2. 教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室, 扬州 225009
, WANG Haiyang1, GUO Mengling1, ZHANG Qiang1, GAO Qisong1, LI Mingxun1,2, ZHANG Huimin1,2, YANG Zhangping1,2, MAO Yongjiang1,2
2. Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety of Ministry of Education, Yangzhou 225009, China
乳房炎是奶牛最常见的疾病之一，不仅使产奶量显著下降，而且会造成严重经济损失，还可导致乳汁成分发生改变，使牛奶的营养价值和食用价值显著下降[1-3]。奶牛乳房炎包括临床乳房炎(clinical mastitis, CM)和隐性乳房炎(subclinical mastitis, SCM)。SCM的特征是乳汁无肉眼可见的异常变化，但乳汁在理化性质、细菌学等方面发生变化，体细胞数(somatic cell count, SCC)一般大于50万个·mL-1等[4-5]。美国国家乳房炎委员会公布的数据显示，44.7%的奶牛和17.1%的乳区奶牛患有SCM，美国每年因奶牛乳房炎造成的损失为20亿美元[6]。研究表明，我国奶牛SCM的发病率达20%~50%，个别牛群发病率更高[7]。刘鸽等[8]在报告中显示，新疆石河子某牛场中SCM发病率为43.26%。相对于CM，由于SCM发病率高、隐蔽性强、危害大，所以对于SCM的控制重在预防和监测。
奶牛从产犊开始至产后60 d的这一阶段机体代谢强度逐渐提高，产奶量迅速增加，同时，日粮干物质和能量摄入不足，容易导致能量负平衡(negative energy balance, NEB)，从而增加奶牛患SCM的风险[9]。大量研究表明，奶牛SCC与乳房炎之间存在较高的遗传相关(0.5~0.7)，且泌乳早期SCC变化会引起泌乳后期SCC变化[10-13]。影响乳中SCC的因素很多，包括牛场管理、胎次、泌乳阶段、季节和月份等[14-19]，而关于荷斯坦牛产后前60 d患SCM次数与牛奶中SCC之间的相关研究在国内鲜有报道。因此，本研究通过对江苏地区12个牧场2017—2019年荷斯坦牛生产性能测定数据(dairy herd improvement, DHI)中SCC数据进行分析，探究荷斯坦牛产后前60 d患SCM次数对各泌乳月SCS的影响，为今后利用产后前60 d SCC对各泌乳月SCM发生情况及进行SCM风险预测和评估打下良好的基础，同时也有利于牧场及时采取相关措施进行防控和治疗，为减少经济损失等提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 数据来源本研究所用数据来自江苏地区12个奶牛场2017—2019年荷斯坦牛DHI测定记录共580 025条，主要包括：牛号、测定日期、胎次、产犊日期、泌乳天数、测定日SCC、SCS等。使用Excel 2019对DHI数据进行质控，剔除其中的异常数据，筛选标准：1)泌乳天数为0~5 d及大于305 d的数据；2)缺失或完全重复记录。最后符合条件的记录数为365 105条。其中对产后前60 d的SCM发病情况认定：SCC≥50万个·mL-1为产后前60 d患SCM，SCC < 50万个·mL-1为产后前60 d不患SCM，并对产后前60 d患SCM的次数进行统计，分别为0、1、2次。泌乳月划分：产后每30 d为一个泌乳月，从产后第61天开始为第3个泌乳月，第10个泌乳月到产后305 d为止。
1.2 统计分析采用固定模型1，使用SPSS(Ver 26.0)多因素方差分析模型分析产后前60 d患SCM次数、胎次、牧场规模和产犊季节对全期平均SCS的影响：
| $ \begin{array}{*{20}{c}} {{Y_{ijkmn}} = \mu + {M_i} + {F_j} + {P_k} + {S_m} + {{(M \times F)}_{ij}} + }\\ {{{(M \times P)}_{ik}} + {{(M \times S)}_{im}} + {e_{ijkmn}}} \end{array} $ | (模型1) |
式中，Yijkmn为荷斯坦牛全期平均SCS观察值，μ为总体均值，Mi为产后前60 d患SCM次数固定效应(i = 0, 1, 2)，Fj为胎次固定效应(j=1~5)，Pk为牧场规模固定效应(k= 1~4)，Sm为产犊季节固定效应(m=1~4)，(M×F)ij为产后前60 d患SCM次数和胎次交互作用固定效应，(M ×P)ik为产后前60 d患SCM次数和牧场规模交互作用固定效应，(M×S)im为产后前60 d患SCM次数和产犊季节交互作用固定效应，eijkmn为随机残差。
采用固定模型2，使用SPSS(Ver 26.0)多因素方差分析模型分析产后前60 d患SCM次数、胎次、牧场规模、测定季节和产犊季节等因素对各泌乳月SCS的影响，并通过卡方检验分析SCM次数在不同胎次和不同产犊季节的分布情况：
| $ \begin{array}{*{20}{c}} {{Y_{ijklmn}} = \mu + {M_i} + {F_j} + {P_k} + {{\rm{C}}_l} + {S_m} + {{(M \times F)}_{ij}} + }\\ {{{(M \times P)}_{ik}} + {{(M \times C)}_{il}} + {{(M \times S)}_{im}} + {e_{ijklmn}}} \end{array} $ | (模型2) |
式中，Yijklmn为荷斯坦牛不同泌乳月SCS观察值，Cl为测定季节固定效应(l=1~4)，(M×C)il为产后前60 d患SCM次数和测定季节交互作用固定效应，eijklmn为随机残差，其他说明同模型1。
胎次划分为5组，1~4胎各为1组，5胎及以上为第5组。12个牧场根据牛群规模划分为4个水平，分别为 < 1 000头、1 000~2 000头、2 001~5 000头、>5 000头，每个规模各3个牧场。根据江苏地区的气候特点，将测定季节和产犊季节划分为春季(3~5月)、夏季(6~8月)、秋季(9~11月)、冬季(12月到次年2月)。各因素不同水平间的多重比较使用Duncan’s法，并计算荷斯坦牛产后前60 d SCS与不同胎次和不同产犊季节各泌乳月SCS的皮尔森相关系数。显著性水平定义：P < 0.01为极显著，P < 0.05为显著，P＞0.05为不显著。表中所有数据均采用“平均值±标准误”表示。
2 结果 2.1 荷斯坦牛产后前60 d患不同次数SCM的频数分布不同胎次奶牛产后前60 d患SCM的频数及频率分布见图 1。荷斯坦牛产后前60 d DHI测定数据总记录随着胎次增加而降低，但产后前60 d患SCM的比例随着胎次增加而升高。其中，1胎牛产后前60 d患SCM比例最低(6.51%)，5胎及以上牛产后前60 d患SCM比例最高(17.68%)。χ2检验表明，各胎次奶牛产后前60 d患不同次数SCM的频数分布均达到极显著水平(P < 0.01)，不同胎次的χ2值分别为206 623.23、80 563.21、73 106.33、23 383.84和9 842.85。
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A.频数分布；B.频率分布 A.Distribution of record number; B.Distribution of frequency 图 1 不同胎次荷斯坦牛产后前60 d患SCM的频数及频率分布 Fig. 1 The distribution of the number and frequency with different number of SCM infection during first 60 days after calving of Holstein cows in different parities |
不同产犊季节奶牛产后前60 d患SCM的频数及频率分布见图 2。江苏地区荷斯坦牛产犊多集中于秋季和冬季，比例分别为43.87%和31.16%；夏季产犊产后前60 d患SCM的比例最高(9.49%)，秋季比例最低(8.25%)，冬季产犊产后前60 d患2次SCM的比例最高(1.12%)。χ2检验表明，各产犊季节奶牛产后前60 d患SCM次数分布均达到极显著水平(P < 0.01)，春、夏、秋、冬4个季节χ2值分别为25 414.33、32 227.57、97 377.36和85 097.25。
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A.频数分布；B.频率分布 A.Distribution of record number; B.Distribution of frequency 图 2 不同产犊季节荷斯坦牛产后前60 d患SCM的频数及频率分布 Fig. 2 The distribution of the number and frequency with different number of SCM infection during first 60 days after calving of Holstein cows in different calving seasons |
利用固定模型1分析非遗传因素对荷斯坦牛全期平均SCS的影响，结果见表 1。方差分析表明，产后60 d患SCM次数、胎次、牧场规模和产犊季节均对全期平均SCS有极显著影响(P < 0.01)；同时，产后60 d患SCM次数与胎次、牧场规模和产犊季节的互作对全期平均SCS也有极显著影响(P < 0.01)。
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表 1 不同因素对荷斯坦牛SCS的影响 Table 1 Effects of different factors on SCS of Holstein cows |
2.2.1 荷斯坦牛产后前60 d患SCM次数对不同胎次各泌乳月SCS的影响 利用固定模型2分析荷斯坦牛产后前60 d患SCM次数对不同胎次各泌乳月SCS的影响，结果如图 3所示。各胎次荷斯坦牛产后前60 d不患SCM奶牛的SCS均低于患SCM的奶牛，同时，患1次SCM奶牛的SCS均低于患2次SCM的奶牛。方差分析结果表明，荷斯坦牛产后前60 d患不同SCM次数对所有胎次各泌乳月SCS有极显著影响(P < 0.01)；1~3胎牛各泌乳月SCS随产后前60 d患SCM次数的增加而极显著增加(P < 0.01)；4胎牛产后前60 d患2次SCM各泌乳月SCS极显著高于不患SCM的奶牛(P < 0.01)，显著高于患1次SCM的奶牛(P < 0.05)；5胎及以上牛产后前60 d患1次SCM在第3~7泌乳月SCS与不患SCM的奶牛差异极显著(P < 0.01)。
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图 3 产后前60 d患SCM次数对不同胎次荷斯坦牛泌乳月SCS的影响 Fig. 3 The effects of number of SCM infection during first 60 days after calving on SCS in lactation months of Holstein cows for different parities |
2.2.2 荷斯坦牛产后前60 d患SCM次数对不同牧场规模各泌乳月SCS的影响 利用固定模型2分析荷斯坦牛产后前60 d患SCM次数对不同牧场规模各泌乳月SCS的影响，结果如图 4所示。不同牧场规模的荷斯坦牛在产后前60 d不患SCM的SCS均低于患SCM的奶牛，同时，患1次SCM奶牛的SCS低于患2次SCM的奶牛。对于规模在5 000头以上的牧场，患1次SCM和不患SCM的奶牛SCS差距逐渐缩小。方差分析结果表明，规模在5 000头以下的牧场，荷斯坦牛各泌乳月SCS随着产后前60 d患SCM次数的增加极显著增加(P < 0.01)。
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图 4 产后前60 d患SCM次数对不同牧场规模荷斯坦牛泌乳月SCS的影响 Fig. 4 The effects of number of SCM infection during first 60 days after calving on SCS in lactation months of Holstein cows for different farm size |
2.2.3 荷斯坦牛产后前60 d患SCM次数对不同测定季节各泌乳月SCS的影响 利用固定模型2分析荷斯坦牛产后前60 d患SCM次数对不同测定季节各泌乳月SCS的影响，结果如图 5所示。不同测定季节的荷斯坦牛在产后前60 d不患SCM奶牛的SCS均低于患SCM的奶牛，同时，患1次SCM奶牛各泌乳月的SCS均低于患2次SCM的奶牛。方差分析结果表明，春季和冬季测定时奶牛产后前60 d患1次SCM与不患SCM之间各泌乳月SCS均无显著差异(P>0.05)，夏季和秋季测定时产后前60 d不患SCM的奶牛各泌乳月SCS均极显著低于患1次SCM的奶牛(P < 0.01)。
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图 5 产后前60 d患SCM次数对不同测定季节荷斯坦牛泌乳月SCS的影响 Fig. 5 The effects of number of SCM infection during first 60 days after calving on SCS in lactation months of Holstein cows for different tested seasons |
2.2.4 荷斯坦牛产后前60 d患SCM次数对不同产犊季节各泌乳月SCS的影响 荷斯坦牛产后前60 d患SCM次数对不同产犊季节各泌乳月SCS影响的分析结果如表 2所示。产后前60 d患不同SCM次数对不同产犊季节各泌乳月SCS均有极显著影响(P < 0.01)。其中，春季产犊荷斯坦牛第3~8泌乳月的SCS随SCM次数增加而极显著增加(P < 0.01)；夏季产犊荷斯坦牛第3~7泌乳月的SCS随SCM次数增加极显著增加(P < 0.01)；秋、冬季产犊的荷斯坦牛产后前60 d患不同SCM次数之间SCS差异极显著(P < 0.01)，不同泌乳月SCS均随产后前60 d患SCM次数的增加而极显著增加(P < 0.01)。
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表 2 荷斯坦牛产后前60 d患SCM次数对不同产犊季节各泌乳月SCS的影响 Table 2 The effect of the number of SCM infection during first 60 days after calving on SCS in lactation months of Holstein cows for different calving seasons |
第1和第2泌乳月的平均SCS作为产后前60 d的SCS用于相关系数的分析，结果如图 6所示。经分析发现，奶牛产后前60 d SCS与各泌乳月SCS均呈极显著正相关(P < 0.01)，且着泌乳月的增加，产后前60 d的SCS与各泌乳月SCS的相关系数逐渐减小。其中，在不同胎次奶牛中，头胎牛产后前60 d SCS与第3~7泌乳月SCS的相关系数最低，4胎牛产后前60 d SCS与第3~5泌乳月相关系数均大于0.40。在不同产犊季节中，秋季产犊的荷斯坦牛产后前60 d SCS与第3~8泌乳月SCS的相关系数大于其他产犊季节，第3~5泌乳月SCS相关系数均大于0.43。
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*.P < 0.05;**.P < 0.01 图 6 荷斯坦牛不同胎次、产犊季节产后前60 d内SCS与各泌乳月SCS的相关 Fig. 6 Correlation between SCS of lactation months and SCS during first 60 days after calving of Holstein cows for different parities and calving seasons |
本研究发现，胎次对荷斯坦牛SCS有极显著影响，荷斯坦牛产后前60 d患SCM的比例随着胎次增加而升高，且产后前60 d患不同次数SCM在不同胎次间各泌乳月SCS差异显著。Jansen等[14]研究表明，奶牛SCC随胎次增加逐渐上升，经产牛SCC高于头胎牛。竹磊等[13]研究表明，泌乳早期SCS水平对奶牛个体泌乳中后期SCC有一定的影响。De Vliegher等[12]研究发现，产后5~12 d内SCC较高会对整个泌乳期SCC产生负面影响。Rupp和Boichard[20]研究发现，泌乳早期SCC越低，泌乳后期患乳腺炎风险越低。以上研究结果与本研究结果基本一致。荷斯坦牛产后60 d SCC>50万个·mL-1即患SCM[4-5]，随着产后前60 d患SCM次数的增加，白细胞从血液中进入乳腺的数目增多，乳腺泡的功能受到影响，炎区释放的介质导致微血管内皮损伤、舒缩功能紊乱和通透性升高[21-23]，对之后泌乳期奶牛的泌乳性能造成一定影响，从而导致产后前60 d患SCM的奶牛各泌乳月SCC均高于不患SCM的奶牛。此外，随着奶牛胎次的增加，乳房组织因挤奶造成的损伤增多，接触病原微生物的概率升高，由此增加了细菌黏附于机体的机会，从而使产后前60 d患SCM的概率增高。
3.2 荷斯坦牛产后前60 d患SCM次数对不同牧场规模各泌乳月SCS的影响本研究发现，荷斯坦牛产后前60 d患SCM次数对全期平均SCS和不同牧场规模各泌乳月SCS均有极显著影响，不同牧场规模间全期平均SCS有极显著差异，且规模在5 000头以上的牧场，患1次SCM和不患SCM的奶牛在泌乳中后期SCS差距逐渐缩小。KUČEVIĆ等[24]和JEŹ 等[25]研究表明，不同牧场规模对奶牛SCS有显著影响。结合本试验中12个牧场的实际情况，规模在5 000头以上的牧场中设备机械化程度高，较之其他规模的牧场具有更完善的饲养管理措施，牧场环境和奶牛自身抵抗力优于小型牧场，因此奶牛产后前60 d患1次SCM后由于及时检测和预防，在泌乳中后期SCS逐渐恢复；对于中小型牧场，奶牛在产后前60 d患SCM后对泌乳中后期影响较大。
3.3 荷斯坦牛产后前60 d患SCM次数对不同测定季节和产犊季节各泌乳月SCS的影响唐程等[26]研究表明，夏季产犊的荷斯坦牛SCC高于其他季节，患SCM风险高于其他季节。Riekerink等[27]研究表明，夏季荷斯坦牛SCS高于其他季节。以上研究结果与本研究结果基本一致。本研究中，产犊季节对荷斯坦牛全期平均SCS有极显著影响，且荷斯坦牛产犊多集中在秋季和冬季，其产后前60 d患不同SCM次数对不同测定季节和产犊季节各泌乳月SCS均有极显著影响。夏季奶牛受热应激影响降低了奶牛干物质采食量和脂肪组织动员能力，并通过改变脂质代谢和激素信号通路促进了葡萄糖的利用，依赖葡萄糖作为周围组织的能量来源[28-31]，从而使维持需求增加，免疫机能受到抑制，感染病原微生物的几率增加，乳中SCC升高[32]。此外，热应激情况下会导致奶牛乳腺上皮细胞损伤[33]和各项生理机能紊乱[34]，体液免疫和细胞免疫遭到抑制[35]，因此，夏季产犊产后前60 d易患SCM。秋季产犊避开了夏季高温，且产后前60 d所处的天气较适宜，有利于奶牛泌乳潜能的发挥，患SCM风险降低。冬季产犊易受冷应激影响，冷应激下奶牛机体为保持体温恒定，维持能量增加20%~30%，免疫功能也会遭到抑制，造成奶牛生产性能下降，产奶量降低，SCC骤然升高[36]，产后前60 d患多次SCM风险增高。因此，合理控制奶牛的配种时间，尽量避免奶牛在夏季产犊，同时做好冬季产犊牛群的保温工作，降低冷、热应激对泌乳牛群的不利影响，有利于牛群泌乳性能的提高和SCM的防控。
3.4 荷斯坦牛产后前60 d SCS与各泌乳月SCS的相关性本研究发现，荷斯坦牛产后前60 d SCS与各泌乳月SCS极显著正相关。陈振亮等[11]研究发现，泌乳早期SCS的遗传力相对较高，说明对泌乳早期SCS进行选择的效率相对较高；竹磊等[13]研究发现，泌乳早期SCS与不同泌乳阶段SCS显著相关；毛永江等[37]研究表明，患SCM的奶牛在下一泌乳月SCC增加的可能性较大。此外，经分析发现，头胎牛产后前60 d SCS与第3~7泌乳月SCS相关系数低于其他胎次，本研究所得结果对于生产的指导意义相对较低；而4胎牛在第3~5泌乳月SCS与产后前60 d SCS的相关系数均大于0.40，秋季产犊的荷斯坦牛产后前60 d SCS与第3~5泌乳月SCS相关系数均大于0.43，对于牧场生产的指导意义相对较大。对于产后前60 d患SCM的奶牛，由于炎症区域释放过多炎性因子导致微血管内皮损伤、舒缩功能紊乱和通透性升高[38]，从而使全泌乳期患SCM的概率增加。另外，随着泌乳月的增加，产后前60 d SCS与各泌乳月SCS的相关系数逐渐下降。相关研究表明，不同泌乳阶段奶牛血清营养状况指标和生理状态有显著差异[30]，其中，泌乳前期和中期维生素E含量最高，之后逐渐下降。维生素E不仅可以反映奶牛机体的营养水平，也可以维持机体氧化剂/抗氧化剂的平衡，与奶牛SCC显著相关[39-40]。此外，随着泌乳月的增加，奶牛机体生理状态变化较大，从而使生理机能与产后前60 d的差异逐渐增加，可能导致产后前60 d SCS与各泌乳月SCS的相关系数逐渐下降。其他方面的原因有待进一步深入研究。
4 结论荷斯坦牛产后前60 d患SCM次数对不同胎次、牧场规模、测定季节和产犊季节各泌乳月SCS均有极显著影响(P < 0.01)。其中，5胎及以上牛产后前60 d患SCM的比例最高，1胎牛产后前60 d患SCM的比例最低；中小型牧场荷斯坦牛在产后前60 d患1次SCM的各泌乳月SCS极显著高于不患SCM的奶牛；夏季产犊产后前60 d患SCM的比例最高；夏、秋季节产犊的荷斯坦牛各泌乳月SCS随产后前60 d患SCM次数的增加极显著增加；荷斯坦牛产后前60 d SCS与各泌乳月SCS均呈极显著正相关，但相关系数随泌乳月的增加逐渐减小。该结果为指导牧场根据奶牛产后前60 d患SCM次数对泌乳中后期SCS的预测奠定了基础，为指导牧场及时采取相关措施进行隐性乳房炎防控提供了理论依据。
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