2. 中国农业大学动物医学院, 北京 100193;
3. 北京农学院动物科学技术学院, 北京 102200
, MA Yunfei2, LI Huanrong3, LIU Fenghua3, BAO Minglong1, ZHANG Jidong1, LIN Hongying1, XU Jianqin2
2. College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China;
3. College of Animal Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102200, China
新生仔猪的胃肠道疾病是限制全球养猪业经济效益的重要因素，仔猪泄泻是养殖者特别关注的问题。调查结果显示，北京、山东、河北等地区部分猪场的仔猪腹泻发病率约为20%，有的甚至高达100%[1]。现代兽医学认为，仔猪腹泻主要分为两大类：一类是由营养不良、消化功能失调等生理性因素导致的腹泻，另一类是由产肠毒大肠杆菌、传染性胃肠炎病毒等引起的病原性腹泻[2]。中(兽)医学认为，以排便次数增多，粪便稀溏，甚至泄出如水样为主症的病证是泄泻，基本病机是脾胃受损，湿困脾土，肠道功能失司[3-4]。泄泻的病证主要分急性暴泻和慢性久泻，急性暴泻分寒湿证、湿热证、食滞证；慢性久泻主要包括脾胃虚弱证、肾阳虚衰证等[5]。一般来说，生理性因素导致的仔猪泄泻多由机体脾胃虚弱所致，而病原性仔猪泄泻则需要根据仔猪的口色、脉象、临床症状表现辨证分析确定为寒证或热证后方可论治。
本试验将围绕着仔猪湿热泄泻展开研究。仔猪湿热泄泻证的症状表现为：烦热口渴喜饮、粪色黄褐而臭、小便短赤、舌质红、苔黄腻等，治疗原则是清热运脾，化湿止泻[6]。湿热病邪可破坏大鼠肠道上皮的完整性，使上皮细胞发生变性、坏死和脱落等现象[7]，湿热泄泻模型中大鼠的血清促炎因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均升高，机体发生炎症反应[8-9]。此外，湿热泄泻还会减弱仔猪受损小肠的修复功能[10]。东汉张仲景所著《伤寒论》中的葛根芩连汤，是治疗湿热泄泻的经典组方。葛根芩连汤可用于治疗仔猪的细菌性痢疾和中毒性肠炎[11]，现代临床运用中，可在葛根芩连汤原方基础上酌情加减运用行气燥湿健脾、清热解毒类药物[12]。本研究所用的加味葛根芩连汤，以经典方葛根芩连汤为基础方，加金银花增强葛根的清热解毒功效，加白术、茯苓增强健脾利水和止泻功效，清热燥湿，健脾止泻，兼顾解表。葛根芩连汤可通过抗炎、抗氧化、调节肠道微生物等途径治疗泄泻[13-14]，但葛根芩连汤加金银花、白术等药物后对湿热泄泻仔猪肠道功能的调控作用尚不清楚。基于此，本研究将探讨加味葛根芩连汤对湿热泄泻仔猪肠道炎症和损伤修复的调控作用。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器葛根、黄芩、黄连、金银花、白术、茯苓和甘草均购自北京鹤延岭药业发展有限公司；4%多聚甲醛、苏木精、伊红、盐酸酒精分化液、氯仿、异丙醇等均购自美国Sigma公司；无水乙醇、95%乙醇、甲醛、二甲苯等均购自中国国药集团化学试剂有限公司；鼠源PCNA抗体(2586)购自美国Cell Signaling Technology公司；生物素标记的驴抗鼠IgG(715-065-151)购自美国Jackson公司；Trizol reagent(15596-026)购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒(A3500)购自美国Promega公司；SYBR Green QPCR试剂盒(600828)购自美国Agilent公司。
石蜡切片机(美国Amersham optical公司)；生物显微镜(日本Olympus公司，BH2型)；全自动荧光免疫分析仪(法国Biomèrieux MiniVidas公司，VIDAS30型)；病理图像分析系统(日本Olympus公司，Olympus 6.0型)；超微量核酸蛋白测定仪(美国Thermo公司，ND2000型)；实时荧光定量PCR仪(美国STRATAGENE，MX3005P)。
1.2 葛根芩连汤的制备加味葛根芩连汤(Jiawei Gegen Qinlian Decoction, JGQLD)由葛根、黄连、黄芩、金银花、白术、茯苓和甘草按一定比例组成。加水没过药材浸泡30 min，煎煮2 h。经纱布滤取药液，加水后再煎煮1次，将滤液合并，旋转蒸发仪真空抽滤，分别浓缩药液至生药量为0.5、1.0和2.0 g·mL-1。4 ℃保存备用。
1.3 试验动物及分组选8~15日龄产房未断奶仔猪(大白×长白)30头, 来自北京市顺义区某猪场。其中健康仔猪6头，为对照组。选取有粪色黄褐而臭、小便短赤、舌质红等症状的泄泻仔猪24头，分为湿热泄泻组(damp-heat diarrhea group, DHD group)、加味葛根芩连汤低剂量组(low dose of JGQLD group)、加味葛根芩连汤中剂量组(middle dose of JGQLD group)和加味葛根芩连汤高剂量组(high dose of JGQLD group)，每组6头。仔猪自由采食，饮水。对照组和湿热泄泻组仔猪每天灌服5 mL生理盐水，加味葛根芩连汤低剂量组每天灌服为0.5 g·mL-1的药液5 mL(共2.5 g生药，生药剂量约为0.625 g·kg-1)，中剂量组每天灌服生药浓度1.0 g·mL-1的药液5 mL(共5.0 g生药，生药剂量约为1.25 g·kg-1), 高剂量组每天灌服生药浓度为2.0 g·mL-1的药液5 mL(共10.0 g生药，生药剂量约为2.50 g·kg-1)。每天1次，连续灌服5 d。
1.4 粪便评分根据Hu等[15]介绍的5分法对仔猪粪便进行主观视觉评分，即根据仔猪粪便形态外观进行评分(1~5分)，粪便评分标准见表 1。在服用加味葛根芩连汤的第0、3、5天，记录仔猪的粪便评分。
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表 1 粪便评分标准 Table 1 Standard of fecal score |
第6天，将对照组、湿热泄泻组和加味葛根芩连汤中剂量组内的仔猪全部颈部放血处死，打开腹腔，采集各组仔猪的十二指肠、空肠、回肠和结肠组织的中段，每段约4 cm，置于4%多聚甲醛液中固定备用。取各组仔猪的空肠，剪刀分割成每段1 cm，放入冻存管，液氮速冻后，置于-80 ℃冰箱保存。
1.6 肠道组织石蜡切片和H.E.染色取出固定的十二指肠、空肠、回肠和结肠组织，双蒸水冲洗干净，然后切成0.5 cm的长度，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，常规方法H.E.染色，生物显微镜镜下观察，并用病理图像分析系统拍照。
1.7 十二指肠增殖性细胞核抗原免疫组织化学染色选十二指肠切片经PBS洗涤，1% H2O2孵育后PBS洗涤，加增殖性细胞核抗原(PCNA)一抗(1:5 000稀释)孵育过夜。PBS洗涤后滴加二抗1:100生物素标记的驴抗鼠IgG，室温孵育2 h，PBS洗涤后滴加1:100 ABC复合物，室温孵育1 h，PBS洗涤后滴加DAB显色液，逐滴滴入1% H2O2，观察十二指肠切片颜色变化，显色3~5 min后终止染色。常规脱水、透明、封片，室温保存。生物显微镜镜下观察，用全自动荧光免疫分析仪拍照。
1.8 RNA提取、反转录及荧光定量PCR分段的仔猪空肠放入冻存管，液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存。取空肠用TRIzol总RNA提取试剂盒提取仔猪空肠总RNA。用两步法进行RNA逆转录，总反应体系为25 μL。首先配备反应体系13 μL (总RNA模板1.0 μg，Oligo (dT) 18为1.0 μL，DEPC水11 μL)，PCR仪中70 ℃进行变性反应5 min，立即冰浴3 min。接着，在反应体系中加入以下试剂：1.25 μL的dNTPs (10 mmol·μL-1)，0.5 μL的RNasin (Ribonuclease Inhibitor, 40 U·μL-1)，5.0 μL的M-MLV逆转录酶5 × Buffer，1.0 μL的M-MLV逆转录酶(200 U·L-1)，以及4.25 μL的DEPC水。PCR仪中42 ℃反应1 h，将产物cDNA立即使用或-20 ℃保存。
用荧光定量PCR (SYBR Green I)方法对各组内空肠TLR4、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表达量进行测定。目的基因TLR4、TNF-α、IL-1β和IL-6的引物序列见表 2。
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表 2 荧光定量PCR引物表 Table 2 Primers for fluorescence quantitative PCR |
按照SYBR Green qPCR试剂盒说明书配制20 μL反应体系：Mix (2 ×) 10 μL，cDNA模板+DEPC水8.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL。反应体系混匀后立即放入实时荧光定量PCR仪中，反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循环40次；72 ℃再延伸8 min。熔解曲线反应条件：95 ℃ 1 min；58 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s。基因相对表达量计算公式：相对含量=2-[ΔΔCt]，ΔΔCt=处理组ΔCT (目的基因-β-actin)-对照组ΔCT (目的基因-β-actin)。
1.9 数据分析试验结果用“Mean±SEM”表示，应用统计软件SPSS 20.0进行多重比较检验。其中, PCNA免疫组化结果用Image J软件分析，荧光定量PCR检测结果应用Mx 3000P (Stratagene, USA)分析，试验结果均采用origin 6绘图软件制图。*表示P < 0.05，**表示P < 0.01。
2 结果 2.1 仔猪粪便评分各组仔猪的粪便评分如表 3所示。在0 d，健康仔猪的粪便评分和湿热泄泻仔猪的粪便评分存在显著差异(P < 0.05), 湿热泄泻的仔猪发生了严重的腹泻。服用加味葛根芩连汤3 d后，相比于DHD组，JGQLD组仔猪的粪便评分显著下降(P < 0.05)，且存在剂量依赖性，表明加味葛根芩连汤初步缓解了湿热泄泻仔猪的腹泻。服用加味葛根芩连汤5 d后，湿热泄泻仔猪的粪便评分均恢复正常，未发生腹泻。
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表 3 仔猪的粪便评分 Table 3 The fecal score of piglets |
正常情况下，仔猪小肠和结肠绒毛结构完整，排列有序(图 1 A1~D1)。湿热泄泻仔猪的十二指肠结构受到严重破坏，肠腔内分泌大量液体，绒毛排列紊乱，绒毛中下部发生断裂现象，嵴断裂，黏膜固有层受到严重损伤，血管扩张并出现炎性细胞聚集(图 1A2 )。空肠结构受到严重破坏，绒毛和隐窝断裂与嵴分离脱落至肠腔(图 1 B2)。回肠结构受到损伤，绒毛上皮发生脱落现象(图 1 C2)。结肠上皮有脱落现象，固有层下有出血(图 1 D2)。加味葛根芩连汤中剂量组内，仔猪十二指肠结构趋于正常，绒毛分布较为整齐，有大量的绒毛包裹成团脱落至肠腔，脱落的绒毛团中有炎性细胞聚集(图 1 A3)。空肠和回肠结构完整，黏膜固有层下发生轻微出血(图 1 B3和C3)。结肠结构较完整(图 1 D3)。
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1代表分泌的黏液; 2代表损伤的绒毛上皮; 3代表脱落的绒毛团; 4代表出血; 5代表炎性细胞聚集 1 represents secreted mucus; 2 represents damaged villus; 3 represents shedding villus; 4 represents bleeding; 5 represents gathered inflammatory cells 图 1 仔猪小肠和结肠形态结果变化(H.E.染色) Fig. 1 The morphology section of small intestine and colon in piglets (H.E. staining) |
如图 2所示，棕黄色所示为增殖性细胞核抗原(PCNA)免疫反应阳性产物。免疫组织化学染色结果显示，正常情况下，PCNA在仔猪十二指肠的绒毛和隐窝处呈均一散落分布(图 2A和D)；相比于对照组，湿热泄泻组仔猪十二指肠绒毛中PCNA表达量极显著降低(P < 0.01)，肠腺隐窝PCNA表达量显著升高(P < 0.05)(图 2B和E，图 3)；相比于湿热泄泻组，加味葛根芩连汤中剂量组仔猪十二指肠绒毛PCNA表达量极显著升高(P < 0.01)，肠腺隐窝PCNA表达量显著降低(P < 0.05)(图 2C和F，图 3)。
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A、B和C为低倍镜下观察结果，D、E和F为高倍镜下观察结果 A, B and C (Low magnification), D, E and F (High magnification) 图 2 仔猪十二指肠PCNA表达变化 Fig. 2 Changes of PCNA expression in the duodenum of piglets |
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A.十二指肠绒毛中PCNA染色的百分比；B.十二指肠隐窝中PCNA染色的百分比 A. The percentage of PCNA-stained cells in the villus of duodenum; B. The percentage of PCNA-stained cells in the crypt of duodenum 图 3 仔猪十二指肠的绒毛和隐窝PCNA表达量变化 Fig. 3 Changes of PCNA expression in the villus and crypt of duodenum in piglets |
由图 4可知，相比于对照组，湿热泄泻组仔猪空肠TLR4 mRNA表达量显著升高至1.83倍(P < 0.05)，TNF-α mRNA表达量极显著升高至4.32倍(P < 0.01)，IL-1β mRNA表达量极显著升高至6.88倍(P < 0.01)，IL-6 mRNA表达量显著升高至5.25倍(P < 0.05)，表明湿热泄泻仔猪空肠激活了TLR4介导的肠道炎症反应。相比于湿热泄泻组，加味葛根芩连汤中剂量组仔猪TLR4 mRNA表达量显著降低至0.54倍(P < 0.05)，TNF-α mRNA表达量极显著降低至0.23倍(P < 0.01)，IL-1β mRNA表达量极显著降低至0.18倍(P < 0.01)，IL-6 mRNA表达量显著降低至0.29倍(P < 0.05)，表明加味葛根芩连汤阻断了湿热泄泻仔猪空肠TLR4介导的肠道炎症反应。
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图 4 仔猪空肠TLR4、TNF-α、IL-1β and IL-6 mRNA表达量变化 Fig. 4 The mRNA expression of TLR4, TNF-α, IL-1β and IL-6 in the jejunum of piglets |
葛根芩连汤可解除表证，清解里热，适用于湿热泄泻证。此方的君药葛根解表清热，升清止泻，臣药黄芩、黄连清热燥湿，金银花助其清热，佐药白术、茯苓增强利湿，炙甘草调和诸药。各组仔猪的粪便指数显示，加味葛根芩连汤显著改善了仔猪的湿热泄泻。葛根芩连汤中，葛根和黄芩都具有抗炎、抗氧化的作用[16], 葛根与黄芩配伍能增加黄芩的药效[12]；黄连是降低小鼠腹泻指数的主要作用药物，炙甘草与黄连配伍是降低小肠推进率的两个主要作用药物，且炙甘草与黄连配伍能增强黄连的药效[17]。葛根芩连汤可通过多种方式治疗泄泻，如它可通过调节肠道微生物及其代谢产物短链脂肪酸的方式治疗仔猪泄泻[13]，它能在小鼠的溃疡性结肠炎模型中降低肠道的炎症反应和氧化应激[14]。此外，相比于正常的大鼠，湿热病邪还促进大鼠的肠道对葛根芩连汤的吸收[18]。
本试验中，湿热泄泻致使仔猪的十二指肠、空肠、回肠和结肠组织结构受到损伤，特别是十二指肠和空肠；湿热泄泻仔猪的十二指肠还分泌了大量黏液，结肠绒毛上皮有出血现象。小肠黏膜的所有上皮细胞来源于隐窝干细胞，隐窝干细胞的发生、分化、增殖、分布等过程，直接影响肠黏膜的完整性和功能特异性。PCNA是一种在增殖细胞内合成或表达的核内多肽，是DNA合成必不可少的因子，PCNA阳性表达的强弱直接反映了细胞增殖活动的高低[19]，它在断奶仔猪的损伤小肠表达显著增加[20]。本研究中，对照组仔猪十二指肠的PCNA主要在隐窝中上部的分裂区表达(图 2A和D)；湿热病邪诱导的仔猪肠道黏膜损伤后，十二指肠肠腺隐窝处PCNA表达量显著升高(图 2B和E，图 3B)，所以十二指肠隐窝PCNA的高表达是由湿热病邪诱导的肠道损伤引起的。
相比于湿热泄泻组，加味葛根芩连汤组的十二指肠、空肠、回肠和结肠的组织结构得到显著改善，表明加味葛根芩连汤阻断了湿邪、热邪对肠道的损伤，从而维持肠道结构的完整性。前期研究中，我们发现, 葛根的主要活性成分葛根素，黄芩中的黄芩苷，以及黄连中的盐酸小檗碱预处理猪肠道上皮细胞后可显著改善上皮细胞的微观结构[21]，所以，此方中的葛根、黄芩和黄连都起到了维持肠道结构完整性的作用。PCNA可通过参与小肠细胞增殖过程，诱导小肠黏膜上皮细胞由绒毛底部隐窝处开始不断地分裂增殖，并逐渐向绒毛上方迁移分化成熟[22]。相比于湿热泄泻组，加味葛根芩连汤组十二指肠绒毛中的PCNA表达量显著升高(图 3A)，肠腔中还有不断脱落的绒毛上皮细胞，这表明，湿热泄泻仔猪服用加味葛根芩连汤后，隐窝干细胞不断向上方迁移分化为成熟的黏膜上皮细胞，并促进了受损的绒毛上皮细胞的脱落。以上表明，加味葛根芩连汤可以通过促进隐窝干细胞的增殖和分化为成熟的肠道上皮细胞以维持肠道结构的完整性。黄芩可对肠炎模型小鼠受损的空肠发挥修复作用[23]，且黄芩苷对猪的肠道上皮细胞具有增殖活性[21]，所以，加味葛根芩连汤中的黄芩可能是促进肠道损伤修复的关键药物。葛根芩连汤还可通过促进肠道紧密连接蛋白的表达缓解泄泻仔猪的肠道损伤[13]，这可能是加味葛根芩连汤缓解湿热泄泻的潜在作用途径。
肠道上皮表面的Toll样受体激活后会促进黏膜免疫系统分泌促炎因子、趋化因子和抗微生物小肽等，激活细胞的先天性和获得性免疫反应，而肿瘤坏死因子-α (TNF-α)，白介素1β (IL-1β)和白介素6 (IL-6)是炎症反应发生后的促炎因子[24]。促炎因子是调节肠道上皮渗透性的重要因素，可控制肠道上皮紧密连接蛋白的组成和结构[25-26]，如TNF-α可以损害上皮细胞中紧密连接蛋白的功能，IL-1β可以抑制紧密连接蛋白的表达[26]。在本试验中，相比于对照组，湿热泄泻组仔猪空肠的TLR4、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA显著升高，表明湿热泄泻激活了仔猪空肠中TLR4介导的炎症反应。相比于湿热泄泻组，加味葛根芩连汤中剂量组内仔猪空肠的TLR4、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA显著降低。在小鼠溃疡性结肠炎模型也发现，葛根芩连汤抑制了TLR4信号通路，发挥抗炎作用[14]。仔猪空肠炎性因子在mRMA水平表达量下降，表明加味葛根芩连汤了降低湿热泄泻仔猪的空肠的炎症反应，进而维持了肠道上皮结构的完整性。
4 结论本研究结果表明，加味葛根芩连汤可通过促进隐窝干细胞的增殖和降低炎症反应修复湿热泄泻仔猪肠道损伤。
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