葡萄糖是细胞重要的能量来源，但现有研究发现高浓度的葡萄糖(以下简称高糖)具有促进炎症反应的作用[1-2]。在牛相关体外研究中已证实高糖能够促进牛肝细胞释放促炎细胞因子，从血糖角度解释了肝炎症损伤的可能原因[3]。犊牛断奶、运输等应激与呼吸道疾病发病率、严重程度有关，并且在应激过程中血糖显著升高[4-5]，血糖升高也被认为是影响牛呼吸道疾病综合征严重程度的标志物之一[6]。肺泡巨噬细胞是调节肺部炎症反应，维持肺炎症微环境的免疫细胞[7]，在牛呼吸道疾病的发生发展中发挥重要作用[4]。然而葡萄糖浓度的升高对于牛肺泡巨噬细胞(bovine alveolar macrophages, BAMs)促炎细胞因子释放的影响及其机制尚不清楚，缺乏相关研究。
目前研究发现，高糖能上调糖基化终末产物受体(receptor of advanced glycation end products，RAGE)与Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)，活化下游核转录因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)，从而促进促炎细胞因子的合成与释放[8-9]。当RAGE与TLR4均被激活时会发生受体间串扰，对下游共同的信号通路NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等产生协同激活作用[10-11]。髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)是TLR4下游MyD88依赖途径中重要的接头分子[12]，有研究指出MyD88可能在RAGE信号通路中也发挥接头分子的作用，传导来自RAGE的炎症信号[13]。但RAGE与TLR4能否协同上调MyD88的表达使其进一步激活，尚未有研究证实。另外，受体间串扰也表现受体的功能与表达会互相影响，如抑制TLR4会一定程度抑制小鼠单核巨噬细胞TLR2的功能与表达[14]。但RAGE与TLR4是否通过受体间串扰互相影响对方的表达，尚未有研究报道。综上所述，本试验探究高糖能否通过RAGE-TLR4串扰调控BAMs RAGE/TLR4/MyD88/NF-κB的激活及促炎因子的释放，并进一步探讨RAGE/TLR4的潜在串扰机制，为研究高糖调控BAMs炎症反应的分子机制提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料、试剂高糖DMEM、低糖DMEM培养基购自索莱宝(中国)；胎牛血清购自生工生物工程有限公司(中国)；Premix Taq酶、反转录试剂盒购自宝生物公司(日本)；原代牛肺泡巨噬细胞采自健康牛新鲜肺部组织；β-actin、RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB的实时荧光定量检测引物见表 1, 引物由生工生物工程有限公司合成。MyD88抗体(Fitzgerald，货号70R-50098)、NF-κB p65抗体(CST，货号C22B4)、RAGE抗体(Abcam，ab37647)、TLR4抗体(Proteintech，货号19811-1-AP)、β-actin抗体(Abcam，ab8226)以及羊抗兔IgG-HRP(索莱宝，货号SE134)。IL-1β、IL-6及TNF-α ELISA检测试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司。
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表 1 各基因实时荧光定量引物序列 Table 1 Primer sequence of genes for Real-time PCR |
1.2.1 BAMs的采集与分组处理 参照文献[15]中原代BAMs采集与鉴定方法，肺泡巨噬细胞阳性率大于96%。采取眼观健康无病变的新鲜且完整的牛肺，结扎气管防止污染。用经过高压灭菌且含有200 IU·mL-1青霉素、200 μg·mL-1链霉素的PBS对肺表面进行冲洗，并将PBS经气管灌入肺部，轻揉牛肺5 min，使用注射器收集灌洗液，重复灌洗3次。收集到的灌洗液经200目尼龙纱布过滤，1 200 r·min-1离心6 min，收集细胞。PBS洗涤细胞，1 200 r·min-1离心6 min，用含10%胎牛血清的DMEM低糖培养液重悬细胞，并进行细胞计数，置于37 ℃二氧化碳恒温培养箱培养6 h。PBS洗去未贴壁细胞，消化重悬细胞，调整细胞数为1×106个·mL-1，并通过台盼蓝染色法计算细胞存活率，瑞氏染色法进行形态学鉴定，墨汁吞噬试验计算巨噬细胞阳性率。分装于细胞培养瓶中，置于培养箱内培养3 h。3 h后将原代BAMs随机分为正常对照组(NG，5.5 mmol·L-1葡萄糖)、高糖组(HG，25.5 mmol·L-1葡萄糖)、HG+FPS-ZM1(RAGE抑制剂，1 μmol·L-1)组、HG+TAK-242(TLR4抑制剂，10 μmol·L-1)组及DMSO组(DMSO占培养体系0.1%)培养12 h，抑制剂组在高糖处理前需用TAK-242或FPS-ZM1预处理1 h，每组设置3个平行。12 h后离心收集培养后的上清液及下层细胞，上清液用于ELISA检测TNF-α、IL-1β、IL-6水平，下层细胞用于qRT-PCR检测RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA相对表达水平及Western blot检测RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相对表达水平。
1.2.2 实时荧光定量PCR检测BAMs RAGE、TLR4、MyD88和NF-κB p65 mRNA相对表达水平 对收集到的BAMs中总RNA采用Trizol法进行提取，并测定总RNA浓度及纯度，采用反转录试剂盒对总RNA进行反转录，得到的cDNA置于-20 ℃保存备用。以cDNA为模板，对每组RAGE、TLR4、MyD88和NF-κB p65的mRNA相对表达水平进行检测。实时荧光定量PCR反应体系：上下游引物各0.5 μL，Premix Taq 5.0 μL，cDNA模板4.0 μL，总体系10 μL。反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，循环40次，每个循环后检测荧光强度值Cq。实时定量PCR的结果采用2－△△Ct法进行计算，用内参基因β-actin对各基因表达水平均一化，2－△△Ct法计算公式: △Ct=Ct目的基因－Ct内参基因，△△Ct=△Ct试验组－△Ct对照组。
1.2.3 Western blot检测BAMs RAGE、TLR4、MyD88和NF-κB p65的蛋白相对表达 按每孔细胞加入150~250 μL裂解液的比例加入裂解液，至完全裂解。裂解后的样品4 ℃高速离心吸取并上清，采用BCA法对蛋白质定量后于-80 ℃保存待检。调整每孔上样蛋白量为15 μg，电泳程序为浓缩胶80 V 20 min，分离胶120 V 60 min。蛋白样品经电泳分离后，采用半干式转膜，25 V转膜30 min。使用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，与MyD88(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶1 000)、RAGE(1∶1 500)、TLR4(1∶800)以及β-actin(1∶5 000)4 ℃孵育过夜，孵育一抗的膜用TBST洗涤3次，按照1∶1 000稀释HRP标记的二抗，与膜37 ℃孵育1 h。用TBST洗涤3次，最后采用ECL化学发光检测。
1.2.4 ELISA检测BAM上清液中TNF-α，IL-1β，IL-6水平 吸取BAMs细胞培养液，离心收集上清。参照ELISA试剂盒说明书检测每组上清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。
1.2.5 统计学处理 采用SPSS22.0软件对试验数据进行统计分析，结果用“x±s”表示，采用单因素方差分析进行组间多重比较，显著性分析采用LSD法。P＜0.05为差异显著，P＜0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 FPS-ZM1与TAK-242抑制高糖促进的BAMs RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达HG组BAMs的RAGE、TLR4、MyD88以及NF-κB的基因表达水平均极显著高于NG组(P＜0.01)。HG+FPS-ZM1组RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB基因表达水平显著高于NG组(P＜0.05)，但均极显著低于HG组(P＜0.01)。HG+TAK-242组RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB基因表达水平显著高于NG组(P＜0.05)，但均极显著低于HG组(P＜0.01)。DMSO组与NG组各基因表达水平均无显著差异(P＞0.05)(图 1)。
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与NG组相比，*.P＜0.05差异显著，**.P＜0.01差异极显著；与HG组相比，#.P＜0.05差异显著，##.P＜0.01差异极显著 Compared with NG group, *.P < 0.05, **.P < 0.01; Compared with HG group, #.P < 0.05, ##.P < 0.01 图 1 高糖及高糖与不同抑制剂共处理对BAMs RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB基因表达的影响 Fig. 1 Effects of high glucose, high glucose and different inhibitor treatments on BAMs gene expression of RAGE, TLR4, MyD88 and NF-κB |
结果表明，高糖能够引起BAMs RAGE、TLR4、MyD88及NF-κB p65 mRNA表达上调，而TLR4抑制剂TAK-242与RAGE抑制剂FPS-ZM1均能抑制高糖引起的RAGE、MyD88、NF-κB p65 mRNA表达上调。其中，抑制RAGE能够下调TLR4 mRNA相对表达水平，抑制TLR4能够下调RAGE mRNA相对表达水平，并且抑制RAGE与TLR4均能下调MyD88与NF-κB p65 mRNA相对表达水平。由此说明，高糖在处理BAMs细胞时在基因水平上产生了RAGE-TLR4串扰，对RAGE、TLR4本身的mRNA转录产生影响，并协同促进下游MyD88、NF-κB p65 mRNA转录。
2.2 FPS-ZM1与TAK-242抑制高糖促进的BAMs RAGE/TLR4/MyD88/NF-κB蛋白表达HG组BAMs的RAGE、TLR4、MyD88以及NF-κB的蛋白表达水平均极显著高于NG组(P＜0.01)。HG+FPS-ZM1组RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平显著高于NG组(P＜0.05)，但均极显著低于HG组(P＜0.01)。HG+TAK-242组RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平显著高于NG组(P＜0.05)，但均极显著低于HG组(P＜0.01)。DMSO组与NG组各蛋白表达水平均无显著差异(P＞0.05)(图 2)。
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与NG组相比，*.P＜0.05差异显著，**.P＜0.01差异极显著；与HG组相比，#.P＜0.05差异显著，##.P＜0.01差异极显著 Compared with NG group, *.P < 0.05, **.P < 0.01; Compared with HG group, #.P < 0.05, ##.P < 0.01 图 2 高糖及高糖与不同抑制剂共处理对BAMs RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达的影响 Fig. 2 Effects of high glucose and different inhibitor treatments on BAMs protein expression of RAGE, TLR4, MyD88 and NF-κB |
高糖能够引起BAMs RAGE、TLR4、MyD88及NF-κB p65蛋白表达上调，而TLR4抑制剂TAK-242与RAGE抑制剂FPS-ZM1均能显著抑制高糖引起的TLR4、RAGE、MyD88及NF-κB p65蛋白表达上调。其中，抑制RAGE能够下调TLR4的蛋白表达，抑制TLR4能够下调RAGE的蛋白表达，并且抑制RAGE与TLR4均能下调MyD88与NF-κB p65蛋白水平。由此说明，高糖在处理BAMs细胞时在蛋白水平上产生了RAGE-TLR4串扰，对RAGE、TLR4本身的蛋白表达产生影响，并协同促进下游MyD88、NF-κB p65蛋白表达。
2.3 FPS-ZM1与TAK-242抑制高糖促进的BAM促炎因子IL-1β、IL-6及TNF-α释放HG组BAMs培养上清液中IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白浓度极显著高于NG组(P＜0.01)。HG+FPS-ZM1组IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白浓度均极显著高于NG组(P＜0.01)，但均极显著低于HG组(P＜0.01)。HG+TAK-242组IL-1β、IL-6蛋白浓度显著高于NG组(P＜0.05)，TNF-α浓度极显著高于NG组(P＜0.01)，但均极显著低于HG组(P＜0.01)。DMSO组与NG组各蛋白表达水平均无显著差异(P＞0.05)(图 3)。
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与NG组相比，*.P＜0.05差异显著，**.P＜0.01差异极显著；与HG组相比，#.P＜0.05差异显著，##.P＜0.01差异极显著 Compared with NG group, *.P < 0.05, **.P < 0.01; Compared with HG group, #.P < 0.05, ##.P < 0.01 图 3 高糖及高糖与不同抑制剂共处理对BAMs IL-1β、IL-6及TNF-α释放的影响 Fig. 3 Effects of high glucose and different inhibitor treatments on BAMs secretion of IL-1β, IL-6, TNF-α |
高糖能够引起BAMs IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白释放增加，而TLR4抑制剂TAK-242与RAGE抑制剂FPS-ZM1均能显著抑制高糖引起的IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白释放。
3 讨论高糖可促进炎症反应，引起机体IL-1β、IL-6及TNF-α等促炎因子释放[16-17]。高糖相关体外细胞试验中，25.5 mmol·L-1葡萄糖浓度是对于大部分体外培养细胞的高糖浓度，也是高糖相关研究的常用葡萄糖浓度[18-19]，因此本次研究采用25.5 mmol·L-1葡萄糖浓度作为高糖。在本次试验中，高糖处理能够引起BAMs释放促炎细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α，与前人研究结论相符。目前研究认为高糖主要通过TLR4、RAGE等固有免疫受体，激活下游NF-κB促进促炎细胞因子释放[9, 20]，但受体下游信号途径的传导激活有待进一步完善。Zhao等[21]研究发现，高糖能显著上调视网膜神经细胞TLR4/NF-κB的mRNA和蛋白表达，并促进促炎细胞因子TNF-α的分泌，而抑制TLR4能显著抑制NF-κB mRNA、蛋白表达以及TNF-α的分泌，表明高糖能通过TLR4激活NF-κB，促进细胞分泌促炎因子TNF-α。詹聃婷等[22]研究发现，高糖能促进人牙周膜成纤维细胞RAGE mRNA及蛋白表达，并促进促炎细胞因子IL-6、TNF-α的分泌，而RAGE抑制剂FPS-ZM1能显著抑制高糖引起的IL-6、TNF-α分泌。本研究结果发现，高糖处理BAMs 12 h后，细胞RAGE、TLR4、MyD88及NF-κB mRNA和蛋白水平以及上清液中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α浓度均显著升高，并且抑制RAGE与TLR4能够显著抑制上述过程，与前人研究结果相符。
RAGE与TLR4共享部分配体及下游炎症信号通路，并在受体被激活时发生信号通路上的串扰，从而对下游部分信号通路产生协同激活作用[11, 23]。目前已有研究表明，RAGE与TLR4被激活后能够对下游共同信号途径如MAPK、NF-κB产生协同激活作用[24-25]，但能否协同激活更多的下游信号通路有待进一步研究。Sakaguchi等[13]研究指出，MyD88作为已知的TLR4下游关键接头分子，可能与磷酸化的RAGE结合从而传导来自RAGE的炎症信号，但RAGE与TLR4能否协同激活MyD88尚不清楚。本研究发现，在高糖处理细胞前使用TLR4抑制剂TAK-242或RAGE抑制剂FPS-ZM1预处理BAMs 1 h，均能显著抑制高糖引起的BAMs MyD88/NF-κB mRNA、蛋白表达上调以及促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的释放，表明在高糖处理下，RAGE与TLR4能够协同激活MyD88/NF-κB信号通路，促进BAMs炎症反应。另外，受体间串扰还表现为受体水平上的相互影响，主要表现出影响另一受体的功能、蛋白表达或跨膜转运，不同TLR之间的串扰在巨噬细胞炎症反应中发挥重要作用[26-27]，但尚未有RAGE与TLR4间受体相互影响的研究报道。本研究发现，TLR4抑制剂处理BAMs后能显著抑制高糖引起的RAGE mRNA及蛋白表达上调，而RAGE抑制剂处理BAMs后能显著抑制高糖引起的TLR4 mRNA及蛋白表达上调。即RAGE与TLR4互相影响另一受体的蛋白表达，表明RAGE与TLR4间存在着受体水平上的串扰，但RAGE与TLR4是否互相影响其受体功能和跨膜转运有待进一步研究。在结果中还发现RAGE抑制剂FPS-ZM1相较于TLR4抑制剂TAK-242，能引起更进一步的TLR4表达抑制。TAK-242其主要功能并非抑制细胞TLR4表达，而是抑制细胞膜上TLR4的正常功能，引起下游MyD88/NF-κB信号减弱，通过负反馈调节使细胞TLR4表达受到抑制。而FPS-ZM1抑制RAGE正常功能后，也能引起MyD88/NF-κB信号减弱，但引起了更进一步的TLR4表达抑制，这可能说明RAGE除通过MyD88/NF-κB负反馈调节TLR4外，还存在其他串扰调控途径，有待进一步深入研究。
4 结论高浓度的葡萄糖能够通过RAGE-TLR4串扰引起BAMs释放促炎细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α，促进炎症反应。研究结果进一步阐明了高浓度葡萄糖促进细胞炎症反应的分子机制，RAGE与TLR4间的串扰机制可能成为后续研究的主要方向。
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(编辑 白永平)