2. 青藏高原动物遗传育种资源保护与利用国家教育部重点实验室, 成都 610041;
3. 动物科学国家民委重点实验室, 成都 610041
, YANG Lixue2
, YANG Manzhen1, HU Yulei3, YU Hailing1, YANG Luyu3, LI Jian1,2, XIONG Xianrong1,2
2. Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization of Ministry of Education, Chengdu 610041, China;
3. Key Laboratory of Animal Science of State Ethnic Affairs Commission, Chengdu 610041, China
犏牛是牦牛(Bos grunniens)与普通牛(Bos taurus)通过远缘杂交得到的F1代，按生产功能可分为乳用、肉用和役用犏牛等。牦牛生产性能低下，普通牛又无法适应青藏高原恶劣的高寒低氧环境，而犏牛具有显著的杂种优势，其体格大、生长快，产奶和产肉性能与牦牛相比都具有显著的优势，且具有良好的高原适应性[1-3]，深受藏区牧民喜爱。但犏牛雄性不育的缺陷，使得无法通过横交固定其杂种优势，这严重阻碍了杂种优势的利用[4-5]。因此，解析雄性犏牛不育对提高青藏高原畜牧生产水平、改善牧民生活品质和发展青藏高原特色畜牧产业都具备巨大的潜在价值。
ESCO2是一种黏连蛋白乙酰基转移酶，其主要功能是在S期介导黏连蛋白复合体中染色体结构维持蛋白2(SMC3)亚基的乙酰化，而黏连蛋白复合体在Sororin的作用下将姐妹染色单体束缚在一起，可确保它们在细胞分裂过程中准确对齐和分离[6-9]，是细胞分裂过程中黏连蛋白复合体乙酰化和着丝粒结合的必要条件[10]。人ESCO2基因的突变会导致一种常染色体隐形遗传疾病——罗伯茨综合征(Roberts syndrome, RBS)，其患者表现为出生前和出生后发育迟缓，颅面、小头、肢体畸形和精神缺陷[11-12]。Hogarth等[13]研究发现，ESCO2是哺乳动物有丝分裂到减数分裂过渡的潜在调节因子，在特异性敲除不孕小鼠卵巢[14]和低生殖力鲶鱼性腺[15]中表现为下调。小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中，ESCO2通过与组蛋白H4结合并介导H4K16乙酰化来调节纺锤体组装检查点(SAC)，耗竭ESCO2会导致极体的提前排出，并造成非整倍体卵的产生[16-18]。ESCO2能够修复双链染色体的断裂，在雄性减数分裂中发挥重要的作用，其异常表达可引起精子发生障碍和雄性不育[16]。Mcnicoll等[19]的研究揭示，ESCO2是雄性配子发生过程中必不可少的调节因子，特异性敲除ESCO2导致雄性小鼠不育。然而，关于ESCO2基因的研究主要集中在小鼠和人，该基因近期在犏牛和牦牛上的相关研究尚未见报道。
本研究以犏牛为研究对象，利用RT-PCR技术克隆获得犏牛ESCO2编码区完整序列，并对该序列进行生物信息学分析，同时采用qRT-PCR和IHC染色检测其在犏牛各组织及不同发育阶段睾丸组织中的表达，以期为揭示ESCO2在减数分裂中的作用及调控精子发生机制提供参考，为进一步从分子水平解析犏牛雄性不育机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物与样品采集动物样品采自成都市周边牦牛屠宰场，健康犏牛和牦牛宰杀后立即使用无菌剪采集心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、胃、肌肉、脂肪和附睾组织，随后采集睾丸组织，根据年龄分为胎牛时期(5~6月龄)、幼年时期(1~2岁)和成年时期(3~4岁)。以上所有样本每组各取3头为生物学重复，采集的样本使用高压灭菌处理的生理盐水冲洗剪成0.5 cm×0.5 cm× 0.5 cm的组织块，部分置于液氮罐中带回实验室，于－80 ℃保存备用；部分使用4%多聚甲醛固定，用于免疫组织化学染色。
1.2 组织总RNA的提取与反转录犏牛和牦牛的组织经液氮快速研磨后，使用Trizol Reagent(Invitrogen，美国)进行总RNA的提取，使用紫外分光光度计(Biospec-nano，日本)检测RNA的浓度和纯度，选取OD260 nm/OD280 nm介于1.8~2.0的RNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，备用。根据RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒(Thermo Scientific，美国)使用说明合成第一链cDNA，置于－20 ℃保存备用。
1.3 引物的设计与基因克隆从NCBI数据库中选取野牦牛(Bos mutus)ESCO2基因预测序列(登录号：XM_005900074)和β-actin基因序列(登录号：DQ838049.1)，使用Primer Premier 5软件设计引物(表 1)，并送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成。以睾丸组织cDNA为模板，利用RT-PCR技术在PCR仪(Applied Biosystems，美国)扩增犏牛ESCO2基因CDS区序列，PCR扩增体系为25 μL：2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)12.5 μL，模板1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，30个循环；72 ℃彻底延伸5 min，4 ℃保存。使用浓度为1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后，按照胶回收试剂盒(康宁生命科学有限公司)说明对目的扩增产物进行纯化回收，交由生工生物工程(上海)股份有限公司成都测序实验室测序。
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表 1 PCR引物序列及产物长度 Table 1 PCR primer sequences and products length |
利用ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找犏牛ESCO2克隆序列开放阅读框并翻译成氨基酸序列，采用EMBOSS Needle(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)在线软件比对犏牛和牦牛ESCO2基因CDS区核苷酸序列。采用T-COFFEE(http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/index.html)在线软件并结合Jalview软件多重比较犏牛和牦牛与其他物种的氨基酸序列，通过MEME(https://meme-suite.org/meme/)在线工具分析查找具有高度保守性的基序，并用MEGA7软件构建ESCO2蛋白的NJ系统发生树。利用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)、ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)、InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)和SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线软件进行ESCO2蛋白基本理化性质、功能结构域和信号肽分析。通过SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)、SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)和STRING 11.0(https://string-db.org/)在线工具预测ESCO2蛋白二级结构、三级结构和互作蛋白。
1.5 犏牛ESCO2基因的组织表达谱以β-actin为内参基因，通过实时荧光定量仪(Bio-Rad，美国)检测ESCO2基因在犏牛各组织(心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、胃、肌肉、脂肪、附睾和睾丸组织)中的表达量并进行表达谱分析，及其在不同时期(胎牛时期、幼年时期和成年时期)犏牛和牦牛睾丸组织中的表达量。20 μL反应体系如下：2×NovaStart SYBR qPCR Super Mix plus 10 μL，cDNA 1 μL, 上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR扩增条件如下：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性20 s，60 ℃退火1 min，39个循环；熔解曲线为65~95 ℃每10 s增加0.5 ℃。
1.6 免疫组织化学染色检测ESCO2在犏牛及牦牛睾丸中的定位将犏牛和牦牛胎牛时期、幼年时期和成年时期的睾丸组织从4%多聚甲醛组织固定液中取出，制作不同发育时期睾丸石蜡切片。依次将切片放入二甲苯中脱蜡，使用梯度酒精洗涤后，置于EDTA抗原修复缓冲液(pH 9.0)的修复盒中，在微波炉中加热进行抗原修复；切片自然冷却后在PBS中晃动洗涤后放入3%双氧水溶液中阻断内源性过氧化物酶；3%BSA均匀覆盖组织室温封闭30 min后，滴加一抗(多克隆兔抗ESCO2，1∶100稀释，博奥森)4 ℃孵育过夜；使用PBS洗涤玻片3次后，滴加相应种属的二抗(辣根过氧化物酶标记)覆盖组织，室温孵育50 min；PBS洗涤后滴加新鲜配置的DAB显色液显色，自来水冲洗切片终止显色；苏木精复染3 min左右，复染细胞核；依次将切片放入梯度酒精和二甲苯脱水透明后，使用中性树胶封片。使用激光共聚焦显微镜(Zeiss，德国)观察并拍照。
1.7 数据统计分析采用2-ΔΔCt法对qRT-PCR结果进行计算，所有试验数据使用“平均值±标准误(Mean±SEM)”表示。使用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。每组试验至少重复3次。
2 结果 2.1 犏牛和牦牛ESCO2基因CDS区序列特征分析本研究以犏牛和牦牛睾丸组织cDNA为模板，F1、R1为上下游引物，对ESCO2基因的CDS区进行扩增，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，目标条带与预期结果一致(图 1)。经测序获得犏牛2 742 bp的核苷酸序列，其犏牛ESCO2基因CDS长度为1 833 bp，可编码610个氨基酸；牦牛2 690 bp的核苷酸序列，其牦牛ESCO2基因CDS长度为1 776 bp，可编码591个氨基酸。犏牛与牦牛ESCO2基因CDS区核苷酸序列的比对结果显示共有7处变化，同源性为96.6%，其中在第4处犏牛比牦牛多57个碱基，导致氨基酸序列N端第301~319位多编码19个氨基酸，第2处C→T突变，编码的亮氨酸变为苯丙氨酸，第3处G→A突变，编码的甘氨酸变为天冬氨酸，第6处C→T突变，编码的苏氨酸变为甲硫氨酸，另外3处均为同义突变。犏牛ESCO2蛋白的分子量、等电点和分子式分别为69 049.02、9.36和C3038H4890N852O927S27；牦牛ESCO2蛋白的分子量、等电点和分子式分别为66 781.62、9.48和C2947H4755N827O890S24。犏牛和牦牛ESCO2蛋白均不含信号肽且无跨膜结构域。
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M. DNA相对分子质量标准; 1. 犏牛ESCO2基因扩增产物; 2. 牦牛ESCO2基因扩增产物; 3. 空白对照; 4. 犏牛β-actin扩增产物 M. DL5000 marker; 1.PCR product of cattle-yak ESCO2 gene; 2. PCR product of yak ESCO2 gene; 3. Black control; 4. PCR product of cattle-yak β-actin gene 图 1 犏牛和牦牛ESCO2基因的PCR扩增结果 Fig. 1 PCR amplification results of cattle-yak and yak ESCO2 gene |
多重比较犏牛和其它14种哺乳动物ESCO2蛋白的氨基酸序列，结果发现，犏牛与黄牛的氨基酸序列同源性最高(100%)，依次为水牛(98.69%)、牦牛(96.39%)、山羊(96.23%)、抹香鲸(88.07%)、猪(84.80%)、单峰驼(84.31%)、家马(84.20%)、灰熊(81.43%)、家猫(80.46%)、家犬(76.80%)、家兔(76.62)、智人(76.26%)和小鼠(67.59%)。通过MEME软件在线分析获得ESCO2蛋白最保守的3个基序，分别位于犏牛ESCO2氨基酸序列N端第383~432、434~483和526~565位点，对比发现不同物种ESCO2蛋白对应基序氨基酸序列具有高度保守性。使用MEGA7软件分析15种哺乳动物的氨基酸序列并构建NJ系统发生树，发现犏牛和黄牛聚为一支，在进化上与水牛、牦牛和山羊亲缘关系较近，与其他物种较远，这与同源性结果一致(图 2)。
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图 2 ESCO2蛋白氨基酸序列系统进化树 Fig. 2 Phylogenetic tree for ESCO2 amino acid sequences |
采用SOPMA预测ESCO2蛋白的二级结构，犏牛340个氨基酸(55.74%)形成无规则卷曲、125个氨基酸(20.49%)形成α螺旋、119个氨基酸(19.51%)形成延伸链和26个氨基酸(4.26%)形成β转角(图 3A)；通过SWISS-MODEL预测到犏牛ESCO2蛋白分子三级结构(图 3B)。采用STRING数据库分析犏牛ESCO2潜在相互作用蛋白显示，ESCO2可能与SMC3、SMC1A、PDS5A、PDS5B、STAG2等蛋白存在相互作用(图 3C)。GO分析显示，ESCO2蛋白互作网络中蛋白质能够参与姐妹染色单体凝聚、减数分裂细胞周期、DNA修复、细胞分裂和染色体重构等生物学过程。
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A. 犏牛ESCO2蛋白二级结构；B. 犏牛ESCO2蛋白三级结构；C. 犏牛ESCO2的蛋白互作网络 A. Secondary structure of cattle-yak ESCO2 protein; B. Tertiary structure of cattle-yak ESCO2 protein; C. Interaction network for cattle-yak ESCO2 protein 图 3 犏牛ESCO2蛋白的空间结构及互作蛋白 Fig. 3 Spatial structure and interaction proteins of cattle-yak ESCO2 protein |
以β-actin作为内参基因，利用qRT-PCR技术检测ESCO2基因在犏牛肌肉、脂肪、睾丸、附睾、心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、胃组织中的相对表达水平(图 4)。结果显示，犏牛ESCO2 mRNA在各个组织中均有表达，其中睾丸组织表达最高，显著高于其他组织(P < 0.05)。
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不同的字母表示差异显著(P < 0.05)。下同 Different letters represent the significant differences(P < 0.05). The same as below 图 4 ESCO2 mRNA在犏牛各组织的表达谱 Fig. 4 Tissue expression profile of ESCO2 mRNA in cattle-yak |
以β-actin作为内参基因，检测犏牛和牦牛胎牛时期、幼年时期和成年时期睾丸中ESCO2基因的相对表达水平(图 5)。结果显示，ESCO2 mRNA的表达在犏牛和牦牛不同发育时期睾丸中均呈上升趋势；5~6月龄犏胎牛睾丸中的表达量低于牦胎牛，差异不显著(P＞0.05)，但1~2岁和3~4岁犏牛睾丸中ESCO2 mRNA的表达量显著低于同时期牦牛(P < 0.05)。
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图 5 ESCO2 mRNA在不同发育阶段牦牛和犏牛睾丸中的表达规律 Fig. 5 Expression patterns of ESCO2 mRNA in testis at different developmental stages of cattle-yak and yak |
免疫组织化学技术检测ESCO2在犏牛和牦牛不同年龄阶段睾丸组织中的定位和表达(图 6)，其中细胞着色为棕黄色或者黄色判定为阳性信号，颜色越深说明蛋白表达水平越高。结果显示，ESCO2蛋白在犏牛各年龄段睾丸组织中均有表达。其中胎牛睾丸组织中，ESCO2蛋白主要定位于支持细胞(SC)，在精原干细胞(SSC)几乎不表达，与同时期牦牛一致；幼年和成年时期犏牛睾丸组织中，生精小管发育不良，管径小且管壁皱缩，无次级精母细胞(SS)和精子细胞，在支持细胞、精原细胞(SP)和间质细胞(IC)检测到ESCO2蛋白阳性信号，与同时期牦牛相比，犏牛初级精母细胞(PS)数量少且细胞核皱缩，无ESCO2蛋白阳性信号。
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SP. 精原细胞; PS. 初级精母细胞; SS. 次级精母细胞; SC. 支持细胞; IC. 间质细胞; MC. 肌样细胞; RS. 圆形精子细胞; ES. 长形精子细胞 SP. Spermatogonium; PS. Primary spermatocyte; SS. Secondary spermatocyte; SC. Sertoli cell; IC. Leydig cell; MC. Myoid cell; RS. Round spermatid; ES. Elongating spermatid 图 6 不同阶段雄性犏牛和牦牛生殖细胞发育及ESCO2蛋白定位 Fig. 6 The growth of male cattle-yak and yak germ cells and localization of ESCO2 protein at different stages |
在哺乳动物精子发生过程中，蛋白质的乙酰化能调控减数分裂，其异常会导致雄性生殖力下降[20]。其中ESCO2是一种非组蛋白乙酰基转移酶，能调节减数分裂过程中姐妹染色单体的分离，是哺乳动物配子发生所必须的[21-23]。因此，探索ESCO2在睾丸中的表达规律对于解析犏牛雄性不育机制具有重要的研究价值。
本研究克隆获得犏牛和牦牛ESCO2完整CDS区序列，并对其编码蛋白的结构和功能进行了预测和分析。对犏牛和牦牛ESCO2编码区序列进行对比，发现犏牛增加了57个碱基并有3处错义突变。基因的错义突变能够改变多肽链的氨基酸种类从而使蛋白质结构和功能发生改变并造成疾病，如白化病、镰刀型贫血病和早衰症等[24-26]，ESCO2基因的突变在人当中能够造成罗伯茨综合征[27]，而犏牛与牦牛ESCO2蛋白的差异是否改变蛋白功能有待进一步研究。鉴于ESCO2蛋白主要通过与相应蛋白结合发生作用，本研究进一步分析犏牛ESCO2的互作蛋白，发现与SMC3、SMC1A、PDS5A等10个蛋白存在相互作用。其中，SMC1A、SMC1B、SMC3、RAD21和STAG2是黏连蛋白复合体的组成亚基，有研究表明，ESCO2能够介导SMC3的去乙酰化[6]，黏连蛋白复合体具有细胞分裂过程中凝聚姐妹染色单体的作用，姐妹染色单体内聚力的过早丧失会导致染色体的错误分离[28-29]。Al-Jomah等[30]的研究表明，PDS5A和PDS5B是一种富含HEAT重复序列的蛋白质，可与黏附素结合并介导姐妹染色单体黏附，PDS5与WAPL直接相互作用，在有丝分裂过程中去除黏附素，它们的丢失会导致DNA损伤。精母细胞和卵母细胞中NIPBL与黏连蛋白复合体有相同的定位，人NIPBL基因的突变能够导致德朗热综合征[31-32]。本研究发现，犏牛与牦牛ESCO2基因和编码蛋白存在差异，并对其结构和互作蛋白进行了预测，这些与犏牛ESCO2互作的潜在蛋白均在细胞有丝分裂和减数分裂中扮演不同的角色，这对于下一步解析ESCO2在雄性犏牛不育中的分子机制提供了新的见解和思路。
组织表达谱分析显示，ESCO2 mRNA在各组织中均有表达，其中睾丸、脾、大肠、小肠和胃中表达较高。该结果与现有研究结果一致，已报道ESCO2在人睾丸、骨髓、各级消化道组织中表达较高，在褐家鼠睾丸、脾和胸腺中具有较高的表达量[33-34]。Chen等[35]研究揭示，ESCO2能够抑制细胞增殖并诱导胃癌细胞凋亡，在大肠癌中亦可抑制肿瘤转移[36]，而ESCO2在犏牛和人各消化道组织中高表达，推测能够维持消化道细胞的正常功能，其具体作用机制有待进一步研究。ESCO2在人、褐家鼠、犏牛等物种睾丸中高表达，因此推测其在雄性生殖中发挥了重要作用。
本试验发现，ESCO2在犏牛睾丸中的表达量随着生殖发育呈上升趋势，在各年龄阶段犏牛睾丸中ESCO2的表达量均低于牦牛。有研究报道，在小鼠卵巢和睾丸中特异性敲除ESCO2能够造成生殖力下降[14, 19]，在低生殖力动物的性腺中ESCO2也表现出低表达[15]，因此推测，雄性犏牛ESCO2的低表达也能造成生殖力的下降。为进一步探讨ESCO2在睾丸中发挥的功能，利用IHC染色对比分析ESCO2在犏牛和牦牛睾丸中的细胞定位和表达水平，观察到雄性犏牛减数分裂阻滞于初级精母细胞，生精小管内只能观察到支持细胞、精原细胞和少量初级精母细胞，这与前人报道一致[2, 37-39]。Evans等[16]的研究表明，ESCO2蛋白定位于减数分裂Ⅰ期精母细胞染色体上，本试验在牦牛初级精母细胞检测到阳性信号，但犏牛初级精母细胞上未检测到表达和定位，可能ESCO2在犏牛初级精母细胞上的缺失是造成减数分裂阻滞的原因之一。此外，在精原细胞、次级精母细胞、支持细胞和间质细胞中也检测到ESCO2蛋白定位，推测ESCO2在雄性生殖中还发挥了多种生物学功能。山羊精原干细胞中过表达ESCO2基因能够促进细胞进入减数分裂[40]，而犏牛精原细胞上ESCO2蛋白阳性信号也弱于牦牛，提示ESCO2蛋白在犏牛精原细胞上的低表达可能导致初级精母细胞减少。综上推测，ESCO2是精子发生中重要的功能基因，而犏牛睾丸中的低表达可能是导致减数分裂阻滞的原因之一。
4 结论本试验成功获得了犏牛和牦牛的ESCO2基因序列，发现ESCO2基因在睾丸组织中表达最高，其在成年期睾丸中的表达量高于幼年期和胎牛期，犏牛睾丸组织中ESCO2 mRNA表达水平显著低于同时期牦牛，该蛋白在犏牛和牦牛睾丸组织中存在差异定位，表明ESCO2基因与雄性生殖相关。本研究为进一步探讨犏牛雄性不育的机制和ESCO2基因在雄性生殖系统中的调控机制提供了试验依据。
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(编辑 郭云雁)