2. 华南农业大学动物科学学院, 国家生猪种业工程技术研究中心, 广州 510642
, ZHAO Xin2, LI Guoling2, XING Pingping2, LI Zicong2, YANG Huaqiang2, WU Zhenfang2
, CHEN Bin1
2. National Engineering Research Center for Breeding Swine Industry, College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
精子发生周期贯穿雄性的整个生命过程，从精原干细胞开始直到精子的形成，而精原干细胞(SSCs)在维持这一周期不断交替进行中起着至关重要的作用。它是体内唯一能将遗传信息传递给下一代的成体干细胞，被应用在转基因育种、物种的保种及生殖疾病治疗等各个研究领域。它的数量非常稀少，在小鼠中SSCs仅占生殖细胞的0.3%，比人类(22%)要少的多[1]。所以对它的研究均建立在体外培养并富集后的SSCs样细胞基础上。而目前在大动物身上实现体外长期培养还很难。非啮齿类实现了生殖细胞集落的第一次长期培养并具有SSCs潜能的动物是兔[2]。然而除了兔以外，非啮齿类其他动物SSCs长期培养体系的开发尚未成功，家畜的SSCs长期培养仍处于起步阶段[3]。到目前为止，人类SSCs的体外培养似乎并没有找到维持和增殖的最佳条件[4-5]。事实上，即使是小鼠的生殖系干细胞(germline stem, GS)培养基的配方也还没有得到优化[6]。甚至不同品系的小鼠其SSCs体外培养效果也不同[7]。由此可见，目前，精原干细胞的体外培养还存在很多局限，一方面在于SSCs的来源，不同物种来源的SSCs其体外培养的难易程度不同。总体来说，啮齿类动物SSCs体外培养的难度要小，大动物及人类SSCs体外培养的难度大，这可能与睾丸微笼环境中调控精原干细胞增殖和分化关键因子的确定有关，大动物上有待寻找到这些关键因子。据文献报道，啮齿类动物SSCs体外培养的效果与收获的SSCs是何种品系来源有关，杂交品系B6D2F2体外培养效果没有近交品系C57BL/6 J明显，可能是由于睾丸微笼环境中体细胞对SSCs调控的影响[8-9]。另一方面在于饲养层和培养体系，为了对分离纯化的精原干细胞进行长期体外培养，使用适宜的培养基(如DMEM、DMEM/F12、StemPro34等)，添加合适的生长因子(如GDNF、LIF、bFGF、IGF1、EGF等)，取舍胎牛血清以及饲养层细胞(如STO (SIM mouse embryo-derived thioguanine and ouabain resistant) 或mEF)似乎是必要的[10-12]。很多体外培养成功的报道是基于标志蛋白的检测，如SSCs阳性标记GDNF家族受体α-1(GDNF family receptor alpha-1, GFRA1)、泛素羧基末端水解酶-1(ubiquitin C-terminal hydrolase L1, UCHL1)、早幼粒细胞白血病锌指蛋白(promyelocyte leukemia zinc-finger factor, PLZF)、受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RET)、B细胞/淋巴瘤6B(B cell CLL/lymphoma 6B, BCL6B)、分化抑制剂4(inhibitor of differentiation 4, ID4)、B细胞特异性小鼠白血病病毒整合位点1(B cell-specific moloney murine leukemia virus integration site1, BMI1)等[13-19]，阴性标记如v-kit细胞同源(cellular homolog of v-kit, C-KIT)、染色体结构维持6(structural maintenance of chromosomes 6, SMC6)、DEAD盒多肽4(DEAD box polypeptide 4, DDX4, also known VASA)等[20-22]。这些蛋白都有助于区分SSCs，但是值得注意的是，标志蛋白通常鉴定到的是未分化的精原细胞，并不是特定于SSCs。表达这些标志物的细胞移植后是否还能形成增殖的细胞集落，将是体外培养后需要解答的首要问题[23]。事实上，只有1%~2%的培养物细胞在移植后还能产生集落[24]。由于目前还没有特定的SSCs标志基因，生殖细胞移植被认为是鉴定体外培养SSCs样细胞功能的金标准。
本研究通过对培养条件和体系进行优化，在体外实现ICR小鼠SSCs的稳定培养，并通过移植验证SSCs的生物学功能。这可为别的品系小鼠SSCs体外培养提供重要参考。另外，来自不同物种SSCs的特性是相似的，大动物乃至人类精原干细胞的培养经验都是从啮齿类动物的培养中借鉴而来，本研究也可为大动物及人类SSCs的体外培养提供借鉴。
1 材料与方法 1.1 试验材料和试剂ICR乳鼠购自广东省医学实验动物中心；小鼠胎儿成纤维细胞(mEF)、内源性生殖细胞消融的受体小鼠均为华南农业大学国家生猪种业工程技术研究中心提供；StemPro-34无血清培养基为Invitrogen公司产品；重组人白血病抑制因子(LIF)为Millipore产品；重组大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)为RD产品；重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF1)、小鼠表皮生长因子(EGF)均为Novus产品；泛素羧基末端水解酶-1(UCHL1)小鼠单克隆抗体为Proteinech产品；早幼粒细胞白血病锌指因子(PLZF)小鼠单克隆抗体为Santa Cruz公司产品；Anti-Mouse IgG(Alexa Flour 488)为CST产品；慢病毒颗粒细胞感染(LPP-EGFP-Lv156-400)试剂盒为广州易锦生物技术有限公司产品。
1.2 小鼠睾丸细胞的分离取6~8日龄新生ICR乳鼠的睾丸，用两步酶消化法进行消化，即先用胶原酶IV(工作液浓度为1 mg·mL-1)和DNAse I(工作液浓度为20 U·mL-1) 37 ℃消化10 min，使曲细精管分散；再用0.25%胰蛋白酶和DNAse I(20 U·mL-1)继续37 ℃消化5 min，使曲细精管充分消化，睾丸单细胞形成。用40 μm孔径的尼龙细胞筛过滤单细胞悬液。滤液用血球计数板统计睾丸单细胞活力。
1.3 小鼠SSCs的纯化将上述得到的睾丸单细胞悬液进行5次差速贴壁处理，即将睾丸单细胞悬液接种在一个6 cm的细胞培养皿中，放在37 ℃，5% CO2培养箱中培养。每隔1 h收集尚未贴壁的细胞悬液，重新接入一个新的6 cm的细胞培养皿中继续培养。如此重复操作，至最后一次差速贴壁完，将收集到的未贴壁细胞转入一个新的6 cm培养皿中继续过夜培养。第2天，收集到的未贴壁的细胞悬液即为纯化后的SSCs细胞。
1.4 饲养层的制备F3代的mEF细胞培养到95%汇合时，加丝裂霉素C溶液进行处理。设置4个浓度梯度，DMEM/F12培养基中丝裂霉素C的含量分别为0、10、20、30 μg·mL-1。各组于37 ℃细胞培养箱中孵育5 h后进行换液，换为正常的完全培养基(DMEM/F12+10%FBS)继续培养。第2天用96孔板进行传代。设置了3个时间点收集细胞，分别是传代培养后第1、3、5天，用MTT法检测细胞增殖情况，确定最佳处理浓度，并将用它处理之后的mEF作为SSCs饲养层。另外，用多聚赖氨酸(polylysine, PLL)和层粘连蛋白(laminin)联合铺板(PLL-L)用于体外SSCs的培养，即加多聚赖氨酸溶液到一个6 cm培养板上，将板放入细胞培养箱中孵育4 h后倒掉孵育液，加入层粘连蛋白工作液，继续孵育1 h后倒掉孵育液，将板放在培养箱中备用。
1.5 用不同的体系来培养小鼠SSCs细胞分别用DMEM/F12和StemPro-34作为培养基，两种培养基中均加入2%的血清替代物B27和1%的谷氨酰胺来培养SSCs，并在培养后24 h观察SSCs的增殖情况，以此来评估两种培养基对SSCs体外培养的效果。用StemPro-34(添加B27和谷氨酰胺)作为基础培养基，添加不同的生长因子：20 ng·mL-1 GDNF、10 ng·mL-1 LIF、10 ng·mL-1 EGF、10 ng·mL-1 bFGF、10 ng·mL-1 IGF1，在SSCs体外培养4 d后，用MTT法检测细胞增殖，来评估生长因子的添加效果。
1.6 小鼠SSCs体外增殖的免疫法检测收集饲养层上增殖的SSCs，用4%多聚甲醛溶液固定后，按照AKP显色试剂盒说明书来进行免疫显色，显微镜下观察SSCs细胞状态。同样，对多聚甲醛溶液固定后的SSCs分别进行通透化处理、封闭、一抗孵育(PLZF和UCHL-1抗体均用一抗稀释液1∶200进行稀释)、二抗孵育、Hochest33342细胞核复染，最后在荧光显微镜下观察细胞增殖情况。
1.7 小鼠SSCs体外增殖的分子检测收集饲养层上增殖的SSCs，按照Eastep® Super总RNA提取试剂盒说明书提取RNA。按照TaKaRa说明书进行cDNA的合成。以合成的cDNA为模板，以β-actin为内参基因，对培养的SSCs的自我更新基因及生殖标志基因等进行RT-PCR检测，检测基因及引物序列见表 1。同时，以培养前的SSCs为对照，实时定量分析培养后的SSCs中多能基因SOX2和自我更新基因C-RET、GFRA1、UCHL1、BCL6B的表达水平。每个样品3个重复。相对表达量用2-ΔΔCT 方法计算。qRT-PCR引物序列见表 1。
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表 1 RT-PCR(qRT-PCR)引物 Table 1 The primer sequences for RT-PCR(qRT-PCR) |
当SSCs克隆团增殖到一定的密度或者克隆团长势异常时，进行传代培养。首先，进行换液，随后，拧紧细胞培养瓶的瓶盖，轻轻晃动培养液，显微镜下观察克隆团是否脱离饲养层。然后，将尚未脱离下来的团块，用枪头轻轻地反复吹打，显微镜下观察是否吹打干净。最后，将细胞悬液转移至一个新的接种了饲养层的细胞培养瓶中，于CO2培养箱中继续培养，每培养1周左右进行再次传代。也可以根据需要按照常规的细胞冻存方法对SSCs进行冻存处理。
1.9 小鼠SSCs生物学功能的检测在SSCs传代至第6代时，收集饲养层上的SSCs，用慢病毒感染使其带有EGFP报告基因。首先，轻轻吹散克隆团细胞，在1 mL(细胞数约为2.5×104) 细胞悬液中加入10 μL慢病毒包装载体(1×108 TU·mL-1)，用枪头轻轻混匀。接着，将混合溶液转移到12孔板的一个孔，孔里有层粘连蛋白与多聚赖氨酸的联合铺板，可短时期内支持SSCs的贴壁生长。然后，将培养板放入37 ℃，5% CO2培养箱中孵育12 h。孵育结束后，丢弃孵育液，加DPBS洗涤细胞，并用枪头在DPBS中轻轻吹打，直到所有细胞漂浮。收集悬浮液到15 mL离心管中，300 g离心5 min。离心结束丢弃上清，用HBSS溶液200 μL重悬细胞。移植细胞悬液到ETV5基因敲除后内源性生殖细胞消融的受体小鼠睾丸中。移植后2个月采集附睾，观察精子的形成及检测精子来源。
1.10 小鼠睾丸组织的苏木素伊红染色和免疫组织化学处理采集不同周龄的ICR小鼠新鲜睾丸，将其制作成石蜡切片后，先后进行苏木素伊红(hematoxylin-eosin, H. E. )染色和免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)处理。将石蜡切片依次进行脱蜡至水、苏木素染色、伊红染色、脱水封片制作成H. E. 染色切片，随后显微镜镜检；同样，将石蜡切片依次进行脱蜡至水、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭、一抗孵育(PLZF)、二抗孵育、DAB显色、细胞核的苏木素复染制作成IHC切片，最后显微镜镜检、分析。
1.11 统计学分析每个组别均至少包含3个生物学重复。所有数据均以“平均数±标准误(mean±S. E. M)”来表示。采用SPSS Statistics 22软件对数据进行统计学分析。两组数值比较采用独立样本t检验，P＜0.05表示差异显著(用*表示)，P＜0.01表示差异极显著(用**表示)。3组及以上的数值比较采用单因素方差分析，P＜0.01表示差异极显著(用不同字母A、B、C、D、E表示)。
2 结果 2.1 小鼠生殖细胞的发育由图 1可以看出，小鼠1周龄时，生殖细胞(含SSCs)基本定位在基底膜，管腔中几乎没有发育的细胞；3周龄时管腔中的细胞增多；5周龄时各级生殖细胞增多，管腔中开始有精子的形成；8周龄时管腔中已经有大量的精子。纵观各个周龄发育中的生殖细胞数量，SSCs均占比很少，而在乳鼠阶段(1周龄左右)，睾丸中生殖细胞最单一，最有利于SSCs的纯化。
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H.E. 苏木素伊红染色；IHC. 免疫组织化学；红色箭头指示精原干细胞 H.E. Hematoxylin-eosin dyeing; IHC. Immunohistochemistry; red arrows indicate spermatogonial stem cells 图 1 不同周龄小鼠生殖细胞发育及SSCs定位 Fig. 1 The growth of mouse germ cells and position of SSCs at each week of age |
用两步酶消化法获得睾丸单细胞悬液(图 2A)，统计细胞活力为(99.27±0.70)%。睾丸单细胞悬液差速贴壁处理后，对留下来的未贴壁细胞进行免疫荧光染色，PLZF蛋白标记的细胞显示为绿色，被统计为SSCs细胞(图 2B)。随机选取6个视野，分别统计PLZF蛋白标记的细胞数和Hochest33342染核的细胞总数，前者与后者的比值计为SSCs的纯度。统计到的差速贴壁后SSCs的纯度为(79.30±1.56)%。
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A. 睾丸细胞分离；B. 精原干细胞的纯化 A. Isolation of testicular cells; B. Purification of spermatogonial stem cells 图 2 小鼠睾丸细胞分离与SSCs纯化 Fig. 2 Isolation of testicular cells and purification of mouse SSCs |
4组不同浓度的丝裂霉素C孵育液处理F3代的mEF细胞后，用MTT法检测细胞增殖情况(图 3A)。以无药物处理组于体外培养1 d的细胞数为对照组。结果显示，无药物处理组，相比第1天的细胞增殖，培养到第3天时细胞增殖数达到极显著水平(P＜0.01)；相比对照组，10 μg·mL-1处理组在第1天时细胞数量极显著减少(P＜0.01)，第3天时细胞数量增多，第5天时细胞生长状态良好，细胞数量没有明显变化；20 μg·mL-1组前3 d细胞数量无明显变化，到第5天时部分细胞生长状态不佳，细胞开始出现死亡；30 μg·mL-1处理组在第1天时，细胞数量就出现极显著减少(P＜0.01)，之后一直在不断减少。故10 μg·mL-1组为最佳处理浓度，用它处理后的mEF细胞作为SSCs的饲养层(图 3B)。另外，对比了mEF饲养层和PLL-L铺板对SSCs体外培养的效果。结果显示，在mEF饲养层上培养2 d后SSCs小小克隆团已经出现，培养7 d后克隆团进一步增大(图 3C)。在PLL-L板上培养2 d后也出现了SSCs小小克隆团，但是培养7 d后发现克隆团消失，细胞死亡(图 3C)。可见，mEF作为饲养层优于PLL-L，后者不能替代mEF作为SSCs的饲养层。
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A. 不同浓度丝裂霉素C对mEF细胞生长的影响(n=3)，不同字母(A、B、C、D、E)表示差异极显著(P＜0.01)，下同；B. SSCs接种时的饲养层细胞；C. mEF和PLL-L分别作为饲养层对SSCs体外增殖的影响，箭头指示精原干细胞克隆 A. Effect of mitomycin C with different concentrations on growth of mEF cells(n=3), different letters (A, B, C, D, E) represent extremely significant difference(P < 0.01), the same as below; B. Feeder layer cells for SSCs culture; C. The effect of two feeding layers (mEF and PLL-L) on SSCs proliferation in vitro, arrows indicate clone formation of spermatogonial stem cells 图 3 mEF饲养层的制备及两种饲养层(mEF和PLL-L)对小鼠SSCs增殖的影响 Fig. 3 Preparation of mEF feeder layer and the effects of two feeder layers(mEF and PLL-L) on the proliferation of mouse SSCs |
比较了DMEM/F12培养基和StemPro-34培养基对SSCs体外增殖的影响(图 4A)，结果显示，在DMEM/F12培养基中培养24 h后，SSC细胞几乎全部死亡(图 4A)，而在StemPro-34培养基中培养24 h后的SSC细胞存活下来，且出现小小的克隆团(图 4A)。比较了不同生长因子对SSCs体外增殖的影响(图 4B)，以StemPro-34基础培养基(不加任何因子)培养的细胞为对照组(Control)，体外培养4 d后统计各组的细胞增殖情况。结果显示，StemPro-34培养基中细胞增殖缓慢(图 4B)。在加了GDNF生长因子之后，细胞增殖迅速(图 4B，P＜0.01)。再加了LIF、bFGF和IGF1之后，细胞增殖均变得迅速(图 4B，P＜0.01)。而EGF因子的添加对细胞的增殖效果不明显(图 4B，P＞0.05)。
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A. 不同培养基对SSCs体外增殖的影响，箭头指示精原干细胞克隆；B. 不同生长因子对SSCs体外增殖的影响(n=3)，control代表StemPro-34培养基 A. Effects of different media on SSCs proliferation in vitro, arrows indicate clone formation of spermatogonial stem cells; B. Effects of different growth factors on SSCs proliferation in vitro (n=3), control represents StemPro-34 medium 图 4 不同培养体系对细胞增殖的影响 Fig. 4 Effects of different culture systems on SSCs proliferation |
体外培养2和14 d后，分别用AKP染色检测SSCs增殖情况，着色为蓝紫色的细胞被认为是阳性SSCs。培养初期，SSC细胞是小小的、圆圆的、孤立的，培养14 d后增殖的克隆集落抱团生长，分不清楚单个细胞，克隆集落边缘不整齐，表面凹凸不平，以一种健壮的表现紧紧黏附在饲养层上(图 5A)。抗体免疫荧光染色显示，这些克隆集落表达SSCs自我更新因子PLZF和UCHL1(图 5B)。提取这些增殖克隆集落的总RNA，RT-PCR检测SSCs中多能基因OCT4、SOX2、NANOG和自我更新基因GFRA1、C-RET、UCHL1、PLZF、ETV5、BCL6B以及生殖标志基因VASA的表达。结果显示，培养14 d后的SSCs集落除了不表达生殖标志基因VASA外，其余标志基因均得以表达(图 5C)。这个结果说明，体外培养的SSCs处于增殖阶段。随后，用纯化后未进行体外培养的SSCs作为对照组，比较了体外培养14 d后的SSCs克隆集落中多能基因SOX2和自我更新基因C-RET、GFRA1、UCHL1、BCL6B的表达量。结果显示，培养后的细胞中这些基因的表达量均极显著高于培养前(图 5D，P＜0.01)。这个结果进一步说明，体外培养14 d后的SSCs大量增殖。
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A. 体外培养2和14 d的SSCs分别用AKP染色检测细胞增殖；B. 用PLZF和UCHL1蛋白的免疫荧光检测SSCs的增殖，红色箭头指示精原干细胞克隆；C、D. 体外培养14 d的SSCs其生殖相关基因的RT-PCR检测和qRT-PCR检测(n=3) A. Detection of SSCs proliferation using alkaline phosphatase after 2 and 14 days in vitro culture; B. Detection of SSCs proliferation by immunofluorescence of PLZF and UCHL1 proteins, red arrows indicate clone formation of spermatogonial stem cells; C, D. Detection of reproductive-related genes in SSCs for 14 days in vitro culture by RT-PCR and qRT-PCR (n=3) 图 5 小鼠SSCs体外增殖的检测 Fig. 5 Detection of mouse SSCs proliferation in vitro |
将体外传代培养至第6代的SSCs用慢病毒感染使其带EGFP报告基因，随后被转移到受体小鼠的一侧睾丸中(图 6A)，另一侧睾丸不做移植作为对照组。移植后2个月分别采集对照组和试验组的附睾，观察附睾中精子的形成与形态。结果显示，对照组睾丸其相连的附睾中无精子形成，而移植的睾丸其相连的附睾中有很多形态正常的精子(图 6B)。在荧光显微镜下观察这些精子，看到精子的头部发绿光，而任何一只野生型的小鼠，其精子头部在荧光下不发绿光(图 6B)，说明了试验组产生的精子为供体SSCs来源。这个结果也进一步说明了体外稳定培养的SSCs具有正常生物学功能。
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A. 供体SSCs移植，SSCs带有EGFP报告基因；B. 精子来源检测，对照组没有进行移植，无精子生成，试验组产生的精子头部发出绿光，野生型组精子头部不发绿光；红色箭头指示精子 A. Transplantation of SSCs with EGFP reporter gene; B. Detection of sperm origin, no sperm was detected in control group (no transplantation), and the head of sperm originated in experimental group glowed green, but not in WT group; Red arrows indicate sperms 图 6 体外稳定培养的小鼠SSCs功能鉴定 Fig. 6 Functional identification of mouse SSCs culture in vitro |
精原干细胞的体外长期培养被认为是探索SSCs自我更新和分化的先决条件。小鼠SSCs的体外长期培养，需要考虑几个要素。
首先是精原干细胞的分离和纯化。在睾丸细胞的分离方法上，应用的比较多的是两步酶消化法，即胶原酶和胰蛋白酶。从睾丸细胞悬液中纯化SSCs的方法有很多，最常用的包括差速贴壁、密度梯度离心、形态学分选以及基于抗体的选择(如荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting, FACS)或免疫磁珠分选(magnetic activated cell sorting, MACS))。这些方法各有利弊，相比之下差速贴壁法最大的优势是对试验条件和设备的要求最低，操作简便，省时又省力。且结合文献的报道[25-27]，通过差速贴壁法，获得了纯度36%~77%的SSC细胞，虽然比报道的通过FACS和MACS可获得90% 以上高纯度的SSCs要低[28]，但是，本研究中获得的纯度约为79%的SSCs在体外获得的稳定培养也说明了差速贴壁是一种纯化SSCs的实用方法。
其次是饲养层的选择，本研究利用丝裂霉素C处理之后的mEF作为饲养层，实现了SSCs的体外稳定培养。这与前人的文献报道相一致，mEF作为饲养层有它独特的优势，丝裂霉素C处理之后的mEF自身的有丝分裂受抑制，失去了增殖能力，不会与干细胞竞争营养。但是它的细胞活性没有受到影响。它能产生多种生长因子，包括碱性成纤维细胞生长因子2、转化生长因子-β2、细胞外基质蛋白、活化素以及骨形态发生拮抗蛋白等[29-32]，这些因子对于干细胞的体外维持很重要。也有文献报道，多聚赖氨酸和层粘连蛋白的联合铺板对体外培养SSCs的效果甚至优于mEF[33]。这与本研究结果不一致，本研究中，PLL-L体外培养SSCs的第2天也出现了SSCs的小小克隆团，但是随着SSCs的逐渐死亡，培养到第7天时发现之前已经建立起来的克隆团均已消失，这说明在本研究中PLL-L并不适合小鼠SSCs的体外增殖与培养。
再次是培养体系的建立，目前对于SSCs的培养，应用最广泛的培养基依然是DMEM(高糖)和DMEM/F12，尤其是在家畜SSCs培养上[34-35]。有文献报道，DMEM很可能促进SSCs的自我更新和分化。一种可能含有未暴露成分的专有改良培养基StemPro-34，其中搭配的StemPro-34补充剂(含16个单独的化合物)可能对细胞的增殖有利[36]。本研究采用了这种改良培养基来培养小鼠SSCs，效果优于上述两种普通的培养基。用血清替代物代替传统的血清，不仅在本试验中获得了SSCs的稳定培养，在大动物上，虽然成功培养的报道少，但是血清替代物的使用对大动物SSCs的体外培养也成效显著。山羊的SSCs在含血清的培养基中只能维持2周，在无血清培养基中能维持4周[37]。在有血清替代物的培养基中，水牛SSCs能体外增殖维持28~30 d[38-40]。所以，无论在啮齿类动物还是大动物上，SSCs的体外培养都可以借鉴这种无血清培养体系。根据前人研究的经历，在培养体系中添加其他成分，如非必需氨基酸、丙酮酸钠、葡萄糖、巯基乙醇等，它们对SSCs的体外培养效果甚微。在本研究中，这些成分的添加也不能支持小鼠SSCs的体外增殖，是在选用了StemPro-34培养基，添加无血清和多种因子组合的体系后，成功的支持了ICR小鼠SSCs体外稳定培养。在别的物种上的研究也表明，虽然饲养层细胞能分泌多种生长因子和细胞素，但是GDNF能促进SSC的增殖和存活，这在许多物种上都取得了效果[37]。本研究显示，没有添加GDNF时，即使采用了StemPro-34培养基和无血清培养体系，也不能支持SSCs的稳定增殖，而当添加GDNF之后SSCs的增殖明显。LIF在小鼠胚胎干细胞自我更新中是必需添加的[41]。有研究表明，在没有LIF的培养基中干细胞的多能特性等性能会降低，细胞会倾向于分化，SSCs的数量从培养第1天的54.3%减少到第6天的18.7%[42]。在SSCs培养中，bFGF的存在导致PI3K/AKT和MAPK通路的激活，并提高SSCs的存活率和增殖率[43-44]。在添加GDNF、bFGF和LIF因子后，公鸡SSCs的增殖和克隆集落都有很大改善，然而，当培养基中3种因子同时添加时，增殖效果最为明显[45]。IGF1调节G2/M期细胞分裂的进程，可能有利于培养的SSCs进行有丝分裂[46]。本研究中的5种因子，在单独添加时均有促进小鼠SSCs增殖的效果，在多种因子组合添加时其增殖效果最为明显。可见，无论在啮齿类动物还是大动物SSCs培养上，这5种因子的添加尤其是组合添加体系都具有借鉴意义。虽然不同的物种其睾丸中微环境有所不同，造成体外培养SSCs的难易程度也不同，但是来自不同物种SSCs的特性是相似的，相信通过学者们的不懈努力，在大动物上只要找到调控微环境中SSCs增殖和分化的关键因子，大动物乃至人类SSCs的体外培养便会取得很大突破。
4 结论在本研究中，培养的SSC细胞是抱团生长的，用标志性蛋白检测均呈现阳性，也表达多能基因和自我更新基因，且最后移植的结果证明，体外稳定培养的SSCs具有正常生物学功能。本研究中的SSCs体外培养条件和体系的优化结果可以为别的品系小鼠和大动物以及人类的SSCs体外培养提供参考。
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