近年来，动物传染病一直是影响养殖业生产的重要原因，如口蹄疫、新城疫(Newcastle disease, ND)、布鲁氏菌病、结核病、猪瘟等，给公共卫生安全和养殖业发展带来了极大的威胁[1-2]。ND作为全球流行动物传染病之一，是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病[3-4]，具有病死率高、发病急、病情重等特点，严重危害动物健康，因此受到学者们的高度重视。
为预防、控制ND的发生和流行，使用疫苗接种是现阶段最安全且高效的免疫预防手段。尽管ND疫苗在国内已得到广泛使用，该病仍时有发生，究其原因，除了免疫程序和方法执行不到位之外，还包括NDV毒力和免疫原性的变异等因素[5]。研究表明，免疫佐剂常与疫苗配合使用，可以提高抗原的免疫原性，加速诱导免疫反应应答[6-8]，此外，还可降低对疫苗接种反应差的畜禽的疫苗剂量和生产成本。在众多免疫佐剂中，铝盐使用广泛，然而，铝佐剂不能刺激足够的抗原免疫，对Th1辅助细胞和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte, CTL)所介导的细胞免疫无增强作用，也无法很好地诱导黏膜免疫[9]。同时，随着铝佐剂的积累，肾功能、大脑以及骨组织也大受影响，会导致神经综合征和痴呆[10]，而以油基佐剂配制的油乳灭活苗和减毒活疫苗也存在局部注射部位反应的问题[11-12]，油佐剂越粘稠越不利于注射。尽管通常情况下矿物油基佐剂与兽用疫苗一起使用能够提高效果，却往往伴随着严重的副作用，如局部肉芽肿、脓肿或发烧[13]。相比前二者，中药多糖(polysaccharide)作为佐剂，无论是对特异性免疫还是非特异性免疫都有增强作用，同时，在安全性上由于天然多糖自身固有的高相容、无残留、低毒性等特点，克服了铝佐剂与油佐剂对机体产生不良反应的缺陷[14]。因此，中药多糖作为免疫佐剂备受关注，且逐渐成为疫苗佐剂的发展趋势，在疫苗领域拥有巨大的潜力[15]。
余甘子(Phyllanthus emblica Linn.)为大戟科、叶下珠属木本植物。现代药理学研究表明，余甘子含有维生素、黄酮、皂苷、多酚及多糖等活性成分，具有抗氧化、降血糖、增强免疫、抗病毒、抗菌等作用[16-18]。多糖作为余甘子的主要成分之一，在抗氧化[19]和降血糖[20]方面都具有良好的治疗作用，但有关余甘子多糖(Phyllanthus emblica polysaccharide, PEP) 的结构表征及其免疫活性的报道较少，极大限制了PEP的深度开发及利用。因此，本试验从余甘子中制备PEP，通过UV、FT-IR、SEM和HPLC对PEP的结构进行分析，并以特异性抗体、INF-γ和IL-4的水平、脾淋巴细胞刺激指数、T淋巴细胞CD4+/CD8+的比值、免疫器官组织学观察以及免疫器官指数为指标，探讨PEP对ND疫苗免疫效果的影响，为后续PEP的开发和利用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料余甘子购自福州晴百旺生物科技有限公司；雏鸡饲料购自正大集团饲料厂；ND疫苗购自哈药集团生物疫苗有限公司(201903)；冰醋酸购自国药集团(20180315)；DEAE-52纤维素(4057-050)购自英国Whatman公司；大孔吸附树脂(D101)、PBS(P1000)、红细胞裂解液(R1010)、鸡外周血淋巴细胞分离液(P8740)均购自北京索莱宝科技有限公司；NDV抗体检测试剂盒(JC76438)、鸡血清IL-4检测试剂盒(JC74228)、鸡血清INF-γ检测试剂盒(JC74118)购自上海酶联生物科技有限公司；Anti-Chicken CD8α-PE(8220-09)、Anti-Chicken CD4-FITC(8210-02)购自美国SouthernBiotech公司。
1.2 试验动物选取175只未经免疫的1日龄健康河田鸡，购自福建省长汀河田种鸡场。
1.3 仪器设备RE-52CS旋转蒸发仪购自上海亚荣生化仪器厂；Alphal-2LDplus型真空冷冻干燥机购自德国Christ公司；IMP180恒温箱和EVOS FLc倒置荧光显微镜购自美国Thermo公司；Allegra X-22R高速离心机购自美国Beckman公司；V-1200型可见分光光度计购自上海美谱达仪器有限公司；Milli-Q Direct 8/16超纯水机购自美国Merck Millipore公司；Infinite M200pro酶标检测仪购自瑞士Tecan公司；1400301S高压蒸汽灭菌锅购自Tomy Digital Biology公司；NovoCyteTM流式细胞仪购自美国ACEA公司；HH-2数显恒温水浴锅购自国华电器有限公司；S-4000场发射扫描电子显微镜购自荷兰Philips公司。
1.4 余甘子多糖的制备采用水提醇沉法[21]提取PEP，将脱水去核的余甘子洗净，烘干后经超微粉碎机粉碎成粉末，在100 ℃下用95%乙醇浸煮1 h，共3次。将浸煮后的余甘子粉末用纱布过滤、拧干后放入托盘烘干，加入双蒸水在100 ℃下回流提取2 h，共3次。收集水提液离心除去多余杂质，用旋转蒸发仪在50 ℃下减压浓缩至原体积的三分之一，加入3倍体积的95%乙醇，于4 ℃静置2 d后，弃上清，将沉淀物烘干、干燥、冷冻，即得余甘子粗多糖。采用Sevage法除去余甘子粗多糖中的蛋白质，重复3次，经减压、浓缩、醇沉、离心后，收集沉淀，冷冻、干燥后即得除蛋白后的余甘子粗多糖。采用大孔吸附树脂、DEAE-52阴离子交换层析柱进一步分离纯化后得到PEP。
1.5 余甘子多糖糖含量的测定采用苯酚-硫酸法测定干燥后PEP的糖含量。按5个梯度取0~1.2 mL葡萄糖标准品溶液(1 g·L-1) 加入干燥试管中，补齐双蒸水至2 mL，再加入1 mL苯酚溶液(5%)，充分震荡后顺试管壁加入5 mL浓硫酸，震荡混匀，沸水水浴加热10 min。自然冷却至室温，用酶标仪检测每管在490 nm处的OD值，将葡萄糖标准品的浓度作为横坐标，将OD490 nm值作为纵坐标绘制标准曲线。配制1 g·L-1多糖溶液，同上述步骤操作后，在490 nm处测定其OD值，最后根据葡萄糖标准曲线方程求出样品的浓度，并根据公式计算样品的糖含量，糖含量= m1/m2×100%，其中，m1为样品糖含量(mg)，m2为样品总质量(mg)。
1.6 多糖的结构鉴定1.6.1 紫外光谱 用双蒸水配制5 g·L-1的PEP溶液，以双蒸水为空白，在200~800 nm范围内使用紫外分光光度计测定PEP的紫外吸收光谱。
1.6.2 红外光谱 称取适量干燥的PEP，以1∶100的比例加入KBr粉末，在玛瑙研钵中一起研磨均匀，压片机压成薄片后，用红外光谱仪进行扫描，检测范围为4 000~500 cm-1，并记录红外光谱。
1.6.3 单糖组成分析 称取PEP加入H2SO4水解，用NaOH调水解后的溶液pH至7，用双蒸水稀释配成多糖衍生化溶液，取多糖衍生化溶液、混合标准品溶液以及单糖标准品溶液加入甲醇溶液和NaOH溶液，混匀后在70 ℃水浴条件下反应30 min，冷却至室温后加入盐酸中和，再用氯仿萃取溶液，5 000 r·min-1离心5 min，取上清液，重复3次萃取过程后经0.22 μm微孔滤膜过滤后待HPLC分析单糖组成。
1.6.4 扫描电镜 用小药匙取微量冻干后的PEP样品，粘着于带有导电胶带的金属台上，用离子溅射仪对样品镀上导电金粉，使用扫描电镜在5.0 kv的加速电压下对PEP的微观结构进行观察，并采集微观图像。
1.7 试验动物分组与处理将175只1日龄健康河田鸡随机分成5组，每组35只，分别为：空白对照组，疫苗对照组，PEP低剂量(PEP low-dose, PEP-L)组、PEP中剂量(PEP medium-dose, PEP-M)组、PEP高剂量(PEP high-dose, PEP-H)组。饲料营养价值满足雏鸡生长需要，早晚各饲喂一次，自由饮水。除空白对照组外均用ND疫苗进行免疫，每只0.5 mL，7日龄首免，并于28日龄二免。在首免和二免日，3个多糖试验组分别按照10、20、30 g·L-1的剂量进行给药，疫苗对照组和空白对照组给予等量的生理盐水，每日1次，连续3 d。
1.8 样品采集与处理1.8.1 NDV特异性抗体水平检测 各组分别在7、14、21、28、35、42和49日龄时，每组随机选取5只河田鸡，心脏采血，待血液凝固析出血清后，分离出血清，5 000 r·min-1离心5 min后取上清，将NDV特异性抗体ELISA检测试剂盒从4 ℃取出后回温至室温((25±2)℃)，在包被板中按顺序加入50 μL倍比稀释的标准品，其余孔加入10 μL各组血清样品，补齐样品稀释液至50 μL，同时另设空白孔(不加任何液体)，放置细胞培养箱(37 ℃，5% CO2)孵育30 min。各孔加入300 μL洗液，静置20 s，甩干，并在吸水纸上拍干多余水分，重复上述操作5次。除空白孔外，各孔加入50 μL酶标试剂，37 ℃孵育30 min。重复洗板5次，各孔依次加入50 μL显色液A和50 μL显色液B，轻轻摇晃振荡混匀，放置细胞培养箱(37 ℃，5% CO2) 孵育10 min。各孔加入50 μL终止液，轻轻摇晃振荡10 s。放入酶标仪，450 nm波长处测定各孔OD值(空白孔调零)。依照标准孔OD值，绘制标准曲线，求出回归方程，将各孔OD值带入回归方程，计算NDV特异性抗体水平。
1.8.2 IL-4和INF-γ水平检测 各组分别在7、14、21、28、35、42和49日龄时，每组随机选取5只河田鸡，心脏采血，待血液凝固析出血清后，分离出血清，5 000 r·min-1离心5 min后取上清，分别将鸡IL-4 ELISA检测试剂盒和INF-γ ELISA检测试剂盒从4 ℃取出后回温至室温((25±2)℃)再使用，同“1.8.1”的ELISA步骤测定IL-4和INF-γ的水平。
1.8.3 PEP对外周血T淋巴细胞CD4+/CD8+的影响 于21日龄和49日龄时，每组随机选取5只河田鸡，心脏采抗凝全血1 mL，用等体积的全血及组织稀释液稀释全血。在离心管中加入适量分离液，将稀释后的血液平铺到分离液液面上方。离心后出现明显分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为淋巴细胞层。吸取淋巴细胞于离心管中，加入10 mL PBS溶液，离心后弃上清，加入5 mL PBS溶液离心后弃上清，重复2次，细胞重悬备用，即得外周血淋巴细胞。将提取的细胞调整为5×106 cell·mL-1，分别加入Anti-Chicken CD4-FITC 5 μL、Anti-Chicken CD8-PE标记的单克隆抗体2 μL，4 ℃避光30 min，再用含1%胎牛血清的PBS溶液洗涤细胞3次，加入0.5 mL PBS重悬。应用流式细胞仪检测外周抗凝全血中CD4+T细胞和CD8+T细胞含量，即可测定PEP对外周血T淋巴细胞CD4+/CD8+的影响。
1.8.4 免疫器官处理1.8.4.1 MTT法测定鸡脾淋巴细胞的增殖 于21日龄和49日龄时，每组随机选取5只河田鸡，放血处死后取出脾，去除周围多余组织并使用生理盐水洗净，用滤纸将表面水分吸干后于无菌超净台操作，置于研钵研磨充分后加入PBS溶液混匀，经200目过滤网筛过滤收集滤液于离心管中，1 500 r·min-1离心5 min后弃上清，加入2 mL红细胞裂解液37 ℃下裂解5 min，加入5 mL PBS溶液终止裂解，1 500 r·min-1离心5 min后弃上清，加入1640完全培养液(含10%胎牛血清，1%双抗)重悬，调整细胞浓度为5×106 cell·mL-1接种于96孔板，每孔100 μL，每个样品设3个重复孔，置于细胞培养箱(37 ℃，5% CO2)培养，44 h后各孔加入10 μL MTT(5 g·L-1)置于细胞培养箱(37 ℃，5% CO2)培养，4 h后，2 500 r·min-1离心10 min，分离上清液，避免孔内结晶掉落，倒扣在吸水纸上吸干多余液体，各孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，将96孔板置于微孔板振荡器上振荡10 min，保证孔内结晶充分溶解。使用酶标液在570 nm波长处检测其OD值，并根据公式计算鸡脾淋巴细胞的刺激指数(stimulation index, SI), SI=药物刺激孔OD值/空白对照孔OD值。
1.8.4.2 免疫器官指数 每组随机取5只49日龄鸡的脾、胸腺、法氏囊和肝，用滤纸吸干表面多余水分，置于电子天平中称重记录，并按公式计算免疫器官指数，免疫器官指数=免疫器官重量(g)/体重(g)×100%。
1.8.4.3 免疫器官组织病理学观察 每组随机取5只49日龄鸡的脾、胸腺、法氏囊和肝，分别固定在4%甲醛溶液中。通过苏木精-伊红染色法(HE)染色进行脾组织、胸腺、法氏囊和肝组织的病理学分析，并使用光学显微镜获得显微图像。
1.9 数据处理结果用“平均数±标准差”表示，应用SPSS 22.0进行ANOVA方差分析，同时采用Duncan’s法多重比较分析差异显著性。P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 余甘子多糖的分离纯化余甘子经热水浸提、醇沉后得到余甘子粗多糖，呈深棕色粉末状，得率为(55.10±0.40)%；通过Sevage法脱蛋白后得到除蛋白粗多糖，呈深灰色粉末状，得率为(30.43±2.18)%；经DEAE-52层析柱分离后，洗脱曲线如图 1所示，可见一个明显的单一对称峰，表明分离后的多糖成分较均一，因此，PEP的出峰时间主要在175~250 min内，合并175~ 250 min内收集管的溶液，经冷冻干燥后得到纯化后的PEP，呈白色棉絮状，得率(7.43±0.50)%。
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图 1 PEP在DEAE-52离子交换柱色谱的洗脱曲线 Fig. 1 Elution curve of PEP on DEAE-52 cellulose column |
葡萄糖的标准曲线如图 2所示，回归方程为y=1.479 3x-0.007 4，R2=0.998 8，表明浓度与其OD值呈良好线性关系，根据计算得到PEP的糖含量为(86.70±1.05)%。
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图 2 葡萄糖的标准曲线 Fig. 2 Standard curve of glucose |
2.3.1 紫外光谱分析 如图 3所示，PEP在280 nm波长处无吸收峰，表明PEP中蛋白含量低。
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图 3 PEP的紫外光谱图 Fig. 3 UV spectrum of PEP |
2.3.2 红外光谱分析 如图 4所示，3 357.52 cm-1波长处有O-H的强烈伸缩振动吸收峰，2 927.94 cm-1处有C-H的伸缩振动峰，这两种吸收峰均为多糖化合物的特征吸收峰。在1 576.07 cm-1处有一吸收峰，代表多糖官能团中O-H键的伸缩振动。其中1 418.89 cm-1的吸收峰为C=O的伸缩振动或者具有结晶水的结构，在1 073.21 cm-1波长的吸收峰代表C-O-C和C-O-H的伸缩振动，887.11 cm-1处的吸收峰表明可能含有α型的糖苷键。
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图 4 PEP的红外光谱图 Fig. 4 FT-IR spectrum of PEP |
2.3.3 单糖组成分析 如表 1所示，PEP由葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖和岩藻糖4种单糖组成，其中，以葡萄糖含量最多，岩藻糖含量最少。根据结果计算出PEP的单糖组成摩尔比为：GlcA∶Glu∶Xyl∶Fuc=0.5∶8.3∶1.8∶0.3。
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表 1 余甘子多糖的单糖组成 Table 1 Monosaccharide composition of PEP |
2.3.4 扫描电镜分析 如图 5所示，PEP的结构较为规整，呈片状分布且表面可见明显多糖粒子，多糖粒子总体结构致密。
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图 5 PEP的扫描电镜图 Fig. 5 SEM image of PEP |
PEP在不同日龄下对NDV特异性抗体的影响如图 6所示。与疫苗对照组相比，PEP-M组和PEP-H组均显著提高血清NDV特异性抗体水平(P < 0.05)，而PEP-L组可提高血清NDV特异性抗体水平，但差异不显著(P>0.05)。由此可见，PEP作为ND疫苗免疫佐剂可以在一定程度上增加特异性抗体，具有剂量依赖性。
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数据以“平均值±标准差”表示。柱上不同字母表示差异显著(P < 0.05)，相同字母之间表示差异不显著(P>0.05)。下同 Data are expressed as "Mean±S.E.". Bars labelled with different letters are significantly different among groups (P < 0.05), while same letter means no significant difference (P>0.05). The same as below 图 6 PEP对不同日龄鸡NDV特异性抗体水平的影响 Fig. 6 The effect of PEP on specific antibody of NDV in chickens at different ages |
PEP在不同日龄下对IL-4水平的影响如图 7所示。与空白组和疫苗对照组相比，3个多糖试验组的IL-4浓度均显著增高(P < 0.05)。除35日龄外，PEP-H组的IL-4浓度均显著高于PEP-M组(P < 0.05)。由此可见，PEP作为ND疫苗免疫佐剂可以在一定程度上增加IL-4的分泌水平且有剂量依赖性。
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图 7 PEP对不同日龄鸡IL-4水平的影响 Fig. 7 Effect of PEP on concentration of IL-4 in chickens at different ages |
PEP在不同日龄下对INF-γ水平的影响如图 8所示。与空白组和疫苗对照组相比，3个多糖试验组的INF-γ浓度均显著增高(P < 0.05)。与PEP-L组相比，PEP-M组和PEP-H组的INF-γ浓度显著升高(P < 0.05)。由此可见，PEP作为ND疫苗免疫佐剂可以在一定程度上增加INF-γ的分泌水平。
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图 8 PEP对不同日龄鸡INF-γ水平的影响 Fig. 8 Effect of PEP on concentration of INF-γ in chickens at different ages |
PEP在28和49日龄对外周血T淋巴细胞CD4+/CD8+比值的影响如图 9和图 10所示。除28日龄PEP-M组外，多糖试验组的CD4+/CD8+比值均显著高于空白组和疫苗对照组(P < 0.05)。28日龄时，PEP-L组与PEP-M组差异不显著(P < 0.05)，49日龄时呈现随着剂量增加而上升的趋势。
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图 9 PEP对鸡外周血T淋巴细胞CD4+/CD8+的影响 Fig. 9 Effects of PEP on CD4+/CD8+ of chicken peripheral blood T lymphocytes |
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a.空白组；b.疫苗对照组；c.PEP-L组；d.PEP-M组；e.PEP-H组 a.Blank group; b.Vaccine control group; c.PEP-L group; d.PEP-M group; e.PEP-H group 图 10 PEP对鸡外周血T淋巴细胞CD4+、CD8+的影响 Fig. 10 Effects of PEP on CD4+ and CD8+ of T lymphocytes in peripheral blood of chicken |
2.8.1 脾T淋巴细胞增殖 PEP在28和49日龄对T淋巴细胞增殖的影响如图 11所示。28和49日龄时，PEP-M组和PEP-H组的脾T淋巴细胞刺激指数均显著高于疫苗对照组和空白组(P < 0.05)，表明PEP能够促进脾T淋巴细胞的增殖，且增殖效果与浓度呈现明显的量效关系。
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图 11 PEP对鸡脾T淋巴细胞刺激指数的影响 Fig. 11 Effect of PEP on SI of T lymphocyte proliferation in chicken spleen |
2.8.2 脾B淋巴细胞增殖 PEP在28和49日龄对B淋巴细胞增殖的影响如图 12所示。28和49日龄时，PEP-M组和PEP-H组的脾B淋巴细胞刺激指数均显著高于疫苗对照组和空白组(P < 0.05)，表明PEP能够促进脾B淋巴细胞的增殖，且增殖效果与浓度呈现明显的量效关系。
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图 12 PEP对鸡脾B淋巴细胞刺激指数的影响 Fig. 12 Effect of PEP on SI of B lymphocyte proliferation in chicken spleen |
在49日龄时，PEP对鸡脾脏、胸腺、法氏囊和肝脏器官指数的影响如图 13所示。3个多糖试验组免疫器官指数显著高于空白组和疫苗对照组(P < 0.05)，免疫器官指数随着药物组浓度升高而上升，说明PEP作为免疫佐剂能提升鸡的免疫器官指数。
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图 13 49日龄鸡免疫器官指数 Fig. 13 Immune organ index of 49-day-old chicken |
于49日龄进行脾、法氏囊、胸腺和肝的组织学分析，并在200倍放大倍数下拍摄显微图像(图 14)。与空白组和疫苗对照组相比，脾切片中，PEP-M组和PEP-H组脾小结数量增多且面积增大；法氏囊切片中，3个剂量多糖组法氏囊小结髓质密度均增加；胸腺切片中，PEP-H组胸腺小体数量增多，淋巴小结生发中心密度增加；肝切片中，肝细胞排列更加紧密整齐呈条索状，弥散淋巴组织和肝血窦增多。以上结果表明，PEP可以促进脾、法氏囊、胸腺和肝的免疫功能。
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图 14 PEP对脾、法氏囊、胸腺和肝影响的组织病理学分析(200×) Fig. 14 Histopathological analysis of the effects of PEP on the spleen, bursa, thymus and liver (200×) |
采用水提醇沉法提取余甘子粗多糖，通过DEAE-52纤维素柱层析法进行分离纯化，得到的PEP糖含量为(86.70±1.05)%。研究表明，多糖的结构与其生物活性具有密切关系，因此，本试验对PEP的结构进行了初步分析。UV结果显示，PEP在280 nm波长处均无明显的吸收峰，表明PEP中的蛋白质含量较低。FT-IR结果显示，PEP含有多糖化合物的特征吸收峰，证明PEP为多糖类物质，与PEP的理化性质研究结果一致。单糖组成结果显示，PEP由GlcA、Glu、Xyl和Fuc组成，摩尔比为0.5∶8.3∶1.8∶0.3，PEP包含多种不同单糖而具有不同程度的主干以及分支结构。SEM可观察材料表面形貌，显示PEP的结构较为规整，呈片状分布且表面可见多糖粒子，多糖总体结构致密，与机体接触面积较大。
3.2 余甘子多糖增强免疫活性分析抗体是B细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白，主要存在于血清等体液中介导体液免疫，能与相应抗原特异性结合，作为免疫调控因子发挥作用[22]。研究表明，中药多糖类物质可提高雏鸡NDV的特异性抗体水平[23-24]。刘宽辉等[25]研究发现，硒化党参多糖和大蒜多糖可协同提高ND疫苗的血清抗体效价，增强免疫活性。因此，NDV特异性抗体水平可反映疫苗的使用效价，同时还能反映出动物机体体液免疫强度。在本研究中，与空白组和疫苗对照组相比较，PEP-M组和PEP-H组的血清NDV特异性抗体水平均提高，且呈现剂量依赖关系，表明PEP作为ND疫苗免疫佐剂能提高其体液免疫水平。此外，PEP发挥免疫增强作用的持续时间较长。以上结果证明PEP可以作为免疫佐剂，能长期、持续提高雏鸡血清NDV特异性抗体水平。
活化的免疫细胞可以分泌一些在免疫应答中起重要作用的蛋白质或小分子多肽，称为细胞因子。细胞因子主要有白介素(interleukin, IL)以及干扰素(interferon, IFN)等。IL-4可促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖，还可以协同集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF)诱导血细胞的增殖[26]。IFN-γ作为Ⅱ型干扰素，来源于T细胞具有免疫调节活性，能够增强自然杀伤细胞和杀伤细胞的活性，还可以增强巨噬细胞的细胞毒性，调节免疫的自身稳定功能[27]。研究表明，中药多糖能不同程度地促进细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ等的分泌，可作为免疫佐剂增强对口蹄疫疫苗[28]、圆环病毒疫苗[29]和ND疫苗[30]的免疫效果。本研究发现，PEP能提高IL-4和IFN-γ的分泌水平，且存在剂量依赖性，表明PEP能有效提高机体细胞因子的分泌水平。
T淋巴细胞作为免疫细胞群，可通过受体识别并结合MHCⅠ类或MHCⅡ类分子相关的抗原，并分别表达CD4+和CD8+分子对抗入侵病毒[31]，可见T淋巴细胞的分化出的亚群和机体免疫高度相关。CD4+T淋巴细胞诱导和增强机体免疫应答，反应机体免疫力，不仅可以使浸润肿瘤的效应T细胞数目增加，还能增强杀伤力，在数量、质量两方面都有提高，在维持小鼠的免疫记忆方面也有着重要作用[32-33]。已有研究表明，灰树花多糖可使Th2细胞向Th1细胞转化，使CD4+/CD8+T细胞比值降低[34]。本试验结果显示，PEP作用于雏鸡后，外周血中CD4+/CD8+值高于疫苗对照组，这表明PEP能够提高CD4+T淋巴细胞的数量，同时可强化对B细胞的增殖、分化和成熟的诱导，进而增强雏鸡对NDV疫苗的特异性免疫应答以及抗体的产生。
3.3 余甘子多糖对免疫器官的影响脾、法氏囊、胸腺和肝都是鸡体内重要的免疫器官，免疫器官指数反映其发育程度，进而体现动物机体免疫功能的强弱[35]。ND可导致鸡各组织器官出现广泛性病变，尤其以免疫器官病变最为明显，可见胸腺小叶皮质区出血、髓质区可见较多出血灶或视野可见血浆渗出物；脾淋巴细胞变性坏死、数量极度减少、髓质部有不同程度的充血和淤血；法氏囊滤泡内淋巴细胞、网状细胞严重变性坏死，数量减少，间质小血管出现扩张或充血[36]。因此，选取胸腺、法氏囊、脾和肝的发育情况来衡量鸡免疫功能的强弱。
脾是体内最大的免疫器官，由大量淋巴细胞组成[37]，是免疫反应的主要部位，侵入血内的病原体，如细菌、疟原虫、血吸虫等，可引起脾内发生免疫应答，脾的体积和结构也会发生变化。脾小结位于动脉周围淋巴鞘的一侧，主要由B细胞构成，当受到抗原刺激引起体液免疫应答时，脾小结数量增多，面积增大。本试验脾组织学切片可见，与空白组和疫苗对照组相比，PEP-M组和PEP-H组脾小结数量增多且面积增大。
法氏囊为家禽特有的中枢淋巴器官，是一个卵圆形的囊状器官，位于泄殖腔的背侧，其黏膜组织结构中的髓质由上皮性网状细胞、较幼稚的(大、中型)淋巴细胞和巨噬细胞组成。本试验法氏囊切片可见，与空白组和对照组相比，3个剂量多糖组法氏囊小结髓质密度均增加。
胸腺为中枢淋巴器官，具有培育和选择T细胞、分泌激素和细胞因子的功能。胸腺小体是一种特殊的胸腺上皮细胞结构，大小不一，散在分布于髓质内，由扁平胸腺上皮细胞呈同心圆状包绕而成，具有一定的免疫学作用和吞噬功能，参与胸腺细胞的增殖调节和细胞清除，尤其在胸腺树突状细胞介导中度到高度新合性自身反应性T细胞的次级阳性选择中，胸腺小体具有关键作用，可以诱导CD4+和CD25+调节性T细胞的产生[38]。淋巴小结生发中心主要由B细胞和Th细胞组成，还多见滤泡树突状细胞和巨噬细胞。本试验组织切片可见，与空白组和疫苗对照组相比，淋巴小结生发中心胸腺胸腺切片中PEP-H组胸腺小体数量增多，淋巴小结生发中心密度增加。
肝中含有大量免疫细胞，如枯否氏细胞、树突状细胞和淋巴细胞等，弥散淋巴组织呈弥散性分布，与周围组织无明显分界，只含T细胞，有的也含较多的B细胞，此外还有少量的浆细胞、巨噬细胞等。相邻肝细胞管之间的间隙为肝血窦，肝内淋巴组织较丰富，在小叶间结缔组织和肝小叶内常见弥散淋巴组织。本试验肝组织切片可见与空白组和疫苗对照组相比，肝细胞排列更加紧密整齐呈条索状，弥散淋巴组织和肝血窦增多，表明这些免疫器官的功能在PEP的作用下被激活。
以上结果表明，PEP可提高胸腺、脾、法氏囊和肝的器官指数，从而促进免疫器官的发育，与白灵菇多糖[39]和花粉多糖[40]对器官免疫指数的影响一致。
4 结论本试验从余甘子中获得糖含量较高且蛋白含量较低的PEP，由GlcA∶Glu∶Xyl∶Fuc组成(摩尔比为0.5∶8.3∶1.8∶0.3)，其表面呈片状分布且含有多糖粒子。将PEP与ND疫苗配合使用后发现，PEP能提高鸡NDV特异性抗体、INF-γ和IL-4的分泌水平，促进鸡外周血淋巴细胞增殖，提高T淋巴细胞CD4+/CD8+比值和免疫器官指数，同时还能促进免疫器官的发育。PEP可作为免疫佐剂增强ND疫苗的免疫效果，为今后免疫佐剂的设计以及临床应用提供了理论基础。
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(编辑 范子娟)