近年来由于温室效应的产生导致全球气候变暖，我国多个地区极端气候频发。2019年作为继1951年来第5次高气温年份，导致全国大部分地区高温日较往年显著增多，北方地区全年气温上升明显[1]，据目前研究显示，我国高温灾害的发生仍持续增长，气温的居高不下导致多地出现干旱、降水量大幅度降低等现象，造成农作物受灾[2]。除此之外，持续的高温天气对我国畜牧业影响重大，不仅影响肉制品运输保存，当外界环境温度超过动物所承受上限时还会诱发各类畜禽热应激反应的发生。热应激反应的发生对动物的脑[3]、消化吸收[4-5]、免疫功能[6]、繁殖功能[7]、血液生理生化指标等都会产生不同程度的影响，严重的热应激反应还会导致动物死亡，造成巨大的经济损失。那么动物在不同程度热应激反应下又会有哪些具体的表现呢？热应激反应下动物机体又会产生哪些标志性的行为以及生理学变化呢？基于此，作者选择体况较为相近的雄性小鼠进行不同时长的热刺激，以其在旷场试验和高架十字迷宫试验模型中根据运动的时间、距离及体征性行为作为评价热应激反应的标志性行为，以血液中激素水平变化规律判断热刺激对小鼠的具体影响。本研究选择了旷场和高架十字迷宫两种试验模型及TM-Vision行为学试验视频分析系统，对小鼠在接受不同时长热刺激后自发运动行为的改变情况进行监测。旷场试验和高架十字迷宫都是国际公认的典型的应用于啮齿动物的焦虑测评装置[8]。其原理是利用小鼠的好奇和恐惧心理使小鼠产生焦虑情绪，从而发生探究-规避行为[9]。此次试验根据小鼠热刺激时长以及考虑小鼠自身承受承受能力，结合国内外热应激模型构建条件[10]，最终将热刺激温度定为34 ℃[11]。本试验旨在为热应激的初步诊断提供参考及理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物雄性SPF级ICR小鼠，8周龄，共40只，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。
1.2 试验试剂5-羟色胺(5-HT)检测试剂盒、皮质酮(CORT)检测试剂盒、促肾上皮质激素释放激素(CRH)检测试剂盒、多巴胺(DA)检测试剂盒、肾上腺素(EPI)检测试剂盒、去甲肾上腺素(NE)检测试剂盒均购自武汉优尔生商贸有限公司。
1.3 试验仪器与设备TM-Vision行为学试验视频分析系统、OFT-100旷场试验箱、PMT-100高架十字迷宫等(成都泰盟软件有限公司)、人工智能气候室(济南旭邦电子科技有限公司)、FM40-小型雪花制冰机(北京长流科学仪器有限公司)、SHP-250恒温培养箱(上海森信试验仪器有限公司)。
1.3.1 旷场试验装置 本试验应用的旷场试验装置为25宫格尺寸：625 mm(L)×740 mm(W)×510 mm(H)。主要观察指标：小鼠在各区域运动、静止的距离和时间。
1.3.2 高架十字迷宫装置 本试验应用高架十字迷宫装置尺寸：各臂臂长300 mm，宽度60 mm，高架高度500 mm，开臂臂高6 mm，闭臂臂高150 mm。主要观察指标：小鼠在各区域运动距离、停留时间和进入各区域次数。
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图 1 旷场试验装置 Fig. 1 Open-field test device |
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图 2 高架十字迷宫装置 Fig. 2 Plus maze test device |
1.4.1 行为学测试 将ICR小鼠在人工智能气候室中进行为期一周的适应性喂养后，随机分为4组，每组10只，分别为对照组，热刺激2 h组；热刺激4 h组和热刺激6 h组。待小鼠适应环境后，进行同一温度下不同时长热刺激。热刺激6 h组于上午8：00开始刺激；热刺激4 h组于上午10：00开始刺激；热刺激2 h组于中午12：00开始刺激。刺激结束后，于下午14：00-17：00对小鼠进行旷场试验和高架十字迷宫试验。
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图 3 试验方案 Fig. 3 Test scheme |
TM-Vision行为学试验视频分析系统调试完毕后，将小鼠放入试验设备中央并保持小鼠背对试验人员。待小鼠适应环境后，开始记录小鼠在各区域运动、静止的距离和时间。所有的试验小鼠由同一试验人员放置，每只小鼠只进行一次试验，每次试验后彻底清除小鼠气味防止影响试验准确性[12]。
TM-Vision行为学试验视频分析系统调试完毕后，将小鼠放入试验设备中央并保持小鼠面对开放臂方向，避免小鼠喜欢暗处试验过程中错过开放臂区域。待小鼠适应环境后，开始记录小鼠在各区域运动距离、停留时间和进入各区域次数。所有的试验小鼠由同一试验人员放置，每只小鼠只进行一次试验，每次试验后彻底清除小鼠气味防止影响试验准确性[13-14]。
1.4.2 血液生理指标测试 待不同时长热刺激结束后，立即对小鼠进行麻醉，采集血液后将其处死。血液样本处理后利用试剂盒对小鼠血液生理指标进行检测，其操作遵照试剂盒说明书。
2 结果 2.1 旷场试验将旷场试验中小鼠自发运动的距离和时间作为评定不同时长热应激反应下小鼠自发运动的参数，并对其进行分析。图 4(彩图见OSID开放科学数据与内容，下同)显示了不同时长热刺激组小鼠在旷场中的活动轨迹，直观地展示出小鼠在各区域的运动状态，所列图片具有较好的普遍性和代表性。
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图 4 旷场试验小鼠运动轨迹(彩图见OSID开放科学数据) Fig. 4 Mouse activity trajectory map in Open Field Test (Please find the OSID data for the color figure) |
图 4显示与对照组相比，小鼠在进行热刺激2 h后在旷场中央区域活动轨迹明显增加；热刺激4 h后小鼠在边缘区域活动增加；热刺激6 h后小鼠在中央区域活动明显降低，在角落区域活动轨迹明显增加。
在对旷场试验分析后结果显示，小鼠在34 ℃热刺激2 h(P < 0.01)和4 h(P < 0.05)时移动时间显著增加(图 5A)；而移动距离虽也表现出升高的趋势，但无显著性差异(图 5B)；而静止时间则在刺激2 h(P < 0.01)、4 h(P < 0.05)后显著减少(图 5C)；小鼠在中心区域(图 5D)和边缘区域(图 5F)停留时间逐渐减少，且时间依赖性展现出在角落停留时间增多，但变化不显著(图 5E)。
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与对照组相比，*.P < 0.05; **.P < 0.01；NS.差异不显著。图 7同 Compared with control group, *.P < 0.05; **.P < 0.01; NS.The difference is insignificant. The same as Fig. 7 图 5 不同强度热刺激对小鼠探索行为影响 Fig. 5 Effects of thermal stimulation of different intensities on exploratory behavior in mice |
将高架十字迷宫试验中小鼠自发运动的距离、时间以及进入各区域的次数作为评定不同时长-热应激反应下小鼠自发运动的参数，并对其进行分析。
图 6显示了小鼠在经历不同时长热刺激后在高架十字迷宫中的活动轨迹，直观地展示出小鼠在各区域的运动状态，所列图片具有较好的普遍性和代表性。图 6显示，与对照组相比，小鼠在进行热刺激2 h后在高架十字迷宫开放臂和闭臂区域活动轨迹明显增多，热刺激4 h后，小鼠频繁停留于迷宫中心区域；热刺激6 h后，小鼠活动轨迹减少，并倾向于在闭臂区域活动。
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图 6 高架十字迷宫中小鼠运动轨迹(彩图见OSID开放科学数据) Fig. 6 Mouse activity trajectory map in Plus Maze Test (Please find the OSID data for the color figure) |
结果显示，小鼠在34 ℃热刺激下2 h(P < 0.05)时在中心区域(图 7A)、开放臂区域(图 7B)和闭合臂区域(图 7C)移动距离都显著增加；而小鼠在开放臂区域停留时间呈时间依赖性增加，在热刺激6 h(P < 0.01)时变化显著(图 7E)；小鼠进入中心区域(图 7H)和开放臂区域(图 7I)的次数变化呈现出先上升后下降的趋势，但无显著性，34 ℃热刺激下2 h(P < 0.01)时小鼠进入闭合臂区域的次数显著增加(图 7 J)。
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图 7 不同强度热刺激对小鼠探索行为的影响 Fig. 7 Effects of thermal stimulation of different intensities on exploratory behavior in mice |
对小鼠进行不同时长热刺激后，利用酶联免疫吸附试验对血液中5-HT、DA、EPI、CORT、NE和CRH生理指标进行检测，具体方法遵照试剂盒说明书进行。
结果显示，小鼠在34 ℃不同时长热刺激下5-HT和DA无显著变化(图 8A、B)；小鼠在热刺激2 h (P < 0.000 1)开始，血液中EPI、CORT含量极显著上升，并具有时间依赖性(图 8C~D)；小鼠在热刺激2 h(P < 0.000 1)后血液中NE含量极显著上升，热刺激4 h(P < 0.000 1)后达到峰值，但在热刺激6 h(P < 0.000 1) 后稍有回落趋势(图 8E)；小鼠在热刺激4 h(P < 0.001)时血液中CRH含量极显著上升；热刺激6 h(P < 0.05)后稍有回落趋势(图 8F)。
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与对照组相比，*.P < 0.05; ***.P < 0.001；****.P < 0.000 1; NS.差异不显著 Compared with control group, *.P < 0.05; ***.P < 0.001;****.P < 0.000 1; NS. The difference is insignificant 图 8 不同强度热刺激对小鼠血液生理指标影响 Fig. 8 The effects of heat stimulation with different intensities on blood physiological indexes in mice |
针刺[15]、足底电击[3]、束缚[16]、冷、热刺激[17-18]等均为构建分类小鼠应激模型的常用方法。本试验在对小鼠进行不同时长热刺激后，通过旷场及高架十字迷宫装置对小鼠行为学变化进行系统评估，结果表明，小鼠在热刺激2 h后探索行为和自发运动显著增加，而后伴随刺激的时间增长逐渐降低。
大量研究表明，小鼠发生应激后学习记忆力、认知能力、探索行为等都会发生变化。在王衍等的研究中显示慢性束缚应激过后小鼠记忆力受损[19]；急性强迫大鼠游泳应激后引发其焦虑恐惧心理导致行为呆滞[20]等，并且小鼠应激后情绪、自主活动[21-22]、修饰动作、排泄次数[23-24]等都会发生改变。以上的研究结果似乎都显示动物应激反应发生后机体功能会受到抑制。但是在本次试验中发现，与对照组相比，虽然在热刺激4、6 h后小鼠的运动时间、距离等指标均受到抑制，但这并不是全部变化。而数据中时间的变化趋势虽然没有运动距离变化明显，但仍具有一致性，作者考虑这可能是由于监测系统中分辨率对于动作监测过于灵敏的问题。
试验中, 作者还观察到小鼠在热刺激2 h后自主运动和探索行为有显著上升。通过查阅文献，作者了解到这种结果是合理的。内分泌学家Hans Selye很早就将应激分为良性应激和恶性应激，又可以称为生理性应激和病理性应激。良性应激对身体有利甚至可以激发潜能，而恶性应激对身体不利甚至会造成损伤。还有学者认为探索行为作为动物创新的一部分，属于一种积极主动的行为[25]，这也印证了小鼠探索行为的增加是应激对机体的正面作用。嵇志红等[26]对小鼠进行强迫游泳试验，发现慢性应激会增加小鼠空间、学习记忆能力，陈亚静[14]也在试验中得出急性应激可以显著增加小鼠的探索行为和学习记忆力，并且不同年龄小鼠存在差异的结果。作者猜测出现这样的结果是由于小鼠在低程度的刺激下形成了良性应激，小鼠的情绪、身体素质、学习能力等都得到了提升。其中不排除小鼠由于个体因素不受环境干扰或其他的个别情况。除此之外，试验中小鼠的性别[27]、年龄[28]、对新环境的适应程度[29]、进行试验的次数[30]等都会成为造成试验结果不一致的原因。
机体的应激反应主要由中枢神经系统进行调控，当机体受到外界刺激时，体内的交感-肾上腺髓质轴(SAM)和下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA)将会被激活，引起交感神经活动增加、儿茶酚胺类物质及糖皮质激素分泌增加从而维持机体内环境稳态。研究表明，机体发生热应激反应后，血液中CORT、CRH、EPI、NE水平将会有所变化。5-HT又称为血清素，与多巴胺同样作为存在于神经中枢中重要的神经递质[31]，具有调节机体情绪、血糖水平、免疫功能、心血管功能等重要作用。选择性5-HT再摄取抑制剂(SSRI)近年来也作为抗抑郁药物备受关注。
此次试验中发现，小鼠在接受不同时长热刺激后，5-HT和DA并没有发生显著变化，而CORT、CRH、EPI、NE水平都在热刺激后发生了显著上调，并且NE和CRH水平在热刺激6 h后稍有回落趋势，这与作者的行为学试验结果趋势相符。
以上结果提示，或许并不能单纯以急性应激和慢性应激将机体的应激反应进行简单的分类和探讨，因为应激的过程应该是存在阶段性变化的。通过对小鼠进行不同程度的冷刺激和复温试验发现，与对照组相比，小鼠在22 ℃冷刺激后探索行为增多，而伴随刺激温度的降低和时长的增加，小鼠自主运动和探索行为以及血液生理指标都呈现了先升后降的趋势[32-33]，这与本研究结果一致。
综上，本次通过高架十字迷宫试验和旷场试验对小鼠进行同一温度下不同时长热刺激后的行为进行监测，结合血液生理指标进行分析，最终发现小鼠在热应激反应发生后，自主运动和探索行为都发生了直观改变，并希望此次发现可以为动物热应激反应的临床诊断提供诊断基础。
4 结论34 ℃热刺激2 h对小鼠自发运动和探究行为有促进作用，引起焦虑减少。但长时间热刺激对小鼠自发运动和探究行为有抑制作用，导致焦虑样行为增加，并提示机体中枢神经系统调控可能是小鼠热刺激后情绪和行为异常的变化基础。
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(编辑 白永平)