2. 青海大学实验室管理处, 西宁 810016
2. Laboratory Management Office of Qinghai University, Xining 810016, China
热休克蛋白27(heat shock protein 27，HSP27)是细胞或生物体在应激情况下由热激基因所编码合成的具有高度保守性的一组小分子蛋白质，具有多种生物学功能[1]。先前的研究表明，HSP27最主要的特征就是具有分子伴侣功能，比如在响应热和氧化应激时，诱导型的HSP27表达增加并激活PKB/Akt/RAC信号通路，HSP27的分子伴侣活性不断增强从而保护细胞功能[2]。HSP27具有抗细胞凋亡作用，HSP27的磷酸化二聚体结合DAXX可以在Fas-Fas L介导凋亡，阻止其与ASK1和Fas的相互作用，从而阻断DAXX介导的凋亡[3-4]。HSP27具有抗氧化应激作用，在细胞受到氧化应激时HSP27通过提高谷胱甘肽的水平和降低铁的含量来提升细胞的抗氧化能力[5]。此外，HSP27在哺乳动物的繁殖过程中发挥着重要的功能且与卵泡发育密切相关[6]。Wang等[7]发现，HSP27基因在培养后的小鼠卵泡中广泛表达于卵母细胞、颗粒细胞、卵泡膜细胞。Khan等[8]发现，在卵泡发育过程中HSP27蛋白与转胶蛋白起分子伴侣的作用，它的表达和胶原Ⅰ、胶原Ⅱ具有时空相关性。马红梅和刘嘉茵[9]发现，HSP27基因在哺乳动物体内除了作为分子伴侣保护蛋白质免受损伤外，还广泛地参与了卵子的发生和形成过程，与哺乳动物的繁殖功能密切相关。Sreekanth等[10]发现，在卵泡发育过程中，磷酸化的HSP27增强细胞对应激的耐受性，并增加活细胞数量，激活p38-MAPK通路使得孕酮、雌二醇和类固醇蛋白水平上升从而促进卵泡发育成熟。
藏羊在青海省内主要分布在青南和环湖牧区，其生活能力强、耐粗、耐寒且具有独特的生物学特性和经济特性。藏羊以“一年一胎、一胎一羔”的繁殖方式为主，繁殖效率低下，不能够适应牧区现代化的生产要求[11]。大量研究表明，繁殖效率除了受胎次、季节、营养的影响外主要受遗传因素控制[12]。HSP27基因在哺乳动物卵泡的发育包括细胞的增殖与分化过程中发挥着重要的作用[8]。前人研究发现，生长分化因子9(growth differentiation factor 9, GDF9)可以通过调节卵巢颗粒细胞增殖分化，促进繁殖轴相关基因、功能蛋白、因子的产生及表达，进而在卵泡发育及排卵方面发挥重要作用[13]。骨形态发生蛋白受体1B(bone morphogenetic protein receptor type 1B, BMPR-1B)在绵羊卵巢内广泛表达，通过调节细胞分化、增殖等生理过程对动物卵泡发育、激素释放等方面发挥重要作用，是卵巢中启动卵泡发育以及调节排卵的必要生长因子[14]。雌激素受体(estrogen receptor β, Erβ)作为卵泡发育重要转录因子之一，其蛋白结构的D区有与HSP结合的位点，雌激素通过这一受体对HSP27的调节起作用[15]。
本研究拟克隆藏羊卵巢HSP27基因并进行生物信息学分析，构建藏羊HSP27基因过表达及沉默载体，分离培养藏羊卵巢颗粒细胞用于转染，并在显微镜下观察转染后不同培养时间点细胞形态及细胞计数变化，通过RT-PCR检测经转染后HSP27基因在颗粒细胞的表达，同时检测HSP27基因对卵泡发育相关基因GDF9、BMPR-1B、Erβ在卵巢颗粒细胞中表达的影响，以期进一步探究HSP27基因在藏羊卵泡发育过程中的分子机制和调控机理。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验动物来自青海海南州哇玉香咔梅哚牧业责任有限公司，选择健康的(3~4岁)经产藏羊母羊6只，平均体重(45.36±1.16) kg。屠宰后迅速采集卵巢组织，用无菌生理盐水冲洗并修剪后迅速投入液氮中带回实验室，于－80 ℃冷冻备用。
1.2 试验试剂pRNA-H1.1/Adeno、pAdeasy-1、pAdTrack-CMV(优宝生物)；TRIzol(Invitrogen)；Fast King cDNA第1链合成试剂盒、RT-PCR试剂盒(北京天根生化)；DMEM(Sigma)；FBS(Gibco)；内切酶(上海生工)；其它试剂均为国产分析纯。
1.3 试验方法1.3.1 HSP27基因克隆 从GenBank数据库检索绵羊HSP27基因序列(XM_027961472.1)、绵羊GDF9(NC_030814.1)、BMPR-1B(NC_022298.2)、Erβ(XM_005898252.1)基因mRNA序列，以β-actin为内参基因，用Primer Premier 5.0软件进行引物设计。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，试验所用引物序列见表 1。
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表 1 基因引物序列 Table 1 Related genes primer sequences |
本试验采用常规TRIzol法，从藏羊的卵巢组织中提取总RNA检测其浓度，将总RNA反转录成cDNA并检测其浓度，于－20 ℃保存备用。以反转录后的cDNA为模板，扩增藏羊HSP27基因。PCR扩增体系为20 μL：50 mg·μL-1模板cDNA 1.5 μL，5 U·μL-1 Taq PCR预混酶2.0 μL，100 μmol·L-1引物1 μL(上、下游引物各0.5 μL)，PCR Loading Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·L-1 dNTP 2.0 μL，ddH2O 11.0 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。回收PCR产物并用1%琼脂糖凝胶电泳检测。回收纯化的PCR产物与pUC57载体16 ℃连接过夜，构建重组质粒，并将其转化至大肠杆菌感受态细胞中，37 ℃、180 r·min-1振荡培养1 h。将转化产物涂布到含Kan抗性的LB琼脂平板表面，于37 ℃培养过夜，12~16 h后可出现菌落。挑取单菌落，接种至含Kan抗性的LB培养基，37 ℃ 180 r·min-1振荡培养8~10 h。将菌液送至上海生工生物工程股份有限公司测序。
1.3.2 藏羊HSP27基因的生物信息学分析 用NCBI中的BLAST软件对已测得藏羊HSP27基因与其他物种HSP27基因的序列进行比对，使用MegAlign软件分析同源性并构建进化树；使用DNAStar软件分析藏羊HSP27基因的核苷酸及氨基酸序列；使用在线软件ORF finder、Protparam、Protscale、IBCP、SWISS-MODEL、NetOGlyc4.0、NetNGlyc1.0分析预测藏羊HSP27基因开放阅读框、编码蛋白的理化性质、蛋白质疏水性质、蛋白质的二级结构、三级结构、糖基化位点及磷酸化位点。
1.3.3 藏羊HSP27基因过表达载体AdCMV-HSP27构建及验证 使用Kpn I和Xho I双酶切基因合成HSP27质粒，回收HSP27片段即产物1；Kpn I和Xho I双酶切pAdTrack-CMV载体，回收产物2；将回收的产物1和2进行连接并转化至大肠杆菌感受态细胞中，涂板后过夜培养；挑取转化子，PCR鉴定阳性转化子(PCR反应体系及反应条件同“1.2.1”)；将PCR鉴定后阳性转化子进行测序，选择正确转化子提取质粒备用。将构建成功的pAdTrack-HSP27转化到BJ5183感受态菌株中(BJ5183感受态菌株中含有pAdeasy-1载体)同源重组，涂布平板，抗性筛选，最后提取AdCMV-HSP27质粒。
1.3.4 藏羊HSP27基因沉默载体构建及验证 依据shRNA靶点设计原则，在HSP27的编码区设计shRNA序列，命名为HSP27-shRNA，增设阴性对照组NC-HSP27-shRNA(表 2)。
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表 2 HSP27基因shRNA靶点设计 Table 2 HSP27 gene shRNA target design |
分别化学合成以上靶点序列，退火形成双链即产物3；使用Mlu I和Hind III双酶切pRNA-H1.1/Adeno载体，回收产物4；将回收产物3和4连接后转化至大肠杆菌感受态细胞中，涂板后过夜培养；挑取转化子进行测序(测序引物序列为F：TAATACGACTCACTATAGGG，R：CAAAACTACATAAGACCCCCAC)，挑取阳性转化子提取质粒备用。将上述构建成功的载体分别转化到BJ5183感受态菌株中(BJ5183感受态菌株中含有pAdeasy-1载体)同源重组，涂布平板，抗性筛选，提取AdCMV-GFP-H1-shRNA/HSP27质粒。
1.3.5 HSP27基因过表达载体及沉默载体在藏羊卵巢颗粒细胞的转染 参考赵妙妙等[16]的方法，将采集的新鲜藏羊卵巢在含双抗的37 ℃生理盐水中保存带回实验室；用注射器吸取卵泡液后离心5 min(1 200 r·min-1)，弃去上清液后再次离心，过筛得到纯净的颗粒细胞，按照适当的细胞浓度与配制的细胞培养基(含有10%FBS的DMEM基础液)装入细胞瓶中，在5% CO2、37 ℃的培养箱中培养24 h。除去原细胞培养基，PBS清洗2遍后，更换培养液继续培养。
将第2~3代卵巢颗粒细胞以每孔5×105个接种至6孔板中培养，待细胞生长至60%以上的汇合度时，弃去培养液，用2 mL无血清DMEM清洗一次后弃去，再加入1 mL不含血清培养液。把重组质粒AdCMV-HSP27、AdCMV-GFP-H1-shRNA/HSP27分别与转染试剂混合，将复合物缓缓加入培养液中，摇匀，在培养箱中37 ℃、5% CO2培养24 h后吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。
1.3.6 HSP27基因过表达载体及沉默载体对颗粒细胞形态变化及细胞计数的影响 将第2代卵巢颗粒细胞以每孔0.35×106个接种至24孔板中培养，待细胞生长至60%以上的汇合度时更无血清培养基，用Lipofectamin2000试剂按不同分组进行细胞转染试验即空白对照组、过表达载体组、沉默载体组、阴性对照组，每组设3个复孔，转染6 h后更换正常培养基继续培养。在培养0、24、48、72 h时，倒置显微镜下观察细胞形态和细胞密度的变化。同时分别于0、24、48、72 h将细胞用胰酶消化制成细胞悬液，按9∶1加入4%台盼蓝溶液，利用血球计数板于显微镜下计数。
1.3.7 HSP27基因过表达载体及沉默载体对藏羊卵泡发育相关基因表达的影响 收集“1.3.5”中培养的空白组细胞和各转染组的细胞，TRIzol法提取细胞RNA，逆转录合成cDNA第1链，RT-PCR检测HSP27在各组(空白组、AdCMV-HSP27组、NC-HSP27-shRNA组、HSP27-shRNA组)细胞中的mRNA表达量，同时检测GDF9、BMPR-1B、Erβ基因在各组细胞中的表达量。以绵羊β-actin作为内参基因，采用SYBR GreenⅠ染料法测定mRNA表达量，每个样品重复6次。反应体系为20 μL：2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10.5 μL，100 μmol·L-1引物1 μL(上、下游引物各0.5 μL)，50 mg·μL-1模板cDNA 1.0 μL，RNase-free ddH2O 7.5 μL。反应条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40个循环。
1.3.8 数据处理及统计分析 本试验中基因的相对表达量采用2-△△Ct法计算，用SPSS 20.0软件进行差异显著性分析；其他数据用Excel 2010统计整理后，采用SPSS 20.0分析软件进行细胞计数试验的结果统计分析，结果以“平均值±标准差(mean±SD)”表示，以P < 0.01为差异极显著性判断标准。
2 结果 2.1 藏羊HSP27基因的克隆与鉴定用卵巢组织反转录的cDNA为模板，扩增藏羊HSP27基因CDS区。结合NCBI中的BLAST软件在线对比，扩增所得序列与参考序列的一致性达99.72%，因此可判定扩增出来的序列为藏羊的HSP27基因序列。将扩增的CDS区序列与pUC57载体进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，培养后挑选菌落进行双酶切验证。双酶切鉴定结果显示，藏羊HSP27基因重组质粒使用限制性内切酶Kpn I和Xho I双酶切后，获得618 bp的插入片段，且对照组质粒未被酶切，说明藏羊HSP27基因的克隆成功(图 1)。
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1.对照组质粒DNA；2.Kpn I和Xho I双酶切产物；M.DNA相对分子质量标准 1.Control plasmid DNA; 2. Double enzyme digestion pro-ducts by Kpn I and Xho I; M. DL4500 DNA marker 图 1 双酶切鉴定结果 Fig. 1 Double enzyme digestion results |
2.2.1 藏羊HSP27基因序列分析 将PCR扩增产物测序拼接后获得一段长618 bp的mRNA序列，用NCBI中的ORF finder在线软件进行HSP27基因的开放阅读框分析，并使用DNAStar软件分析HSP27基因的核苷酸和氨基酸序列。分析结果表明，HSP27基因的ORF最长为606 bp，起始密码子位于7 bp处，终止密码子位于612 bp处；HSP27基因片段长度为618 bp，其碱基组成(表 3)中C、G的含量较高；HSP27基因编码蛋白含203个氨基酸，其氨基酸数量及种类(表 4)，其中疏水性和亲水性氨基酸的数量较多，蛋白分子质量为22 735.41 u。
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表 3 HSP27基因核苷酸序列分析 Table 3 Nucleotide sequence analysis of HSP27 gene |
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表 4 HSP27氨基酸序列分析 Table 4 Amino acid sequence analysis of HSP27 |
2.2.2 藏羊HSP27序列同源性分析及系统进化树构建 利用软件MegAlign对藏羊HSP27基因序列与NCBI中的印度牛(XM_027527283.1)、野牛(XM_014477336.1)、家牛(XM_005005115.2)、水牛(KX806596.1)、单峰驼(XM_031432690.1)、山羊(XM_018040903.1)、白鲸(XM_022588028.2)、绵羊(XM_027961472.1)、美洲狮(XM_025923303.1)等物种的HSP27序列进行了同源性对比，同时构建系统进化树。结果表明，核苷酸序列同源性分别为96.9%、96.9%、96.9%、98.0%、91.4%、98.7%、93.0%、97.9%和90.0%(图 2A)。氨基酸序列同源性依次为97.1%、97.1%、97.1%、98.0%、9.4%、8.3%、95.6%、98.1%、和7.3%(图 2B)。另外，由系统进化树可知，进化树主要分为牛科及其他分支，牛科又分为牛亚科及羊亚科，牛亚科包括印度牛、野牛、水牛和家牛，羊亚科包括藏羊、山羊、绵羊，藏羊与绵羊的亲缘关系最近(图 2C)。
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A.HSP27核苷酸序列同源性分析图；B.HSP27氨基酸序列同源性图；C.HSP27的系统进化树图 A.The homology of HSP27 nucleotide acid sequence; B. The homology of HSP27 amino acid sequence; C. The phylogenetic tree of HSP27 图 2 HSP27同源性及系统进化树分析 Fig. 2 HSP27 homology and phylogenetic tree analysis |
2.2.3 藏羊HSP27基因编码蛋白的理化性质分析及亲疏水性分析 利用在线软件Protparam分析其理化性质，结果表明，该编码区蛋白分子式为C1014H1562N286O307S2，包含原子个数为3 171，理论等电点为5.99，脂肪系数为69.02。该编码蛋白质共含有19种氨基酸，其中含量最高的是丝氨酸(Ser, 10.3%)，含量最低的是蛋氨酸(Met, 0.5%)，含带负电氨基酸(Asp + Glu)24个，带正电氨基酸(Arg + Lys)22个。利用在线软件Protscale分析藏羊HSP27基因氨基酸序列的亲疏水性，结果表明，藏羊HSP27基因编码的整个氨基酸序列中最大亲水性值为4.5(Ile)，最小亲水性值为－4.5(Arg)，亲水性氨基酸大于疏水性氨基酸，说明HSP27是亲水性蛋白(图 3)。
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图 3 HSP27基因编码蛋白的疏水性分析 Fig. 3 Analysis of hydrophobicity of HSP27 gene encoded protein |
2.2.4 藏羊HSP27基因编码蛋白的高级结构预测 利用在线软件IBCP预测藏羊HSP27基因编码蛋白的二级结构(图 4)。预测表明，该蛋白α-螺旋区为42个氨基酸，占20.69%；延伸链为28个氨基酸，占13.79%；无规则卷曲为133个氨基酸，占65.52%。利用在线软件SWISS-MODEL预测藏羊HSP27基因编码蛋白的三级结构(图 5)，发现预测的结果与二级结构相似。
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图 4 HSP27基因编码蛋白的二级结构预测 Fig. 4 Prediction of the secondary structure of the protein encoded by the HSP27 gene |
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图 5 HSP27基因编码蛋白的三级结构预测 Fig. 5 Prediction of the tertiary structure of the protein encoded by HSP27 gene |
2.2.5 藏羊HSP27基因编码蛋白糖基化位点及磷酸化位点预测 利用在线软件NetOGlyc4.0和NetNGlyc1.0预测藏羊HSP27基因编码蛋白质糖基化位点，结果表明，该蛋白在第154、172、178、182、197位氨基酸处存在O-糖基化位点，没有潜在的N-糖基化位点；利用在线软件NetPhos预测藏羊HSP27基因编码蛋白质磷酸化位点，结果表明，该蛋白共有30个磷酸化位点，其中Thr、Ser和Tyr磷酸化位点分别有18、9、3个(图 6)。
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图 6 HSP27磷酸化位点分析 Fig. 6 HSP27 phosphorylation sites analysis |
2.3.1 载体转染至颗粒细胞后对细胞形态变化及细胞计数的影响 将获得的AdCMV-HSP27、AdCMV-GFP-H1-shRNA/HSP27重组质粒交由上海生工生物工程股份公司测序，将测序结果对比，藏羊HSP27基因重组序列与NCBI上传的绵羊HSP27基因序列一致。
将重组质粒转染至卵巢颗粒细胞中，观察细胞形态及细胞计数变化。细胞形态变化：转染后培养0 h时，各转染组之间细胞生长情况均良好，细胞呈现贴壁趋势；培养24 h时，空白组细胞生长状态优于其他3组，且空白组细胞密度高于其他3组；培养至48 h时，空白组细胞贴壁形态趋于稳定并且分布较均匀，细胞呈长梭形伴有少量突起，细胞核呈卵圆形，此时空白组细胞生长大致进入第3代，过表达组与阴性对照组细胞数量明显增长，细胞密度增加，悬浮细胞增多，细胞多呈现不规则的多边形，沉默组细胞大量脱落，细胞皱缩并出现空泡，贴壁细胞数目明显减少；培养至72 h时，空白组细胞生长状态最佳，贴壁牢固，细胞间紧密相连，此时空白组细胞生长大致进入第4代，过表达组贴壁细胞的分支收缩，细胞核变形分解，此时过表达组细胞生长大致进入第5或6代，沉默组细胞前端伪足伸出明显减少，细胞皱缩变圆，大量凋亡脱落(图 7)。
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图 7 不同转染分组及不同培养时间细胞形态显微镜下表现(40×) Fig. 7 Morphological appearance of cells in different transfection groups and under different culture time (40×) |
细胞计数结果显示，培养至72 h时各转染组间的总体差异具有统计学意义(F=44.289，P＜0.05)，沉默载体组细胞数量极显著低于其他各组(P＜0.01)，过表达组细胞数量显著低于空白组和阴性对照组(P＜0.05，图 8)。
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**.P < 0.01，*. P < 0.05，下同 **. P < 0.01, *. P < 0.05, the same as below 图 8 不同转染组细胞计数结果(n=3) Fig. 8 Cell count results of different transfection groups(n=3) |
2.3.2 过表达或沉默载体转染至颗粒细胞后对相关基因mRNA表达水平的影响 将构建的载体转染至卵巢颗粒细胞中，培养24 h。RT-PCR检测HSP27基因mRNA的表达水平，同时检测卵巢颗粒细胞各处理组GDF9、BMPR-1B、Erβ基因mRNA的表达水平，检测结果显示，过表达载体组细胞中HSP27基因mRNA表达水平极显著高于空白对照组(P＜0.01)，沉默载体组细胞HSP27基因mRNA表达水平极显著低于阴性对照组(P＜0.01)，表明转染成功且过表达载体及沉默载体构建成功；过表达载体组细胞中GDF9、BMPR-1B、Erβ基因mRNA表达水平均极显著高于空白组(P＜0.01)，沉默载体组细胞Erβ基因mRNA表达水平极显著低于阴性对照组(P＜0.01)，沉默载体组细胞GDF9、BMPR-1B基因mRNA表达水平与阴性对照组差异不显著(P＞0.05，图 9)。
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图 9 HSP27基因过表达及沉默载体转染对藏羊卵泡发育相关基因表达的影响(n=6) Fig. 9 Effect of HSP27 overexpression and silent vectors transfection on the expression of genes related to follicular development in Tibetan sheep(n=6) |
HSP27基因广泛存在于哺乳动物卵巢、子宫、睾丸、前列腺等多种组织中，与动物繁殖密切相关[17]。已有研究利用蛋白质组学结合生物信息学技术开展不同产羔性状绵羊分别在卵泡不同发育阶段卵巢组织中差异蛋白表达的检测，筛选出与绵羊产羔性状相关的关键蛋白HSPs，并且利用体外表达及生物信息学方式预测HSP27基因在绵羊卵泡发育过程中扮演着重要的角色，但其如何调控羊的卵泡发育，具体的作用机制尚不清楚[18-19]。本试验成功克隆了藏羊卵巢HSP27基因序列，其CDS区长618 bp，与NCBI上登录的绵羊mRNA序列一致性达99.72%，本试验结果同何翃闳等[20]克隆的牦牛HSP27基因结果相似，其通过荧光定量PCR检测到牦牛HSP27基因在卵巢中的表达量高于输卵管和子宫。序列分析发现，藏羊HSP27基因可编码203个氨基酸，共含有19种氨基酸，其中含量最高的是丝氨酸Ser，占总氨基酸的10.3%。丝氨酸作为哺乳动物机体的一种功能性氨基酸，是合成半胱氨酸Cys和甘氨酸Gly的前体[21]。姚兰春等[22]用丝氨酸处理小鼠，观察对其排卵的影响，发现丝氨酸对小鼠具有促排卵的作用；王禹盟等[23]研究发现，甘氨酸处理能显著提高猪卵丘细胞扩散直径进而提高卵母细胞体外成熟率；罗惠娣等[24]研究发现，在羔羊卵母细胞成熟液里添加半胱氨酸能够促进卵母细胞的成熟，同时能有效提高体外生产胚胎的质量。由此可推测，藏羊HSP27蛋白能够促进卵泡发育。磷酸化是控制蛋白质活动机制的一部分，可以参与细胞内信号转导和调节酶的活性[25]，研究表明，在卵母细胞GVBD期发生的时候，HSP27在经过一系列磷酸化后能够增强细胞内的信号转导，并激活p38-MAPK通路使得孕酮、雌二醇和类固醇等蛋白水平上调从而促进卵母细胞发育成熟[10]，本研究中，HSP27蛋白存在30个磷酸化位点，可以推测其在修饰后对藏羊卵母细胞成熟具有重要作用。
卵泡发育包括颗粒细胞的增殖、分化、凋亡及卵母细胞成熟闭锁几个方面，卵母细胞发育能力在一定程度上受颗粒细胞凋亡的影响。HSP27蛋白作为卵泡发育过程中的第一类蛋白，主要以保护细胞功能活性的形式发挥内源性保护机制，参与到哺乳动物卵泡的生长发育过程中。研究发现，HSP27基因在哺乳动物机体中能够介入细胞凋亡信号通路而直接干扰细胞凋亡，HSP27能够不依赖于ATP而抑制ras GTP酶的活性，增加抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xl的丰度，减少促凋亡因子Bax的蛋白含量，抑制细胞色素c介导的caspase-3和多聚腺苷酸聚合酶的活性，抑制凋亡小体复合物的功能[26]。在雌性哺乳动物中，卵母细胞储备量一出生就已确定，卵巢中99.9%的卵泡在不同阶段闭锁，只有少数卵泡发育成熟并完成排卵。在早期卵泡闭锁过程中，颗粒细胞首先由内层向外层逐渐凋亡，进而诱导卵母细胞凋亡，加剧卵泡的闭锁，降低排卵率；当外源干扰减弱颗粒细胞凋亡时，优势卵泡的选择受阻，诸多早期卵泡均持续发育，进而促使卵母细胞发育成熟，增加排卵。当HSP27基因表达水平上升时，能够影响下丘脑GnRH以及垂体促性腺激素中的FSH和LH对卵泡颗粒细胞核或膜细胞下游作用的调节，抑制颗粒细胞凋亡的触发，进而调控哺乳动物卵泡发育及排卵过程[27]。本试验将构建的载体转染至颗粒细胞并在显微镜下进行细胞形态和细胞计数试验，研究发现，当HSP27基因过表达时颗粒细胞增殖分化速度加快，提前进入第5~6代，当沉默HSP27基因时颗粒细胞会大量皱缩凋亡，即过表达HSP27基因能够促进颗粒细胞增殖分化，敲低HSP27基因会触发颗粒细胞凋亡，由此可以推测，干扰HSP27基因可能会影响颗粒细胞的增殖分化和凋亡，进而影响卵泡发育，具体作用机制还有待进一步研究。
载体构建就是构建含外源DNA的质粒，是一种常用的分子生物学研究手段。构建过表达载体可通过质粒转染的方法将目的基因导入靶细胞或器官[28]，本试验扩增出藏羊HSP27基因序列并克隆至pUC57载体，通过双酶切、转化、重组、培养等步骤构建AdCMV-HSP27过表达载体。RNA干扰技术中的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)是人工合成的一种基因沉默载体构建方式[29]，本试验设计了藏羊HSP27基因的干扰序列并通过靶点设计、连接、转化、筛选等步骤最终构建藏羊HSP27基因的沉默载体。本试验将构建的过表达载体及沉默载体的质粒转染至藏羊卵巢颗粒细胞，通过RT-PCR检测HSP27基因mRNA表达水平，结果表明，过表达载体及沉默载体构建成功。潘章源等[30]研究发现，BMPR-1B直接作用于绵羊卵巢、子宫，通过抑制cAMP的释放以及孕酮、雌二醇和雄烯二酮激素的合成促使母羊颗粒细胞加快分化，加速卵泡成熟，郭慧慧等[31]研究发现，BMPR-1B基因影响颗粒细胞分化和卵泡发育，具有促进排卵的作用，徐敏丽等[32]研究发现，GDF9基因在卵巢中主要由卵母细胞分泌，对卵泡的生长分化和胚胎的发育起重要的调节作用，本试验中，HSP27基因过表达载体组与空白组相比BMPR-1B、GDF9的表达量均极显著增加，沉默载体组较阴性对照组BMPR-1B、GDF9的表达量下调，但差异均不显著，表明干扰HSP27基因表达会影响卵巢颗粒细胞BMPR-1B、GDF9基因的表达量。雌二醇(estradiol，E2)是重要的雌激素，可以由卵巢颗粒细胞合成并分泌，E2通过雌激素受体(包括Erα和Erβ)参与卵巢功能的调控[33]，本试验中，HSP27基因过表达载体组与空白组相比Erβ的表达量极显著增加，且沉默载体组与阴性对照组相比Erβ的表达量极显著降低。结合前人研究结果提示，HSP27基因可能通过提高BMPR-1B、GDF9、Erβ基因的表达水平来间接提高藏羊卵泡发育，具体作用机制还有待进一步研究，结合本研究结果，以期进一步探究HSP27基因在藏羊卵泡发育过程中的分子机制和调控机理。
4 结论本试验成功克隆了藏羊HSP27基因CDS区序列，并成功构建了藏羊HSP27基因过表达载体及沉默载体，同时将所得到的载体转染至卵巢颗粒细胞。根据形态学及细胞计数结果初步推测，当HSP27基因过表达时能够促进颗粒细胞增殖分化，当沉默HSP27基因时可能会触发颗粒细胞凋亡进而影响卵泡发育，同时HSP27基因可能通过提高BMPR-1B、GDF9、Erβ基因的表达水平来间接促进藏羊卵泡发育。以上研究结果均可为HSP27基因在藏羊卵泡发育过程中的功能研究奠定试验基础。
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(编辑 郭云雁)