马和驴虽同属于马属动物，但遗传特征、生理和行为特点等多方面存在差异。血液是动物机体的一种重要体液，研究显示，马与驴的血红蛋白结构和凝血类型均有所区别^[1-3]。驴的红细胞数、红细胞压积和血清总胆红素水平显著比马的低，而驴的平均红细胞体积和血清甘油三酯水平显著高于马^[4-5]。马和驴的血清/血浆中含有约7%的蛋白质^[6]，这些蛋白质来源于机体的各种细胞和组织，发挥着维持血液的正常渗透压、黏度和酸碱度以及免疫调节等重要功能，能够直接反映机体的生理和病理状态。

蛋白质组学技术是近年来生命科学领域兴起的重要研究手段之一，利用该技术可以对血清/血浆蛋白质组成特征进行详细分析，能够有效推动新的蛋白质生物标记物的发现，利于提高疾病临床诊断效率^[7]。蛋白质组学技术已在马属动物的血清/血浆蛋白质组研究中取得一定进展。以往研究利用双向凝胶电泳结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)方法建立了马血清蛋白质图谱^[8-9]，评估了马耐力运动前后血浆蛋白质的特征变化^[10]。Han等^[11]使用Label-free定量蛋白质组学方法揭示了健康驴血清蛋白质组成特征，但关于马和驴血清蛋白质组成的精确特征差异仍不清楚。

本研究应用Label-free定量蛋白质组学技术对马和驴血清蛋白质组成差异进行详细比较分析，旨在探究马属动物血清蛋白质生物学特征，为进一步揭示马属动物种间生理特征差异和有效保障健康提供参考依据。

1 材料与方法 1.1 试验动物

本试验在辽宁省大连市某集约化养殖场，根据体况评分与兽医检查记录，选择9匹蒙古马和9头辽西驴^[12]，雌性，年龄4~10岁，均处于正常发情周期的间情期，健康无病、精神状态及采食状况良好。马和驴分别提供相同的饲养条件，日粮由玉米秸秆、谷草、玉米、麸皮、豆粕、矿物质、维生素和水组成，每日分3次饲喂。血液样品在上午9:00—10:00点采集，每个个体采集1次。采用颈静脉采血方式，使用10 mL无抗凝剂真空管(BD Vacutainer，美国)收集血液。在4 ℃以3 000×g离心10 min以分离血清，无黄疸、溶血、脂血现象发生，血清于－80 ℃保存备用。

1.2 主要试剂

裂解液、SDS(十二烷基硫酸钠)、DTT(二硫苏糖醇)、Tris-HCl(三氨基甲烷盐酸盐)、蛋白酶抑制剂、碳酸氢铵(NH₄HCO₃)、甲酸、乙腈、氨水、碘乙酰胺(IAA)、二硫苏糖醇(DTT)、尿素(UA)、胰蛋白酶、三氟乙酸(TFA)。

1.3 血清蛋白质提取

为了避免个体差异对试验结果的影响，将马和驴的各9份血清样品分别随机分成3组，每组内的3份血清样品均匀混合成1个生物学重复，从而马和驴各获得3个生物学重复的血清样品(马为H1、H2、H3，驴为D1、D2、D3)。

每个血清样品中加入1 mL裂解液(4% SDS，100 mmol·L^-1 DTT，100 mmol·L^-1 Tris-HCl)裂解，对应加入1%体积蛋白酶抑制剂，混匀。4 ℃下2 000×g·min^-1离心40 min，取上清液。使用BCA法进行蛋白质浓度定量，－80 ℃保存。

1.4 血清蛋白质酶解

每个样品各取300 μg，加入终浓度为100 mmol·L^-1 DTT，沸水浴5 min，冷却至室温后迅速加入200 μL UA缓冲液混匀，转入10 ku超滤离心管中，12 000×g离心15 min，弃滤液，再按相同条件重复离心并过滤一次。加入100 μL 50 mmol·L^-1的IAA缓冲液，600×g振荡1 min，室温避光孵育30 min，12 000×g离心10 min。加入100 μL UA缓冲液，12 000×g离心10 min，重复离心两次。加入100 μL NH₄HCO₃缓冲液，1 400×g离心10 min，重复离心两次。加入40 μL胰蛋白酶缓冲液(胰蛋白酶：NH₄HCO₃缓冲液=3 μg: 20 μL)，600×g振荡1 min，37 ℃孵育16~18 h。换新收集管，12 000×g离心10 min，收集滤液，加入适量0.1% TFA，酶解后的肽段使用C18小柱脱盐，真空冻干。酶解后的肽段干燥后用0.1%甲酸溶液复溶，肽段浓度测定，以备液相色谱-串联质谱分析。

1.5 液相色谱-串联质谱分析血清蛋白质组分

酶解产物采用纳升流速Easy nLC 1 200色谱系统进行分离。A液为0.1%甲酸溶液，B液为0.1%甲酸乙腈水溶液。每个样品由自动进样器上样到捕集柱C18 trap column (100 μm×20 mm×5 μm)，再经过分析柱C18 column (75 μm×150 mm×3 μm)分离，色谱柱以95%的A液平衡，流速为300 nL·min^-1。相关液相梯度：前2 min，B液线性梯度从5%到8%；90 min，B液线性梯度从8%到23%；100 min，B液线性梯度从23%到40%；108 min，B液线性梯度从40%到100%；最后12 min，B液维持在100%。酶解产物经毛细管高效液相色谱分离后，Q-Exactive Plus质谱仪(Thermo Scientific)进行质谱分析。过柱时长120 min，离子化后均带一个单位正电荷；母离子扫描范围：300~1 800 m·z^-1。

1.6 血清蛋白质序列数据库检索与鉴定

使用Max Quant 1.6.0.16软件对所得质谱数据进行分析，先对质谱数据进行从头测序计算，然后再进行数据库搜索。参数设置：酶解蛋白为胰蛋白酶；固定修饰选择烷基化修饰，可变修饰为氧化修饰和乙酰化修饰；母离子质量数最大容许误差范围为±20.0 ppm；数据库为Uniprot，物种为Equus caballus(马)和Equus asinus(驴)；FDR值＜1%，并至少含有1个以上肽段的蛋白质为成功鉴定蛋白质。

1.7 血清差异蛋白质筛选及功能分析

应用R语言等生物信息学分析软件对马和驴血清中的差异蛋白质进行筛选。当差异倍数达到1.5倍及以上(即上调≥1.5倍和下调≤0.66倍)，且经过显著性统计检验其P值≤0.05时，才认定为显著差异表达蛋白质。通过Perseus^[13]软件对显著差异表达蛋白质进行GO(gene ontology)功能富集分析。利用KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes) pathway数据库进行差异表达蛋白质信号通路富集分析。STRING (http://string-db.org)数据库进行蛋白质互作分析。

2 结果 2.1 马和驴血清蛋白质浓度测定

通过BCA法结合酶标仪测定样品吸光值，并计算出血清样品蛋白质浓度。马的血清样品中H1蛋白质浓度最高，为12.49 μg·μL^-1，H3蛋白质浓度最低，为11.54 μg·μL^-1；驴的血清样品中D2蛋白质浓度最高，为14.19 μg·μL^-1，D3蛋白质浓度最低，为12.30 μg·μL^-1，如表 1所示。

2.2 马和驴血清蛋白质鉴定

马和驴的血清中共鉴定出361种蛋白质，其中马的血清中鉴定出288种蛋白质，分子量范围为1.52~ 511.24 ku；驴的血清中鉴定出244种蛋白质，分子量范围为1.53~611.47 ku；马和驴血清中鉴定出的相同蛋白质有171种。在鉴定出的361种蛋白质中，有121种蛋白质的分子量范围为10~30 ku，96种为30~50 ku，55种为50~70 ku，40种为70~100 ku，33种大于100 ku以及16种小于10 ku(图 1)。

2.3 马和驴血清差异表达蛋白质

对鉴定出的蛋白质进行差异表达分析，共获得231种显著差异表达蛋白质(fold change≥1.5, P≤ 0.05)，驴比马上调的血清蛋白质有99种，驴比马下调的血清蛋白质有132种。231种显著差异表达蛋白质中，109种蛋白质仅在马血清中特异表达，69种蛋白质仅在驴血清中特异表达。

2.4 马和驴血清差异表达蛋白质的生物信息学分析

2.4.1 GO功能分析 　　GO对基因功能进行分类，共涵盖3个基因本体，分别为生物学过程(biological process)、细胞组分(cellular component)和分子功能(molecular function)。差异表达蛋白质共涉及到的生物学过程如图 2所示。差异表达蛋白质主要参与的生物学过程包括蛋白质激活(protein activation cascade)、补体激活(complement activation)、免疫应答(immune response)、凝血(blood coagulation)以及脂蛋白氧化调控(regulation of lipoprotein oxidation)等过程；细胞组分方面，差异表达蛋白质主要定位于胞外区域(extracellular region)、胞外区域部分(extracellular region part)、细胞外泌体(extracellular exosome)、胞外囊泡(extracellular vesicle)和胞外细胞器(extracellular organelle)等；差异表达蛋白质的分子功能有糖蛋白结合(glycoprotein binding)、细胞外结合基质蛋白(extracellular matrix binding)、poly—A-RNA结合(poly(A) RNA binding)、MHCⅡ类蛋白复合体结合(MHC class Ⅱ protein complex binding)、糖胺聚糖结合(glycosaminoglycan binding)、肽聚糖结合(peptidoglycan binding)和果糖结合(fructose binding)等。

2.4.2 KEGG通路分析 　　利用KEGG数据库进行通路分析表明，差异表达蛋白质共涉及到14条通路，根据显著差异P值排序前10条通路见图 3。富集最显著的通路为补体和凝血级联(complement and coagulation cascades)，吞噬体(phagosome)，内质网蛋白质加工(protein processing in endoplasmic reticulum)，抗原加工递呈(antigen processing and presentation)，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢(glycine, serine and threonine metabolism)，癌症蛋白多糖(proteoglycans in cancer)等。

2.5 马和驴血清差异表达蛋白质互作分析

利用STRING软件对鉴定出的231种血清差异表达蛋白质进行蛋白质互作网络分析，结果如图 4所示。互作网络被用来表示差异表达蛋白质之间的生物交联，球形代表输入的差异蛋白质，蛋白质间的关联用线形表示，连线越多，代表该蛋白质处于相对重要的位置或该蛋白质的研究相对较多。血清差异表达蛋白质紧密相连富集最为显著的功能模块主要为代谢途径、补体和凝血级联、吞噬体，且这3个模块与KEGG注释结果重叠，表明马和驴在其功能上的差异。大部分蛋白质至少与其中一个蛋白质存在相互作用，HSP90AA1、HSPA8、APOD、APOM、SERPING1、MASP1、CALR、TUBA1B、TUBB等处在关系互作网的重要节点。

3 讨论

本研究应用Label-free定量蛋白质组学技术比较了马和驴血清蛋白质组成特征差异，共鉴定出231种差异表达蛋白质，为今后深入研究马属动物种间生理特征差异提供了一定理论基础。前期研究应用双向凝胶电泳结合MALDI-TOF MS等方法，表明马的不同品种之间^[14]、马属动物不同物种之间的血清蛋白质组分具有不同特征。马和驴杂交形成的马骡，血清蛋白质组成特征更接近于驴^[15]。Label-free定量蛋白质组学技术，即光谱计数，根据二级质谱相关的每个蛋白质鉴定到的肽段总次数和所鉴定肽段的离子价位等信息进行定量分析，是一种相对更为精确的高通量蛋白质组分定量分析方法^[16]。

热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是一类在哺乳动物中广泛存在的内源性保护蛋白质，该蛋白质家族在引导新生蛋白质的初始折叠和部分变性结构的重折叠中发挥关键作用，能够保护细胞免受应激损害^[17-18]。HSP90和HSPA是热休克蛋白家族中两个高度保守的依赖ATP的分子伴侣，在遇到外界不利因素刺激和环境变化时主要通过促进蛋白质的合成和改变其空间结构来保护机体，直接或间接参与肿瘤的发生、免疫系统功能的调节、伤口愈合、细胞分化和转运、生殖细胞活性调节等过程^[19]。本研究结果显示，HSP90和HSPA8仅在马血清中特异性表达，且这两个蛋白质显著富集在内质网蛋白质加工和抗原加工递呈等通路中，揭示驴对外界环境的刺激反应可能没有马强烈。事实上，与马相比，驴对疼痛的反应和疾病临床症状表现相对不明显^[20]，因此生产中更应注重对驴的健康管理。

脂蛋白(lipocalin)超家族是一类可以结合和运输各种外源性和内源性配体的蛋白质。其中，载脂蛋白D(apolipoprotein D, APOD)是一种糖基化蛋白质，作为高密度脂蛋白的组成部分与脂质代谢和神经保护密切相关。APOD主要参与脂质运输、食物摄取、炎症、抗氧化反应和发育以及在不同类型癌症中发挥作用^[21-23]。载脂蛋白M(apolipoprotein M，APOM)是一种新型的抗动脉粥样硬化蛋白质，主要存在于高密度脂蛋白(HDL)和微量低密度脂蛋白(LDL)中。研究表明，载脂蛋白通过逆转胆固醇转运在HDL代谢中发挥重要作用，对LDL氧化和动脉粥样硬化具有保护作用^[24-25]。APOM还与高脂血症有关^[26]。研究发现，驴的血脂异常比马更为常见^[27]。本研究结果表明APOD和APOM在驴血清中的表达量显著高于马，且主要参与脂蛋白氧化调控以及免疫系统反应等生物学过程，可能与驴比马更易患高血脂症有关，因此生产中更应注意驴对脂类物质的代谢调控与管理。

甘露聚糖结合凝集素丝氨酸肽酶1(mannan-binding lectin serine peptidase 1, MASP1)是补体系统中的核心蛋白酶之一，是凝集素途径激活所必需的。据报道，MASP1可以增加促炎细胞因子(如IL-6和IL-8)的产生，并诱导趋化作用，从而促进中性粒细胞的功能。补体凝集素与中性粒细胞通过内皮细胞的协同作用可能是增强抗微生物免疫应答的有效途径。MASP1可能也参与了百日咳等疾病过程^[28]。丝氨酸G家族成员1(serpin family G member 1, SERPING1)是一种蛋白酶抑制剂，属于丝氨酸蛋白酶家族，其中心功能是通过抑制其亚成分C1R和C1S的蛋白水解活性来调节C1，从而对补体级联有下游效应。功能失调的SERPING1阻止了C1补体系统的自动激活，并减弱了纤溶酶、激肽释放酶和凝血因子XIIa、XIIf和XIa等酶类的产生^[29]。本研究结果显示，MASP1和SERPING1显著富集在补体和凝血级联通路中，两者在驴血清中的表达水平显著高于马，表明驴可能具有更强的免疫耐受机能。

钙网蛋白(calreticulin, CALR)是一种多功能蛋白质，主要定位于内质网，参与内质网糖蛋白折叠和钙稳态，以及细胞增殖、吞噬和凋亡等功能^[30]。微管蛋白(tubulin)是构成微管的结构单元，是细胞骨架的主要成分，对细胞内运输、染色体分离和细胞迁移等许多细胞过程发挥重要作用^[31]。微管蛋白包括α-、β-、γ-、δ-和ε-共5种不同形式的成员。微管蛋白α1b (tubulin alpha-1D chain, TUBA1B)，也称为K-ALPHA-1，是一种蛋白质编码基因^[32]。I级微管蛋白(tubulin beta class Ⅰ, TUBB)是β-微管蛋白编码基因之一，在发育中的中枢神经系统和皮肤中广泛表达^[33]。本研究结果显示，CALR广泛富集于吞噬体、抗原加工递呈和内质网蛋白质加工通路中，TUBA1B和TUBB在吞噬体通路中显著富集。这几种差异表达蛋白质都在马血清中特异表达，推测这可能与马和驴免疫调节差异有关。

4 结论

本研究应用Label-free定量蛋白质组学技术，分析比较了马和驴血清蛋白质组分差异。从马和驴血清中共鉴定出231种差异表达蛋白质，驴比马上调的血清蛋白质有99种，驴比马下调的血清蛋白质有132种。这些差异表达蛋白质具有明显的相互作用，主要参与了补体和凝血级联过程，并参与多种生物学途径，表明马和驴在生理条件下的血清蛋白质组成特征存在一定差异。综上所述，本试验结果为研究马和驴的血清蛋白质组学特征提供了新的视角。该研究为进一步揭示马属动物种间生理特征差异和有效保障其健康提供数据支撑。