质量要求。试验地点为华北地区的某纯种和牛繁育场，试验时间为4~8月份。
1.2 试验材料和试剂促卵泡激素(FSH，Folltropin-V，稀释后20 mL·瓶-1，含NIH-FSH-P1 20 mg· mL-1，Bioniche公司生产)、孕酮阴道栓(CIDR，1.56 g孕酮·支-1，Vetoquinol公司生产)、氯前列腺稀醇(PG，0.322 mg·mL-1，齐鲁动物保健品公司生产)，保存液、冲胚液均由Bioniche公司生产。
1.3 试验设计根据供体牛的选择条件，挑选符合条件的健康供体母牛。将供体牛按照发育生理阶段分为青年牛和经产牛两组，其中青年牛38头，经产牛42头。青年牛和经产牛两组内均设置不同的同期发情方法组、FSH剂量组以及超排次数组。
1.3.1 同期发情处理方法 根据同期方法把青年牛和经产牛的超排前同期处理分为埋置CIDR组和PG注射组，自然发情为对照组。CIDR组即在供体和牛发情周期的任意一天上午阴道埋植CIDR(埋植当天计为第0天)，并补充注射2支维生素ADE(每支5 mL)，埋置CIDR后第5天开始超数排卵处理；PG注射组即给直肠触诊检查卵巢上存在黄体的供体母牛肌肉注射PG 6 mL，注射后48~72 h内每天早、晚两次观察供体母牛发情情况(发情当天计为第0天)，发情后的第9~10天开始超排处理；对照组为自然发情组，观察到供体母牛发情当天计为第0天，发情后的第9~10天开始超排处理。
1.3.2 超排处理及人工授精 根据不同同情方法分别在CIDR埋置后第5~8天或观察到发情后第9~12天开始超数排卵处理，每天07: 00、19: 00分两次肌肉注射FSH，连续注射4 d，第5和第6次注射FSH的同时各注射1支PG(0.6 mg)，并于第6次注射FSH后撤出CIDR。第9天观察发情，观察到供体牛发情后的8~12 h进行第1次人工输精，使用1支细管冻精，间隔12 h后进行第2次人工授精，使用2支细管冻精。每天早、晚两次观察供体母牛自然发情情况并记录。青年牛FSH剂量分为120、200和220 mg 3组，经产牛FSH剂量分为220、230、240、250 mg 4组。
1.3.3 供体胚胎采集与质量鉴定 采用非手术方法于第1次人工输精后的第7天(发情当天为第0天)回收胚胎。供体母牛保定后，尾椎硬膜外腔注射5~7 mL利多卡因局麻，待尾部松弛后清除宿粪，高锰酸钾水消毒外阴后，用消毒纸巾擦净，然后用75%酒精消毒并用生理盐水冲洗2遍。选择德国(Minitub)15#采胚管回收冲胚，每次注射20~30 mL冲卵液到子宫并回收。每头供体牛每侧子宫角约使用120~160 mL冲胚液，胚胎回收后肌肉注射PG。胚胎收集在集卵杯中，使用体视显微镜进行检胚。根据国标《牛胚胎》(GB/T25881—2010)的形态学鉴定标准，将回收胚胎分为A、B、C (可用胚胎)、D(退化胚胎和未受精卵，不可用胚胎)级胚胎。
1.3.4 测定指标 记录统计不同试验组间供体牛FSH注射剂量、黄体数、回收胚胎数、可用胚胎数、A级优质胚胎数、不可用胚胎数、退化胚胎数、未受精数等指标。
1.4 统计分析试验数据采用“平均值±标准误”表示，应用SAS 9.2软件分别对不同供体类型、超排次数、FSH剂量和同期发情处理方法各组数据进行单因素方差分析及多重比较。P < 0.05表明组间差异显著。
2 结果 2.1 优质和牛超排情况分析优质和牛超排情况见表 1。结果表明，试验共超排优秀和牛供体117头，超排有效率(回收胚胎数或未受精卵数＞2个的供体头数占超排供体总头数的百分比)为86.3%，获得胚胎总数为1 183枚，其中，可用胚胎(含A、B、C三级胚胎)864枚，A级优质胚胎341枚，不可用胚胎(含未受精和退化胚胎)319枚。
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表 1 优质和牛超排情况一览表 Table 1 The result of superovulation in Wagyu beef |
如表 2所示，经产牛的超排有效率((95.46±2.58)%)显著高于青年牛((77.55±6.02)%)(P＜0.05)，胚胎总数(12.30 vs 10.40)、可用胚胎数(8.97 vs 7.66)、A级胚胎(3.86 vs 2.50)也明显高于青年牛，但各组间均无显著差异(P＞0.05)。
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表 2 不同供体牛对超数排卵效果的影响 Table 2 The effect of donor beef types on superovulation result |
如表 3所示，自然发情、前列腺素同期发情和埋植CIDR同期发情的超排有效率分别为(88.89±11.11)%、(95.45±4.54)%和(85.71±3.84)%，自然发情组供体牛头均可用胚胎总数((11.22±2.33)枚)显著高于PG处理组((6.09±1.05)枚)(P＜0.05)，其余各组间均无显著差异(P＞0.05)。
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表 3 超排前不同同期方法对和牛超排效果的影响 Table 3 Influence of different synchronization estrus methods on superovulation result of Wagyu beef before superovulation |
如表 4所示，不同剂量FSH可显著影响母牛超排效率，青年牛120 mg FSH组的超排有效率((55.56± 17.57)%)显著低于200 mg((88.00±6.63)%)和220 mg组((73.33±11.82)%)(P＜0.05)；不同FSH剂量对经产牛的不可用胚胎数影响显著，经产牛220 mg组的不可用胚胎数((2.28±0.65)枚)显著低于250 mg组((5.00±1.38)枚)(P＜0.05)。
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表 4 不同FSH剂量对和牛超排效果的影响 Table 4 Effects of different doses of FSH on superovulation result of Wagyu beef |
如表 5所示，青年牛第一次超排有效率((70.27± 7.62)%)显著低于第二次超排有效率(100%)(P＜0.05)，但是青年牛第二次超排回收A级优质胚胎数((1.42±0.39)枚)明显低于第一次((2.25±0.40)枚)；经产牛方面，经产和牛第一次超排有效率((95.12±3.41)%)和第二次超排有效率((96.0±4.00)%)差异不显著(P＞0.05)，但经产牛第二次超排回收的不可用胚胎数((4.44±0.92)枚)显著高于第一次超排((2.39±0.40)枚)(P＜0.05)，此外，第二次回收A级优质胚胎数((2.88±0.69)枚)明显低于第一次((4.17±0.80)枚)。横向对比青年牛和经产牛发现，无论是第一次超排还是第二次超排，青年牛回收的A级优质胚胎总数均低于经产牛。
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表 5 超排次数对供体超排效果的影响 Table 5 The influence of superovulation times on superovulation result of donors |
生产优质和牛胚胎进行移植是建立和牛核心生产群最快速的方法之一[15]。优质胚胎的生产一般分为体内和体外两种模式，近年来，尽管借助于活体采卵的体外胚胎生产数量在不断增加，然而，就目前国内现有的生产体系而言，体外胚胎生产仍存在生产效率低、冷冻效果差、胚胎移植妊娠率低等问题[16-18]。因此，应用稳定的体内胚胎生产体系生产和牛胚胎仍是不可替代的主要途径之一。
在过去20多年里，MOET广泛应用于奶牛等胚胎生产及国产化良种培育工作[19]，为中国荷斯坦奶牛等国产化自主品种的培育做出了重要贡献[13]。但是，MOET效果受多种因素的影响，其不仅受供体牛自身生理状态的影响，还受饲养管理水平、同期发情方法、激素浓度等因素的影响[7, 20-22]，并且，国内对于MOET在优质纯种和牛高效扩繁上的应用研究较少。
3.1 供体母牛类型对超数排卵效果的影响供体母牛卵巢对外源FSH处理产生反应是母牛获得良好超排效果的基础[23]。生产中，供体母牛超排效果是根据直肠触诊卵巢上的黄体数量，以及非手术采卵获得的胚胎或卵子数量来进行评价的[24]。正常情况下，每个发情周期母牛双侧卵巢最多各排出1个卵子和产生1个黄体，因此，当供体母牛超排后卵巢上黄体数量或者采集胚胎或卵子数量大于两个时，认为对该供体牛的超排有效。本试验研究结果表明，经产牛超排有效率显著高于青年牛，且头均胚胎总数、头均可用胚胎数、头均A级胚胎数等也明显高于青年牛，这与Peippo等[25]的研究结果一致，这可能是因为青年牛的体重和体高虽然达到了适配要求，但是其生长发育尚未结束，尤其是乳腺和生殖器官还没有发育成熟，导致卵巢对外源FSH处理的反应不好。此外，进一步对超排无效的青年供体牛分析发现，超排无效的青年牛中高达72.7%牛只(8/11)的体况评分都高于3.75(肥胖牛)，研究表明，体况也是影响超排效果的一个重要因素[26-27]，体况评分高的牛只卵巢上始基卵泡募集、发育迟缓，且血液循环对雌激素等消耗量更大，卵泡可能也需要发育到更大体积才有可能合成足量的雌激素来触发LH峰从而排卵，这也导致卵巢对于FSH的反应不佳[28-29]。体况评分高的供体牛直肠内脂肪沉积也会过度，这会直接影响直肠把握的精度，进而造成胚胎回收效率低。此外，本试验发现，青年牛子宫颈较为狭窄也是造成超排效率低的原因之一。本试验中，有1头青年供体牛因为采卵管无法通过子宫颈未进行冲卵，另外1头采卵时冲卵液回收不好，这可能与月龄较小有关，而这些都会影响青年供体和牛的超排有效率。
3.2 FSH剂量对供体超数排卵效果的影响外周循环血液中维持一定浓度FSH是诱发卵巢多个卵泡发育成熟并排卵的前提[30-31]，在一定范围内，随着FSH浓度的增加，供体牛卵巢黄体数和理论上可以回收的胚胎数也会随之增加，但是当FSH浓度增加到一定阈值后，供体牛卵巢的反应会达到平台期不再增加，如果继续增加FSH浓度，则卵巢反应会迅速下降，黄体数和可回收的胚胎数量也会下降[32]，这可能主要是FSH浓度需要跟卵巢上卵泡发育波相对应。研究表明，每头供体牛注射FSH的总剂量应根据供体牛品种和体重进行适当的增减[33]，比如青年供体牛体重小于经产供体牛体重，超排时应适当减少FSH剂量，而供体母牛重复超排时，随着超排次数的增加，也应适当增加FSH总剂量。本试验利用Folltropin-V(400 mg NIH·瓶-1)超排和牛供体，虽然不同剂量FSH可引起供体母牛一定的超数排卵效果，但是注射总剂量120 mg FSH超排青年供体牛，超排有效率只有55.56%，明显低于其他两个剂量。经产和牛供体FSH注射总剂量为220 mg超排有效率也低于其他几个剂量组，而且可用胚胎数也较少。因此，本试验的研究结果表明，应用Folltropin-V超排优质和牛供体时，青年供体牛(16~22月龄)超排最适宜的FSH总剂量为220 mg，经产母牛(胎次=1)FSH适宜总剂量为240 mg。如果对供体母牛进行连续超排，则第一次超排后应适当增加FSH注射剂量。
3.3 不同同期发情方法对和牛超排效果的影响超数排卵处理时供体母牛所处的发情周期阶段可显著影响供体牛超排效果[34]。许多研究表明，无论是eCG还是FSH超排供体牛，黄体期中期(发情后第8~12天)开始促性腺激素处理的超排效果显著优于卵泡期、黄体期早期(发情后第5~7天)或者黄体期后期(发情后第14天)超排处理的效果[35]。Siqueira等[36]研究表明，从发情周期第10天开始FSH处理的超排效果，无论是供体牛卵巢直径、黄体数以及血清孕酮浓度都显著高于发情周期第2或第18天开始处理的超排效果。
实际生产中，为了提高超排效率，需要对一群供体母牛进行同期发情处理。本试验采用注射前列腺素并观察发情，或者埋植阴道栓(CIDR)处理，然后超排。试验结果表明，自然发情、前列腺素同期和埋植CIDR处理，供体母牛的超排有效率和获得胚胎数相似，但是自然发情组供体牛头均可用胚胎总数显著高于PG处理组。这可能是自然发情后第8~12天时供体母牛卵巢上对外源促性腺激素敏感的中等大小卵泡数量最多，从而使更多的腔前卵泡发育成为有腔卵泡。
3.4 超排次数对和牛超排效果的影响本试验第二次超排供体牛的选择是基于第一次超排结果而选择的超排效果良好的牛只，第二次和第一次超排间隔1个月。因此，从试验结果可以看出，青年和牛和经产和牛超排第二次回收的胚胎总数均较第一次有所增加，这可能是因为第二次超排牛只均是经过第一次超排验证的供体牛，对FSH的反应较好。但是，本试验结果也发现了一个与奶牛重复超排结果不一致的点，无论是青年和牛还是经产和牛，第二次超排的头均A级胚胎数均低于第一次超排，此外，本研究结果还表明，经产牛第二次超排回收的不可用胚胎数显著高于第一次超排，综上表明，虽然第二次超排回收胚胎总数增加了，但是胚胎的质量可能有所下降。
4 结论综合供体牛类型、超排次数、FSH剂量等多方面因素来看，在华北地区现有的生产管理水平下，和牛超排供体宜选用经产母牛，超排处理FSH总剂量宜为240 mg，这对和牛体内胚胎高效生产和核心群的建立具有一定的参考价值。
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