畜牧兽医学报  2021, Vol. 52 Issue (11): 3312-3316. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2021.011.032    PDF    
引用本文
钟昊然, 王培莉, 郭佳, 王亨, 朱国强, 李建基, 崔璐莹, 董俊升, 孟霞. 禽致病性大肠杆菌clpV2基因缺失株的构建及生物学特性分析[J]. 畜牧兽医学报, 2021, 52(11): 3312-3316.  
ZHONG Haoran, WANG Peili, GUO Jia, WANG Heng, ZHU Guoqiang, LI Jianji, CUI Luying, DONG Junsheng, MENG Xia. Construction and Biological Characteristics Analysis of clpV2 Gene Mutant in Avian Pathogenic Escherichia coli[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2021, 52(11): 3312-3316.  
禽致病性大肠杆菌clpV2基因缺失株的构建及生物学特性分析
钟昊然1,2, 王培莉1,2, 郭佳1,2, 王亨1,2, 朱国强1,2, 李建基1,2, 崔璐莹1,2, 董俊升1,2, 孟霞1,2     
1. 扬州大学兽医学院, 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心, 扬州 225009;
2. 教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室, 扬州 225009
收稿日期：2021-02-03
基金项目：国家重点研发计划(2017YFD0500203);扬州大学研究生科研创新计划项目(XKYCX19_138);江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD); 江苏高校品牌专业建设工程资助项目(TAPP)
作者简介：钟昊然(1996-), 男, 浙江宁波人, 硕士生, 主要从事病原微生物致病机理研究, E-mail: leslie1996716@163.com.
通信作者：孟霞, 主要从事病原微生物相关研究, E-mail: mengxia_1@126.com.
摘要：旨在研究六型分泌系统2（type Ⅵ secretion system 2，T6SS2）clpV2基因对禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli，APEC）TW-XM菌株生物学特性的影响。本研究利用Red同源重组构建clpV2基因缺失株，将clpV2基因克隆到表达载体pBR322中，成功构建回补株。对突变株的部分生物学特性进行分析。结果显示：各突变株均能稳定遗传，且clpV2基因的缺失不影响TW-XM菌株的生长速度以及对多种抗生素的敏感性，但会导致其运动能力和生物被膜形成能力显著下降。综上表明，clpV2基因的缺失会影响TW-XM菌株的部分生物学特性，为进一步研究clpV2基因的功能和APEC的致病机制奠定基础。
关键词：禽致病性大肠杆菌    六型分泌系统    clpV2基因    生物学特性    
Construction and Biological Characteristics Analysis of clpV2 Gene Mutant in Avian Pathogenic Escherichia coli
ZHONG Haoran1,2, WANG Peili1,2, GUO Jia1,2, WANG Heng1,2, ZHU Guoqiang1,2, LI Jianji1,2, CUI Luying1,2, DONG Junsheng1,2, MENG Xia1,2     
1. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University; Jiangsu Co-innovation Center for the Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China;
2. Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety, the Ministry of Education of China, Yangzhou 225009, China
Corresponding author: MENG Xia, E-mail: mengxia_1@126.com.
Abstract: This study was conducted to investigate the biological characteristics of the clpV2 gene in the type Ⅵ secretion system 2 (T6SS2) from avian pathogenic Escherichia coli (APEC). The clpV2 deleted strain was constructed by the Red recombination system. In addition, the clpV2 gene was cloned into the expression vectors of pBR322 to construct the complementary strain. The mutant strains were proved to be genetically stable. Comparison of biological characteristics was performed. The data demonstrated that, the mutant strains showed no differences in growth curve and sensitivity to multiple antibiotics. But compared with the wild type strain, the motility and biofilm formation of the deleted strain were decreased significantly. This work proved that the clpV2 gene had partial impact on the biological characteristics of TW-XM. Also, this work provided further basis to investigate the function of the clpV2 gene which might also help in understanding the pathogenesis of APEC.
Key words: avian pathogenic Escherichia coli    type Ⅵ secretion system    clpV2 gene    biological characteristics    

在1/4的革兰阴性菌中都能发现六型分泌系统(Type Ⅵ secretion system, T6SS)的存在[1-2]。ClpV作为T6SS的必需组分，能在ATP的驱动下完成T6SS的回收，为T6SS分泌效应因子提供能量[3]。大肠杆菌(Escherichia coli，E coli)被证实含有3套T6SS，有研究表明T6SS2在侵袭脑微血管内皮细胞的过程中发挥重要作用，且T6SS2也含有核心组分ClpV2[4]。但目前关于ClpV2的生物学特性研究却鲜有报道[5]。

本研究利用Red同源重组，成功构建了TW-XM菌株T6SS2中的clpV2基因突变株，并比较各突变株部分生物学特性的差异，为深入研究ClpV2在APEC致病性的过程中发挥何种作用提供参考。

1 材料与方法 1.1 菌株与质粒

菌株APEC TW-XM、DH5α；质粒pKD46、pKD3、pCP20均由扬州大学朱国强教授馈赠。

1.2 主要试剂、仪器

Marker Ⅲ购自北京天根生化科技有限公司；Mueller-Hinton琼脂购自青岛高科园海博生物技术有限公司；常用药敏片购自杭州微生物生物试剂有限公司。

1.3 引物设计与合成

根据APEC TW-XM菌株已知的clpV2基因序列，设计缺失引物ΔclpV2-Cm-F/ΔclpV2-Cm-R、缺失鉴定引物clpV2-F/clpV2-R及回补引物pBR-clpV2-F/pBR-clpV2-R。引物均由南京擎科生物技术公司合成，序列见表 1。

表 1 构建clpV2基因突变株的引物序列 Table 1 Primers used for clpV2 mutant strains construction
1.4 clpV2基因突变株的构建与遗传稳定性试验

按照丁雪燕等[6]的方法，通过Red同源重组构建clpV2基因缺失株。筛选clpV2线性片段与含有pKD46的TW-XM感受态细胞的阳性转化子，以clpV2-F/clpV2-R为引物进行PCR鉴定。随后将pCP20质粒导入一次重组菌中，再次以clpV2-F/clpV2-R为引物进行PCR鉴定。鉴定正确后命名为TW-XM△clpV2。以pBR-clpV2-F/pBR-clpV2-R为引物，TW-XM为模板，扩增得到clpV2基因。经测序验证正确后克隆至表达载体pBR322中，将重组质粒pBR322-clpV2转化至TW-XM△clpV2，得到回补株TW-XMC△clpV2。

将上述得到的突变株连续传代，取第1、10、20、30代进行遗传稳定性分析。

1.5 生长曲线及运动性测定

将各菌株菌液按1∶100转接至30 mL新鲜的LB培养基中，于37 ℃ 180 r·min-1震荡培养，每小时取100 μL测定培养物的OD630 nm值，绘制生长曲线。将1 μL培养至OD630 nm=1.0的菌液滴加于半固体平皿中心，37 ℃培养18 h后测定细菌运动环直径。

1.6 生物被膜形成能力测定

采用96孔微孔板法测定生物被膜形成能力。将浓度为OD630 nm=1.0的各菌株菌液，按1∶100接种至96孔板中培养24 h。在蒸馏水洗涤后加入2%结晶紫染色20 min，洗涤后加入95%乙醇，检测OD630 nm值。

1.7 药物敏感性试验

用K-B法药敏试验检测药物敏感性。将新鲜菌液配成0.5麦氏单位菌液后，在M-H琼脂表面均匀涂布，将药敏片贴于琼脂表面，37 ℃培养18 h，测量抑菌圈直径大小。

1.8 统计学分析

数据处理采用SPSS 17.0软件，使用单因素方差分析(One-way ANOVA)，*表示差异显著(P < 0.05)，**表示差异极显著(P < 0.01)。

2 结果 2.1 clpV2基因突变株的构建与遗传稳定性试验

如图 1所示：野生菌clpV2扩增片段为2 688 bp，二次重组体为921 bp。回补株显示有两个特异性条带，921 bp处为缺失株的二次重组条带，2 688 bp处为回补质粒pBR322-clpV2的clpV2片段，表明各突变株构建成功。且连续传30代后均未发生突变，表明突变株具有良好的遗传稳定性。

M. Marker Ⅲ相对分子质量标准；1. 野生株TW-XM；2~5. 缺失株TW-XM△clpV2；6~8. 回补株TW-XMC△clpV2 M. Marker Ⅲ; 1. Wild type strain TW-XM; 2-5. Deletion mutant TW-XM△clpV2; 6-8. Complemental mutant TW-XMC△clpV2 图 1 clpV2基因突变株的遗传稳定性测定 Fig. 1 Identification of mutant strains for genetic stability
2.2 clpV2基因对生长曲线及药物敏感性的影响

生长曲线结果显示，各菌株在生长对数期、平台期、迟缓期的生长情况均无明显差异，表明clpV2基因不影响TW-XM的生长；药敏试验结果显示各菌株对上述9种药物的敏感性无明显差异(结果未展示)。

2.3 clpV2基因对运动性及生物被膜形成的影响

TW-XM△clpV2的运动环显著小于野生株(P < 0.05)，提示clpV2基因的缺失影响了运动性(图 2)；TW-XM△clpV2的生物被膜形成能力与野生株相比显著下降，提示clpV2基因的缺失会影响生物被膜形成能力(图 3)。

*.P < 0.05；ns.P>0.05 图 2 各菌株运动性检测 Fig. 2 Motility determination of different strains
*.P < 0.05 图 3 各菌株生物被膜形成能力检测 Fig. 3 Determination of biofilm formation ability of different strains
3 讨论

2000年，Datsenko和Wanner[7]利用两步同源重组法对大肠杆菌K-12进行了基因敲除，该方法简单易行，相比传统方法重组率也更高[8]。如今，该方法在大肠杆菌的基因敲除中被广泛应用。

国内外已有关于clpV的报道，Liu等[9]在敲除迟缓爱德华菌(Citrobacter freundii)中的clpV后发现细菌鞭毛蛋白的表达下调，同时Tang等[10]发现假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)clpV基因的沉默会下调鞭毛合成相关基因的表达，而本试验利用Red同源重组敲除clpV2基因后细菌运动能力减弱，则证明其与大肠杆菌的运动能力存在关联。除clpV2基因外，对T6SS2其余核心组分的研究也有了一定进展。Ding等[11]先前已成功敲除APEC CE129中T6SS2的另一核心组分hcp2基因，并对相应突变株进行了生物学特性分析。结果显示细菌的生物被膜形成能力显著降低、对鸡胚成纤维细胞的黏附能力显著减弱、Ⅰ型菌毛主要亚单位基因fimA以及fimC的mRNA相对表达量显著降低。在本研究中，clpV2的缺失也导致生物被膜形成能力减弱，证明T6SS2可能参与调控Ⅰ型菌毛的合成，从而影响生物被膜形成能力和黏附能力，进而影响致病力。但具体哪些黏附素表达受到影响还有待进一步探索。与此同时，clpV2基因的缺失不影响细菌的药物敏感性，说明T6SS2可能不参与耐药性调控。

而本试验中TW-XM clpV2基因的成功敲除，有助于深入了解T6SS2的功能，同时也为研究APEC TW-XM致脑膜炎的机制奠定基础。

4 结论

利用Red同源重组成功构建TW-XM的clpV2基因缺失株，并构建相应的回补株。各突变株均能稳定遗传，发现clpV2基因的缺失不影响TW-XM菌株的生长速度以及对多种抗生素的敏感性，但会导致其运动能力和生物被膜形成能力显著下降。

参考文献
[1]
CIANFANELLI F R, MONLEZUN L, COULTHURST S J. Aim, load, fire: the type Ⅵ secretion system, a bacterial nanoweapon[J]. Trends Microbiol, 2016, 24(1): 51-62. DOI:10.1016/j.tim.2015.10.005
[2]
HO B T, DONG T G, MEKALANOS J J. A view to a kill: the bacterial type Ⅵ secretion system[J]. Cell Host Microbe, 2014, 15(1): 9-21. DOI:10.1016/j.chom.2013.11.008
[3]
BÖNEMANN G, PIETROSIUK A, MOGK A. Tubules and donuts: a type Ⅵ secretion story[J]. Mol Microbiol, 2010, 76(4): 815-821. DOI:10.1111/j.1365-2958.2010.07171.x
[4]
MA J L, BAO Y L, SUN M, et al. Two functional type Ⅵ secretion systems in avian pathogenic Escherichia coli are involved in different pathogenic pathways[J]. Infect Immun, 2014, 82(9): 3867-3879. DOI:10.1128/IAI.01769-14
[5]
王栋, 王少辉, 徐凤, 等. Ⅵ型分泌系统2核心组分ClpB对禽致病性大肠杆菌生物学特性及致病性的影响[J]. 中国兽医科学, 2016, 46(7): 834-840.
WANG D, WANG S H, XU F, et al. Effects of type Ⅵ secretion system 2 core component ClpB on the biological characteristics and virulence of avian pathogenic Escherichia coli[J]. Chinese Veterinary Science, 2016, 46(7): 834-840. (in Chinese)
[6]
丁雪燕, 张琪, 田延, 等. 禽致病性大肠杆菌CE129 Ⅵ型分泌系统主要亚单位基因hcp1、hcp2缺失株的构建与验证[J]. 中国预防兽医学报, 2018, 40(5): 381-385.
DING X Y, ZHANG Q, TIAN Y, et al. Construction of the type Ⅵ secretion system genes of hcp1 and hcp2 deleted strains from the avian pathogenic Escherichia coli CE129[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2018, 40(5): 381-385. (in Chinese)
[7]
DATSENKO K A, WANNER B L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97(12): 6640-6645. DOI:10.1073/pnas.120163297
[8]
薛藩, 韦慧仙, 胡珈玮, 等. 基因编辑方法研究进展——以大肠杆菌基因敲除方法为例[J]. 南京师大学报: 自然科学版, 2018, 41(3): 102-108.
XUE F, WEI H X, HU J W, et al. Progress in gene editing methods—Taking the E. coli gene knockout method as an example[J]. Journal of Nanjing Normal University: Natural Science Edition, 2018, 41(3): 102-108. (in Chinese)
[9]
LIU L Y, HAO S, LAN R T, et al. The type Ⅵ secretion system modulates flagellar gene expression and secretion in Citrobacter freundii and contributes to adhesion and cytotoxicity to host cells[J]. Infect Immun, 2015, 83(7): 2569-2604.
[10]
TANG Y, SUN Y J, ZHAO L M, et al. Mechanistic insight into the roles of Pseudomonas plecoglossicida clpV gene in host-pathogen interactions with Larimichthys crocea by dual RNA-seq[J]. Fish Shellfish Immun, 2019, 93: 344-353. DOI:10.1016/j.fsi.2019.07.066
[11]
DING X Y, ZHANG Q, WANG H, et al. The different roles of hcp1 and hcp2 of the type Ⅵ secretion system in Escherichia coli strain CE129[J]. J Basic Microb, 2018, 58(11): 938-946. DOI:10.1002/jobm.201800156

（编辑   白永平）