黑色素瘤是一种由黑色素细胞异常增殖发生的肿瘤，多见于皮肤，但约有5%的黑色素瘤发生于实质器官、眼膜和腹膜后间隙等部位^[1]。细胞学检查可发现，黑色素瘤细胞形状由正常圆形变为梭形，伴随有明显的核异常和细胞增生，且细胞质内常含有棕色至黑色的黑色素颗粒^[2]。黑色素瘤为各年龄段人群常发疾病，在动物上也屡有报道。动物黑色素瘤多发生于猪、犬、猫和兔等，但在家禽上的报道并不多见。Sry相关的HMg-Box基因10 (SOX 10)和HMB-45抗体是两种黑色素细胞特异性单克隆抗体，因其高特异性和准确性被广泛应用于黑色素瘤的诊断^[3-4]。本研究对临床上发现的1例罕见肉鸡肝恶性黑色素瘤病例进行病理学诊断，旨在为禽类黑色素瘤的诊断和研究供依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 病鸡检查 　　病鸡为AA肉鸡，1日龄起与同龄鸡集中饲养，自由采食。饲养过程中此鸡精神沉郁、发育滞后，呈现消瘦状态，25日龄时体重约为同龄肉鸡的1/3。处死剖检发现该鸡肝整体呈黑色，除中度心包积液外，未见其他病理变化。

1.1.2 主要试剂 　　多聚甲醛、苏木素-伊红(HE)染色试剂盒、肝胆色素染色液(G3290，改良Fouchet法)和普鲁士蓝染色试剂盒(G1424)均购自北京索莱宝科技公司；HMB 45单克隆抗体(MAB-0098)购自福州迈新生物技术开发有限公司；SOX 10单克隆抗体(ZA-0624)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 苏木素-伊红染色 　　将患病AA鸡肝固定于10%多聚甲醛溶液中，切取适当大小的肝组织小块，用浓度梯度乙醇脱水后进行石蜡包埋。制备厚度为4 μm的石蜡组织切片，苏木素染色5 min，1%酸性乙醇染色10 s，后用0.5%的伊红溶液染色3 min。分别用浓度梯度乙醇和二甲苯对切片进行脱水、透明，中性树脂封片后置于光学显微镜下观察。

1.2.2 免疫组织化学检测 　　试验分别用SOX 10和HMB-45单克隆抗体孵育肝切片进行免疫组织化学检测。组织石蜡切片常规脱水、透明后用0.01 mol·L^-1柠檬酸钠缓冲液进行微波抗原修复，然后用3% H₂O₂溶液孕育30 min阻断内源性过氧化物酶。切片用小鼠抗HMB-45单克隆抗体或兔抗SOX 10单克隆抗体孵育，4 ℃过夜。PBS清洗玻片，用相应的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育30 min，DAB显色和苏木素复染后置于光学显微镜下观察。

1.2.3 胆色素染色 　　试验采用Fouchet法对胆色素进行染色。Fouchet染色液中试剂A由含三氯乙酸的溶液A1与含三氯化铁的溶液A2以9:1的比例混合而成。试剂B为VG染色液，由杜鹃花碱溶液和苦味酸溶液以1:9的比例混合而成。用10%多聚甲醛溶液对肝切片进行固定，浸入Fouchet染色液避光浸染10 min后流水冲洗，再放入VG染色液中浸染2 min，流水冲洗后用95%乙醇快速分化。将切片进行无水乙醇脱水和二甲苯透明，中性树胶封片后置于光学显微镜下观察。

1.2.4 普鲁士蓝染色 　　采用普鲁士蓝染色试剂盒检测含铁血黄素在病变肝组织内的沉积。制备厚度为4 μm的石蜡组织切片，常规脱水、透明后用Perls染色液染色30 min，蒸馏水清洗切片3次；肝细胞核用核固色液染色5 min。将切片进行无水乙醇脱水和二甲苯透明，中性树胶封片后置于光学显微镜下观察。

2 结果 2.1 病变肝苏木素-伊红染色观察

病鸡肝体积增大，整体呈黑色。肝切面粗糙，呈致密黑色，切面内偶见块状结节、肿块，触之有颗粒感(图 1A)。HE染色结果显示，病鸡肝有大量黑色素瘤细胞分布，呈浸润性生长。黑色素瘤细胞大小不一，形态多呈圆形、卵圆形和不规则型；细胞核大深染，核膜厚，核染色质呈粗颗粒状，核仁较为明显；核分裂象多见，细胞质丰富且可见黑色素颗粒(图 1B)。

2.2 免疫组织化学染色

结果显示，正常肝组织切片未着色，呈阴性结果(图 2A、2C)。病变肝与HMB-45单克隆抗体(图 2B)和SOX10单克隆抗体(图 2D)孵育后均呈明显的阳性反应(褐色)，提示病变细胞为黑色素瘤细胞。黑色素瘤细胞部分为单细胞散在分布，部分呈现明显的聚集性(图 2B、2D)。

2.3 黑色素瘤鉴别诊断

胆色素沉积阳性部位应着绿色，本例病鸡肝病变部位细胞染色呈灰褐色(图 3B)，提示本例病鸡肝病变并非由胆汁淤积引起。普鲁士蓝染色后肝细胞核呈红色，含铁血黄素沉积的部位应着蓝色。本例病鸡肝病变部位着色为深褐色(图 3D)，提示本例病鸡肝病变部位并非铁血黄素沉积。

3 讨论

研究表明，黑色素瘤可在多种禽类身上发生，如红尾鹰(Buteo jamaicensis)^[2]、鸳鸯(Aix galericulata)^[5]、灰背隼(Falco columbarius)^[6]、赛鸽(Columba livia)^[7]和洪堡企鹅(Humboldt penguin)^[8]等。禽类黑色素瘤多发于喙附近的皮肤、面部皮肤、肾上腺、卵巢和肺等，而发生于肝的黑色素瘤相对较少^{[2, 5-6, 8]}。Kufuor-Mensah等^[2]在1只鹰的喙部组织发现了黑色素瘤，黑色素细胞紧密排列，核仁明显，细胞质内黑色素颗粒丰富，而后在肌肉肾上腺和肝中发现类似黑色素细胞，疑似肿瘤转移。Reid等^[5]报道了1例患有黑色素瘤的成年雌性鸳鸯，坚实的黑色多结节性肿块由喙外部皮肤侵入并充满鼻腔。2004年，有报道称，1只雌性灰背隼死于黑色素瘤引发的呼吸困难，剖检发现该灰背隼肝、脾和肺明显增大，且分布有大量界限清楚的黑色球形结节^[6]。Kajigaya等^[7]发现1只赛鸽患有黑色素瘤，其黑色素细胞由下颚转移至肝、肾和脾等器官。其中，肝病变最为明显，体积增大且有大量黑色肿块，肝窦内可见大量黑色素细胞, 黑色素细胞有大小不一的圆形或卵圆形泡状核，核仁突出，细胞质内含大量黑色素颗粒。Feltrer Rambaud等^[8]在剖检1例患有恶性黑色素瘤的企鹅时发现，企鹅肝中有大量黑色斑块，其直径为2~3 mm至5~6 cm，HE染色结果显示，这些黑色斑块细胞中有大量的黑色素沉积，其特征与本试验观察到的一致。Williams等^[9]通过免疫组化和HE染色等方法成功鉴别了发生在仔鸡身上的转移性黑色素瘤，发现，由黑色素细胞异常增殖形成的多个肿瘤位于肝内，染色显示病变细胞大小不一，细胞质中黑色素沉积明显，并伴有中度核不对称，这与本试验黑色素瘤分布和细胞特征相类似。

肝大面积发生黑色素瘤较为少见，因此，本研究用黑色素细胞相关抗体进行免疫组化确认。SOX10与黑色素瘤的发生和发展密切相关，且已被证明是黑色素瘤的敏感标记物之一。SOX10能够高度特异性地将黑色素瘤与其非黑色素细胞模拟物如切除疤痕、非典型纤维黄瘤和隆突性皮肤纤维肉瘤等区分开来^[10-12]。在超微结构研究中，HMB-45作为一种单克隆抗体，能特异性的识别前黑色素小体球蛋白，可与不完全性黑色素瘤细胞及黑色素瘤特异性抗原产生反应，对恶黑瘤具有高度特异性和敏感性，反应的阳性物质定位于细胞质内，呈颗粒状^[13]。此抗体可用于冰冻新鲜组织及石蜡包埋组织，并适用于各种涂片细胞分析。在禽类肿瘤诊断过程中，已有使用HMB-45抗体诊断企鹅黑色素瘤的研究，而尚无SOX10抗体诊断禽类黑色素瘤的报道^[14]。本试验的结果为禽类黑色素瘤的诊断提供参考依据，同时为SOX10和HMB-45抗体鉴别禽类黑色素瘤提供借鉴意义。

4 结论

本研究利用HE染色、免疫组织化学和鉴别诊断方法，对1例肉鸡肝恶性黑色素瘤进行病理学诊断，结果为禽类黑色素瘤的诊断和深入研究提供了参考。