2. 江西农业大学动物科技学院, 南昌 330045
2. College of Animal Science and Technology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China
油脂是家禽饲粮中的重要能量来源，可改善饲料适口性和一致性，提供必需脂肪酸并增加脂溶性维生素的吸收。但油脂在加工、贮存、运输和饲喂过程中，尤其在高温季节易发生氧化酸败[1]。动物饲养试验表明，摄入氧化油脂会引起一系列广泛的生物学效应，氧化油脂最显著的负作用之一是诱导氧化应激，这是由摄入的氧化油脂吸收的脂质过氧化氢和氧化脂肪诱导微粒体细胞色素P450酶产生的活性氧(ROS)引起的[2-4]。胃肠道是应激反应的靶器官，因此，极易受到各种应激因素的影响，造成肠黏膜绒毛部分断裂脱落，降低营养物质吸收功能，减弱肠道黏膜屏障功能，进而引起肠道细菌易位和内毒素侵入机体并引起其他组织器官功能变化或损伤[5-6]。大量研究表明，饲粮中的氧化酸败产物可通过多种途径损伤机体的正常生理功能，降低机体抗氧化功能和免疫力，引发肠道炎症，造成结构和功能破坏[7-9]。
补充外源性抗氧化剂有助于恢复氧化和抗氧化平衡[10]，葛根素是一种天然的异黄酮化合物，有报道称，葛根素具有较强的抗氧化活性并能发挥广泛的有益作用[11]，葛根素具有清除自由基、抑制促炎细胞因子、降低炎症基因、上调抗氧化酶、调节转录因子、增强核因子-E2相关因子2(Nrf2)信号通路的作用[12]。葛根素显著降低肺损伤模型大鼠肺组织转化生长因子-β1(TGF-β1)和血浆丙二醛(MDA)水平，并显著提高血浆超氧化物歧化酶(SOD)活性[13]。葛根素可逆转肺损伤小鼠肺泡和毛细血管基底膜厚度增加及II型肺泡上皮细胞微绒毛和嗜锇性板层小体数量减少[14]。然而，葛根素对饲喂氧化大豆油肉鸡肠道氧化损伤的保护作用却鲜有报道。本试验旨在探讨饲喂氧化大豆油对肉鸡小肠黏膜形态结构和抗氧化能力的影响及葛根素的调节作用，以期为葛根素在畜牧生产中的应用提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 氧化大豆油的制备氧化大豆油的制备参考Liang等[15]的方法。新鲜大豆油为市售精炼一级食用大豆油。新鲜大豆油在沸水浴中连续加热10 h，并且持续通入空气。分别在加热第4、7、9和10小时测定大豆油的过氧化值(POV)和丙二醛(MDA)的含量。当POV≥90 meq·kg-1时，氧化大豆油制备结束。油脂POV的测定方法参考GB/T 5538—2005，MDA含量的测定方法参考GB 5009.181—2016。
1.2 试验设计本试验采用2×2因子设计，因子包括大豆油和葛根素。大豆油按其品质分为新鲜大豆油(POV= 1.53 meq·kg-1，MDA =0.18 mg·kg-1) 和氧化大豆油(POV=(95±2) meq·kg-1，MDA = 26.41 mg·kg-1)。饲粮中葛根素添加量为0和750 mg·kg-1两个水平，本试验所用的葛根素购自杨凌慈缘生物科技有限公司，纯度为98.31%，批次号为CY190320。选取1日龄健康雌性中速型三黄鸡肉鸡360羽，随机分成4个处理组，每组6个重复，每个重复15羽。试验期56 d。4个处理组分别为新鲜大豆油饲粮组、新鲜大豆油+葛根素(750 mg·kg-1)饲粮组、氧化大豆油饲粮组和氧化大豆油+葛根素(750 mg·kg-1) 饲粮组。1~28日龄油脂添加量为2%，29~56日龄油脂添加量为3%。
1.3 试验饲粮与饲养管理本试验采用的基础饲粮为玉米-豆粕型饲粮，根据我国NT/T 33—2004《鸡饲养标准》推荐的营养水平，按1~28、29~56日龄两个阶段进行配制。饲粮组成及营养水平见表 1。试验鸡采用三层笼笼养。试验前对鸡舍进行充分冲洗和严格消毒，入雏前24 h将鸡舍升温至32~35 ℃，此后温度每周降低2~3 ℃，直至保持在22~24 ℃。采用连续光照、自然通风。试验期舍内光照、湿度和温度根据常规饲养管理要求进行控制，鸡只按正常免疫程序进行免疫。整个试验期鸡只自由采食和饮水。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) |
在28和56日龄时，每个重复随机选取1只鸡，取十二指肠、空肠、回肠中上段，用预冷的生理盐水冲洗掉内容物，浸没在10%福尔马林固定液中固定，用于肠黏膜形态结构分析。取十二指肠、空肠、回肠中下段用预冷的生理盐水冲洗干净内容物，放于冰盒上，用载玻片刮取黏膜，分装于冻存管中，置于-80 ℃保存备用，用于目的基因mRNA表达量和抗氧化指标测定。
1.5 测定指标及方法1.5.1 小肠黏膜形态结构的测定 将固定好的小肠组织样品经冲洗过夜、脱水、包埋、连续切片、摊片、苏木精-伊红染色和封片，得到的切片用Motic Images Advanced3.2测量其绒毛高度(VH)和隐窝深度(CD)并计算绒毛高度和隐窝深度比值(V/C)。
1.5.2 小肠黏膜occludin、claudin-1和ZO-1基因mRNA表达量的测定 采用TRIzol(北京全式金生物技术有限公司)法提取肠黏膜组织总RNA，用微量紫外分光光度计(NanoDrop ND-1000)测定RNA的浓度和纯度，将得到的RNA放入－80 ℃冰箱中保存备用。参照反转录试剂盒(EasyScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，北京全式金生物技术有限公司)说明书，对总RNA进行反转录合成cDNA，得到的cDNA置于－20 ℃冰箱中保存备用。利用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR反应。20 μL反应体系如下：Tip Green qPCR SuperMix 10 μL, Passive Referenec Dye (50×) 0.4 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，样品cDNA 2 μL，RNase-free水6.8 μL。引物序列见表 2，引物的碱基序列由华大基因有限公司合成。目的基因的mRNA相对表达量用2-△△Ct法分析，内参基因选用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。
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表 2 引物序列 Table 2 Primer sequences |
1.5.3 小肠黏膜抗氧化指标的测定 采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定小肠黏膜SOD活性、T-AOC、GSH-Px活性、过氧化氢酶(CAT)活性、GSH和MDA含量，检测方法严格按照试剂盒说明书进行。
1.6 统计分析采用Excel 2013对试验数据进行初步整理，用SPSS24.0软件中的Two-way ANOVA过程进行双因素方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较检验，结果以“平均值±标准误”表示，以P < 0.05为差异显著，0.05≤P < 0.10为有趋势。
2 结果 2.1 葛根素对饲喂氧化大豆油黄羽肉鸡小肠形态结构的影响由图 1可知，在28和56日龄时，相对于饲喂新鲜大豆油组，饲喂氧化大豆油不添加葛根素组肉鸡十二指肠、空肠和回肠绒毛均出现明显的断裂破碎损伤，而添加葛根素明显改善3个肠段的绒毛结构。
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A.新鲜大豆油不加葛根素组；B.新鲜大豆油+葛根素组；C.氧化大豆油不加葛根素组；D.氧化大豆油+葛根素组 A. Fresh soybean oil without puerarin group; B.Fresh soybean oil with puerarin group; C. Oxidized soybean oil without puerarin group; D. Oxidized soybean oil with puerarin group 图 1 葛根素对饲喂氧化大豆油肉鸡小肠黏膜形态结构的影响(40×) Fig. 1 Effect of soybean oil and puerarin on the intestinal morphology of broilers (40×) |
由表 3可知，与饲喂新鲜大豆油相比，饲喂氧化大豆油显著降低28日龄十二指肠的绒毛高度、V/C和回肠的V/C以及56日龄肉鸡十二指肠和空肠的绒毛高度和V/C(P < 0.05)，56日龄肉鸡空肠和回肠隐窝深度显著升高(P < 0.05)。饲粮中添加葛根素显著提高28日龄空肠绒毛高度、V/C和56日龄肉鸡3个肠段的V/C及空肠的绒毛高度(P < 0.05)，显著降低56日龄3个肠段的隐窝深度(P < 0.05)。氧化大豆油和葛根素对28日龄肉鸡十二指肠和回肠以及56日龄肉鸡空肠和回肠的隐窝深度和V/C，28日龄空肠的绒毛高度和V/C存在显著的交互作用(P < 0.05)。饲喂氧化大豆油使28日龄黄羽肉鸡空肠绒毛高度、V/C及十二指肠和回肠V/C，56日龄3个肠段的V/C显著降低(P < 0.05)，并使28日龄十二指肠和回肠的隐窝深度及56日龄3个肠段的隐窝深度显著升高(P < 0.05)，而饲粮中添加葛根素显著升高饲喂氧化大豆油28日龄黄羽肉鸡空肠绒毛高度、V/C及十二指肠和回肠V/C以及56日龄3个肠段的V/C(P < 0.05)，显著降低28日龄十二指肠和回肠及56日龄3个肠段的隐窝深度(P < 0.05)。
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表 3 葛根素对饲喂氧化大豆油肉鸡小肠形态的影响 Table 3 Effects of puerarin on the intestinal morphology of broilers fed oxidized soybean oil |
由表 4可知，与饲喂新鲜大豆油相比，饲喂氧化大豆油显著降低28日龄肉鸡回肠claudin-1 mRNA表达量(P < 0.05)，并有降低56日龄回肠occludin mRNA表达量的趋势(P=0.068)。饲粮中添加葛根素显著提高28日龄肉鸡回肠的ZO-1 mRNA表达量(P < 0.05), 并有提高28日龄空肠ZO-1(P=0.083)和56日龄回肠occludin(P=0.057)mRNA表达量的趋势。氧化大豆油和葛根素对28日龄和56日龄肉鸡小肠紧密连接蛋白mRNA表达量不存在显著的交互作用。
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表 4 葛根素对饲喂氧化大豆油肉鸡肠粘膜紧密连接蛋白mRNA表达的影响 Table 4 Effects of puerarin on the expression of tight junction protein mRNA in intestinal mucosa of 28-day-old broilers fed oxidized soybean oil |
由表 5可知，与饲喂新鲜大豆油相比，饲喂氧化大豆油显著提高28日龄十二指肠GSH含量和空肠GSH-Px活性(P < 0.05), 并显著降低28日龄回肠GSH含量、SOD活性和T-AOC以及56日龄回肠SOD活性和T-AOC(P < 0.05)，并有提高56日龄回肠MDA含量的趋势(P=0.076)。饲粮中添加葛根素显著提高28日龄肉鸡十二指肠GSH-Px活性以及56日龄肉鸡十二指肠SOD活性和回肠SOD、GSH-Px活性(P < 0.05)，并有提高56日龄回肠GSH含量的趋势(P=0.056)。饲粮中添加葛根素显著降低56日龄空肠GSH含量、SOD活性、T-AOC及回肠T-AOC(P < 0.05)。氧化大豆油和葛根素对28日龄和56日龄肉鸡十二指肠CAT活性存在显著交互作用(P < 0.05)。在氧化大豆油组中添加葛根素可显著提高28日龄回肠SOD活性，显著提高56日龄十二指肠CAT和SOD活性以及回肠SOD活性和GSH的含量(P < 0.05)。
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表 5 葛根素对饲喂氧化油脂肉鸡小肠黏膜抗氧化能力的影响 Table 5 Effects of puerarin on antioxidant capacity of small intestinal mucosa in broilers fed oxidized oil |
肠绒毛具有吸收功能，绒毛高度和绒毛表面积可以表示其吸收功能的强弱[16]，分泌是隐窝的主要功能，从隐窝的深浅得到肠上皮细胞的生成率，绒毛高度/隐窝深度(V/C)的比值则反映了肠道消化吸收的能力[17]。本试验发现，饲喂氧化大豆油使3个肠段的绒毛高度及V/C显著降低，隐窝深度显著升高，这说明饲喂氧化大豆油严重破坏了肠道的形态学结构，导致肠道的消化吸收功能下降。这与张志浩[18]的研究一致，其试验结果发现，饲喂氧化油脂造成肉鸡肠道病理学变化，导致肠道形态学结构遭到严重破坏。前人研究发现，饲粮中添加葛根素可以改善细胞的结构和屏障功能[19]。本试验结果表明，饲粮中添加葛根素显著提高肉鸡小肠的绒毛高度和V/C，隐窝深度显著降低，说明饲粮中添加葛根素可改善肉鸡肠道形态结构和增强小肠屏障功能。氧化大豆油和葛根素对28和56日龄肉鸡小肠的绒毛高度、隐窝深度和V/C存在显著的交互作用，饲喂氧化大豆油破坏了肠道的形态学结构，而饲粮中添加葛根素显著升高饲喂氧化大豆油黄羽肉鸡3个肠段的V/C并显著降低3个肠段的隐窝深度，说明在氧化大豆油饲粮中添加葛根素在一定程度上改善了氧化损伤条件下肉鸡小肠形态结构，对氧化损伤条件下肠道消化吸收能力具有一定的修复作用。
肠上皮紧密连接蛋白在肠屏障中起着重要作用，因为它对维持肠黏膜通透性至关重要，这些蛋白的丢失会导致的肠道屏障的破坏，出现腹泻、肠出血等症状[20]。在本研究中，通过荧光定量PCR分析了claudin-1、occludin和ZO-1 mRNA的表达，结果表明，在饲喂氧化大豆油肉鸡小肠黏膜中claudin-1的表达减少，从而破坏了肠道屏障功能。饲粮中添加葛根素可通过提高肉鸡小肠黏膜紧密连接蛋白ZO-1 mRNA的表达量，改善肠上皮屏障功能障碍，有效阻止屏障完整性的破坏，这一结果与Jeon等[21]的报道相似，其试验结果显示，敌草快诱导的结肠炎小鼠结肠组织中的紧密连接蛋白表达减少，口服葛根素使ZO-1、occludin和claudin-1的表达增加。本研究中，绒毛高度/隐窝深度和ZO-1 mRNA的表达增加，证明了葛根素对饲喂氧化大豆油肉鸡肠道屏障功能得到了恢复，黏膜屏障功能的改善可能预示着氧化损伤的减轻。
氧化应激会造成胃肠道损伤，但机体的抗氧化防御系统可以抵消过量活性氧造成的影响。这些防御机制确保ROS/RNS的浓度得到控制，不会产生有害影响。内源性抗氧化系统主要由细胞内的酶抗氧化物组成，如SOD、GPX和CAT；细胞内的非酶抗氧化物GSH；细胞外抗氧化物包括矿物质、铜蓝蛋白、维生素和尿酸[22]，这些指标都可以作为评判机体的抗氧化能力。但评价机体内部抗氧化能力不能只依据单一指标的高低，应该从系统平衡的角度去衡量。本研究发现，饲喂氧化大豆油显著升高28日龄肉鸡十二指肠GSH和空肠GSH-Px含量并显著降低回肠GSH、SOD和T-AOC含量，显著降低56日龄肉鸡回肠SOD和T-AOC的含量，说明饲喂氧化大豆油使肉鸡体内氧化-抗氧化失衡，造成氧化应激，与Lindblom等[23]人的研究结果一致。油脂的水解产物主要是在十二指肠和空肠中被吸收[24]，而28日龄肉鸡十二指肠GSH和空肠GSH-Px含量升高可能是由于十二指肠和空肠消化吸收的氧化大豆油饲粮中脂质过氧化产物激活机体的抗氧化防御系统，所以机体释放大量的抗氧化物来抵消过量活性氧造成的影响，在回肠中抗氧化酶显著降低可能是由于摄入脂质过氧化产物过度激活体内抗氧化系统，直到抗氧化系统不堪重负，消耗大量的抗氧化酶，使回肠中的抗氧化物显著降低。葛根素作为一种植物类黄酮，其抗氧化应激作用已被证实。在非细胞系统中，它能抑制Cu2+诱导的高密度脂蛋白的氧化[25]，而在细胞基础检测中，葛根素是一种有效的ROS清除剂，可以通过抑制氧化应激保护汞、H2O2、晚期糖基化终末产物(AGEs)、鱼藤酮诱导的雪旺细胞凋亡和细胞损伤[26]。本研究发现，饲粮添加葛根素可提高氧化损伤条件下28日龄肉鸡回肠GSH含量，56日龄十二指肠SOD活性，回肠GSH含量和SOD的活性而提高其抗氧化能力，表明饲粮中添加葛根素可以提高氧化损伤条件下肉鸡肠道抗氧化能力。
4 结论 4.1饲喂氧化大豆油破坏肠道黏膜形态结构，降低紧密连接蛋白mRNA的表达量，添加葛根素可提高肉鸡小肠黏膜紧密连接蛋白mRNA的表达量，改善氧化损伤条件下肠道黏膜形态结构。
4.2饲喂氧化大豆油显著降低28日龄回肠GSH含量、SOD活性、T-AOC以及56日龄回肠GSH含量和SOD活性，饲粮添加葛根素可提高氧化损伤条件下28日龄肉鸡回肠GSH含量、56日龄十二指肠SOD活性以及回肠GSH含量和SOD活性而提高其抗氧化能力。
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