维生素K是动物体生命活动不可缺少的一种脂溶性维生素[1-2]，畜牧业中常用维生素K3作为畜禽维生素K补充剂[3]。维生素K具有多种生理功能，如参与凝血过程[4]、维持骨代谢稳态[5]、抑制血管钙化[6]等，其中，凝血作用是维生素K最经典也是最基本的生理作用。临床研究上常用凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)和凝血酶时间(thrombin time，TT)的长短诊断是否存在凝血功能障碍[7]，当机体缺乏维生素K时，部分凝血酶原无法活化将导致PT延长[8]。维生素K主要通过参与羧化维生素K依赖蛋白发挥生理作用，此过程中维生素K作为γ-谷氨酸羧化酶的辅助因子将维生素K依赖蛋白的特定谷氨酸残基转化为羧基谷氨酸残基[9]。目前，已发现多种维生素K依赖蛋白，如与凝血功能相关的凝血酶原前体蛋白(protein induced in the vitamin K absence or antagonism-factor Ⅱ，PIVKA-Ⅱ)[4]、与骨代谢中成骨细胞活性相关的骨钙素(osteocalcin，OC)[10]、与血管钙化及软骨发育相关的基质Gla蛋白(matrix gamma-carboxyglutamate protein，MGP)[11]，三种维生素K依赖蛋白在血液循环中的羧化不全形式常被用来评价机体凝血功能[12]、预测骨折[13]和血管钙化[14]风险，同样也可以作为评价维生素K营养状况的参照指标。美国NRC(1994)家禽营养需要标准和中国肉鸭饲养标准(2012)中推荐不同生长阶段北京鸭维生素K营养需要量分别为0.5和2.0 mg·kg-1，但目前尚未发现肉鸭维生素K试验研究作为理论支撑。同时，家禽饲粮中维生素K3实际添加量往往是美国NRC(1994)推荐量的数倍[15]。因此，本试验通过研究不同添加水平维生素K3对14日龄北京鸭凝血时间和维生素K依赖蛋白的影响，探讨血液中反映肉鸭维生素K营养状况的敏感指标，并采用折线模型估算育雏期北京鸭饲粮维生素K3适宜添加量，为肉鸭饲料配制中维生素K的合理有效使用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计及饲粮试验采用玉米-大豆分离蛋白型饲粮为基础饲粮，饲料原料常规营养成分参考中国饲料成分及营养价值表(2018)，基础饲粮营养水平参考中国肉鸭饲养标准(2012)，饲粮组成及营养水平见表 1。试验采用单因子完全随机试验设计，通过在基础饲粮中添加6个不同水平的亚硫酸氢钠甲萘醌(0、0.98、1.96、3.92、5.88和7.84 mg·kg-1，甲萘醌含量为51%)配制成6种维生素K3添加水平(0、0.5、1、2、3和4 mg·kg-1)的试验饲粮。将180只1日龄健康雄性北京鸭按照每处理每重复鸭只初始体重基本一致的原则随机分为6个处理，每个处理5个重复，每重复6只鸭，试验期为14 d。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis) |
试验鸭网上平养，自由饮水，自由采食相应的试验饲粮，24 h光照，育雏期舍内温度从1日龄32 ℃逐渐降低至14日龄26 ℃，每隔两天通过调整供暖设备温度和通风量的方式下调舍内温度1 ℃左右。
1.3 生长性能测定于14日龄，称取各处理组各重复鸭只空腹体重和剩余饲料重，计算1~14日龄鸭平均日增重(average daily gain，ADG)、平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和料重比(feed/gain，F/G)。
1.4 凝血时间测定于14日龄，从每处理每重复随机挑选试验鸭2只，使用无抗凝剂真空采血管颈静脉采血5 mL，立即精确吸取全血2.7 mL置于装有0.3 mL枸橼酸钠溶液的离心管中，3 500 r·min-1离心15 min，分离血浆，-80 ℃保存，并使用上海太阳UP1500全自动凝血分析仪测定PT、APTT和TT。
1.5 血清维生素K依赖蛋白测定采血管中剩余血液制备血清，于-20 ℃保存，用于测定血清PIVKA-Ⅱ、羧化不全骨钙素(undercarboxylated osteocalcin，ucOC)和羧化不全基质Gla蛋白(undercarboxylated matrix Gla protein，ucMGP)含量，三种血清维生素K依赖蛋白含量均采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)测定，使用BiotekEpoch酶标仪在450 nm波长下测定吸光度，并根据吸光度和标准曲线计算血清中维生素K依赖蛋白含量。分别采用上海酶联公司生产的PIVKA-Ⅱ、ucOC试剂盒和江苏酶免公司生产的ucMGP试剂盒进行指标测定。
1.6 统计分析试验数据用“平均值±标准差”表示，使用SAS 9.4软件进行统计分析，按照单因子完全随机试验设计应用GLM程序进行方差分析，运用Duncan氏法进行组间的多重比较，并且采用折线模型拟合曲线从而预测维生素K3需要量。
2 结果 2.1 不同维生素K3添加水平对1~14日龄北京鸭生长性能的影响如表 2所示，各处理组之间ADG、ADFI和F/G均无显著差异，因此饲粮中添加不同水平维生素K3对1~14日龄北京鸭ADG、ADFI和F/G均未产生显著影响(P>0.05)。
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表 2 不同维生素K3添加水平对1~14日龄北京鸭生长性能的影响 Table 2 Effects of different supplemental vitamin K3 levels on growth performance of Pekin ducks from 1 to 14 days of age |
如表 3所示，0和0.5 mg·kg-1维生素K3添加组PT显著高于2、3、4 mg·kg-1维生素K3添加组(P < 0.05)；不同维生素K3添加水平对APTT和TT均未产生显著影响(P>0.05)。
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表 3 不同维生素K3添加水平对14日龄北京鸭凝血时间的影响 Table 3 Effects of different supplemental vitamin K3 levels on coagulation time of 14-day-old Pekin ducks |
如表 4所示，0 mg·kg-1维生素K3添加组血清PIVKA-Ⅱ含量显著高于其他组(P < 0.05)；0 mg·kg-1维生素K3添加组血清ucOC含量显著高于2、3、4 mg·kg-1维生素K3添加组(P < 0.05)；不同维生素K3添加水平对血清ucMGP含量未产生显著影响(P>0.05)。
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表 4 不同维生素K3添加水平对14日龄北京鸭血清维生素K依赖蛋白的影响 Table 4 Effects of different supplemental vitamin K3 levels on serum vitamin K-dependent proteins of 14-day-old Pekin ducks |
如表 5所示，采用折线模型估算1~14日龄北京鸭维生素K3需要量，以PT、血清PIVKA-Ⅱ和ucOC含量为评价指标估算结果分别为2.00、0.56和1.27 mg·kg-1。
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表 5 折线模型估算1~14日龄北京鸭维生素K3需要量 Table 5 Evaluation of vitamin K3 requirements of Pekin ducks from 1 to 14 days of age by broken-line regression models |
多项研究发现，饲粮中添加维生素K3对各类畜禽及鱼类生长性能的影响较为有限，试验结果基本一致。Marchetti等[3]在生长育肥猪饲粮中添加不同水平的维生素K3，与未添加维生素K3的对照组相比，添加维生素K3组生长猪ADG、ADFI、F/G均无显著差异；Zhang等[16]研究发现，提高饲粮维生素K3添加水平对1~5周龄肉鸡生长性能无显著影响；Cheng等[17]在鱼类上的研究也表明，饲粮中添加维生素K3无法显著提高大黄鱼的生长速率。目前尚无饲粮添加维生素K3对肉鸭生长性能的研究，本试验结果显示，在玉米-大豆分离蛋白型基础饲粮中添加不同水平维生素K3对1~14日龄北京鸭ADG、ADFI和F/G均无显著影响，这与上述维生素K3对不同动物生长性能无显著影响的研究结果相符。因此，评价肉鸭维生素K营养状况还需要从维生素K对动物生理生化方面的影响为切入点进一步深入探究。
3.2 不同维生素K3添加水平对14日龄北京鸭凝血时间的影响维持机体正常凝血功能是维生素K最早被发现的生理功能，维生素K因此也被称为凝血性维生素[18]，在临床研究上常用PT、APTT和TT作为评价凝血时间的检测指标[7]，其中PT延长是由凝血酶原的缺乏导致的凝血时间延长，而维生素K与凝血酶原的活化有着直接的联系，因此，PT相较于另外两种凝血指标能够更加准确地反映由维生素K缺乏导致的凝血时间延长的情况[8, 19-20]。Ferland等[21]通过给雄性小鼠饲喂不同维生素K水平的饲粮，发现饲喂低维生素K水平饲粮组的小鼠PT较高维生素K水平组延长，但小鼠体重无显著差异。本试验结果显示，随着饲粮维生素K3添加水平的降低PT显著延长，APTT和TT无显著变化。这一结果表明，饲粮低维生素K3添加水平组中14日龄北京鸭由于维生素K缺乏导致PT延长，需要在基础饲粮中添加维生素K3增强育雏期肉鸭的凝血功能。
3.3 不同维生素K3添加水平对14日龄北京鸭血清维生素K依赖蛋白的影响维生素K发挥其生理生化作用的方式主要是通过作为γ-谷氨酸羧化酶的辅助因子参与羧化反应使维生素K依赖蛋白活化，获得生理活性[1]，目前已经发现的维生素K依赖蛋白主要包括PIVKA-Ⅱ、骨钙素和基质Gla蛋白[22]。PIVKA-Ⅱ也被用于评价机体凝血功能和维生素K营养状况[4, 20]，PIVKA-Ⅱ经维生素K羧化为具有生物活性的凝血酶原，从而参与凝血过程。研究表明，维生素K摄入量与血清PIVKA-Ⅱ水平呈高度负相关[23]，本试验结果也显示，饲粮添加维生素K3可显著降低14日龄北京鸭血清PIVKA-Ⅱ水平。
骨钙素作为骨形成标志物，同时是维生素K依赖蛋白，在骨骼矿化的生理过程中发挥重要的作用[24]，骨钙素由成骨细胞分泌后部分进入血液，当体内缺乏维生素K时，部分骨钙素无法羧化，失去结合羟基磷灰石能力[25-26]。Vergnaud等[27]研究发现，ucOC水平伴随着衰老会逐渐升高，并与骨折风险显著正相关；也有研究表明，在饮食中补充维生素K，血清ucOC水平较未补充组显著降低，增强骨形成，降低骨吸收能力[28]；ELISA法测定血清ucOC水平可预测中老年妇女髋骨骨折风险[13]。因此，血清ucOC水平也能够方便和灵敏地评价维生素K营养状况。本试验结果表明，饲粮添加维生素K3可显著降低血清ucOC含量，间接促进肉鸭骨骼发育并降低骨折风险。
基质Gla蛋白也是一种维生素K依赖蛋白，主要在软骨细胞和血管平滑肌细胞中表达和产生[29]，羧化基质Gla蛋白通过与钙晶体结合抑制异位矿化，在血管和软骨中起到抑制钙化的作用[30]，机体缺乏维生素K可能会导致患心血管疾病[11]。Cranenburg等[14]发现，患有心血管疾病或有血管钙化倾向的患者，其循环ucMGP水平明显较低。同样地，Silaghi等[31]采用ELISA法测定血清ucMGP含量，发现膝关节炎患者血清ucMGP水平显著低于非炎症组。本试验结果显示，饲粮添加维生素K3对14日龄北京鸭血清ucMGP含量无显著影响，这可能与机体维生素K缺乏程度未导致血管钙化和软骨异位钙化有关，有待进一步研究。
3.4 1~14日龄北京鸭维生素K3需要量的确定PT和PIVKA-Ⅱ均能较好地反映机体的凝血功能[7]，血清ucOC水平常被用来评估骨折风险[13]。本试验采用上述三个指标进行折线模型拟合需要量，结果显示，以PT和血清PIVKA-Ⅱ为评价指标拟合曲线的P值小于0.05，PT作为评价指标估算维生素K3需要量为2.00 mg·kg-1，在此维生素K3添加水平下肉鸭血清PIVKA-Ⅱ和ucOC可维持较低水平。因此，以PT为评价指标，采用折线模型估测1~14日龄北京鸭维生素K3需要量为2.00 mg·kg-1。
4 结论提高饲粮维生素K3添加水平可显著提高肉鸭凝血功能，降低PIVKA-Ⅱ、ucOC等维生素K依赖蛋白水平，并且以PT为评价指标，采用折线模型估测1~14日龄北京鸭维生素K3需要量为2.00 mg·kg-1。
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（编辑 范子娟）