2. 天津师范大学生命科学学院, 天津市动植物抗性重点实验室, 天津 300387
, LIU Xuejiao1, WANG Qian2, WEI Qing1, DOU Caixia2, SHANG Zhiyuan2, QIAO Jiayun2, LI Haihua1
2. Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance, College of Life Sciences, Tianjin Normal University, Tianjin 300387, China
沙门菌(Salmonella)是一种寄生在人和动物肠道中的人畜共患病原菌，血清型繁多且致病性强，可引起人类食物中毒，以及幼龄动物胃肠炎、败血症等。6月龄以下断奶仔猪较易感沙门菌，其中l~4月龄多发，感染后可出现猪副伤寒等疾病。沙门菌作为一种主要的肠道致病菌，通常直接侵袭宿主的特殊抗原捕获M细胞或肠上皮细胞，破坏肠道的紧密连接[1]。紧密连接(tight junction TJ)是肠上皮细胞间的重要连接方式，紧密连接蛋白1(ZO-1)和闭合蛋白(Occludin)是其中两种重要的紧密连接蛋白，影响肠道通透性，对于肠道黏膜的损伤修复十分关键。当病原菌感染肠上皮细胞后，紧密连接蛋白的表达量下降，肠道通透性增加，病原菌突破上皮屏障并进入肠道细胞后，引起仔猪腹泻或肠道炎症等疾病[2]。因此，研究ZO-1和Occludin在病原菌感染下的表达变化有助于了解病原菌对猪肠道屏障的影响。
核因子-κB(NF-κB)信号通路是机体内免疫调节的经典通路，当宿主细胞受到细菌感染后，细胞表面的模式识别受体识别病原体相关分子模式，将侵袭信号传递给免疫细胞，诱导NF-κB表达增加，刺激细胞因子的分泌，从而激活炎症反应[3]。革兰阴性菌释放的脂多糖(LPS)进入机体，引起紧密连接蛋白异常表达，肠道屏障损伤后，内毒素等穿过肠壁，诱导活化细胞表面Toll样受体4(TLR4)激发下游的NF-κB信号通路，进而促进促炎性细胞因子(IL-8和TNF-α等)的合成与释放，继而加重肠道的损伤[4]。Wnt/β-catenin信号通路是一条和机体内环境稳态密切相关且高度保守的信号通路，参与细胞增殖与凋亡、炎症反应等活动[5]。当细菌感染机体时，β-catenin能调控细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和原癌基因(c-Myc)等靶基因的转录，cyclin D1和c-Myc是细胞增殖的重要调控因子，其上调能促进猪肠上皮细胞的增殖，从而抑制细胞凋亡[6]。用铜绿假单胞菌感染小鼠的巨噬细胞以及角膜上皮细胞后，激活了Wnt/β-catenin信号通路，β-catenin蛋白表达量下降，引起细胞损伤[7]。但是，关于沙门菌引致细胞损伤与NF-κB/β-catenin信号通路之间的关系报道较少。
本试验以猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)为体外模型，研究了沙门菌对IPEC-J2的损伤作用，以及NF-κB/β-catenin信号通路在沙门菌引致细胞损伤中的作用，有助于深入了解沙门菌引致小肠上皮细胞损伤的分子机制。
1 材料与方法 1.1 细胞和菌株IPEC-J2细胞株购自上海冠导生物工程有限公司；猪霍乱沙门菌自肠炎仔猪粪便中分离，由天津农学院动物科学与动物医学学院预防兽医学实验室保存。
1.2 主要试剂RPMI Medium 1640基础培养液、胎牛血清和胰蛋白酶EDTA消化液均购自美国Gibco公司，PBS缓冲液、青链霉素和DMSO均购自北京索莱宝生物公司。猪白细胞介素-8(IL-8)、猪肿瘤坏死因子(TNF-α)和猪乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒均购自美国BD公司。DNA和RNA核酸萃取试剂盒、反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒均购自美国GeneCpoeia公司。
1.3 沙门菌的培养与计数将沙门菌接种于营养肉汤，37 ℃振荡培养24 h后，8 000 r·min-1离心5 min收集菌泥，然后，用灭菌生理盐水洗涤菌沉淀3次，再加入适量的生理盐水制成菌悬液。对菌悬液进行倍比稀释，采用悬滴法接种于营养琼脂培养基，37 ℃培养24 h后进行菌落总数(cfu)计数，确定沙门菌菌液的浓度。
1.4 IPEC-J2的复苏、传代和培养从液氮中取出冻存细胞，迅速置于37 ℃水浴中融化大约1 min，经1 000 r·min-1离心1 min后弃去冻存液，再加入1 mL完全培养液重悬细胞。将4 mL含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM-1640细胞完全培养液倒入6 mm的培养皿，把细胞均匀接种到培养皿中，放入5% CO2培养箱中37 ℃培养。
当细胞融合度达到80%~90%便可以传代，将细胞培养上清倒掉，用不含血清的DMEM-1640细胞培养液洗去死细胞等，再加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，晃动平皿使其均匀浸没培养皿整个底部，放入培养箱中消化1~2 min。然后用显微镜观察，若细胞不贴壁且形态呈圆形，即可加入4 mL完全培养液终止其消化，然后用移液枪轻轻吹打细胞使其脱落下来。将消化好的细胞悬液转移到5 mL离心管中，1 000 r·min-1离心3 min，弃上清，用3 mL完全培养液重悬细胞，然后加入到含有适量培养液的100 mm培养皿中，静置培养。
1.5 引物设计与合成根据NCBI数据库中猪NF-κB p65、β-catenin、cyclin D1和c-Myc基因的全序列，使用Primer Premier 5软件设计引物，引物序列见表 1。另外，ZO-1、Occludin和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的荧光定量PCR引物序列参考李海花等[8]的文献报道。引物委托上海生工生物工程有限司合成。
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表 1 引物序列 Table 1 Primer sequence |
采用荧光定量PCR(qPCR)检测ZO-1、Occludin、NF-κB p65、β-catenin、cyclin D1、c-Myc和GAPDH的表达。方法参照李海花等[8]的文献报道，简述如下：用TacoTMRNA试剂盒中的裂解液收集并裂解待分析的细胞样品，严格按照试剂盒操作说明提取IPEC-J2细胞中总RNA，按照All-in-OneTM First cDNA Synthesis试剂盒说明书操作步骤将总RNA逆转录为cDNA。按照SYBRⓇ Premix Ex TaqTM荧光定量试剂盒操作说明进行qPCR反应体系的配制：上、下游引物各2 μL，all-in-one qPCR Mix (2×) 10 μL，cDNA 3 μL，补加DEPC处理的灭菌水至20 μL。qPCR反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，62 ℃或64 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40个循环；熔解曲线条件为72 ℃ 10 s、+0.3 ℃和95 ℃ 10 s。每个样品均设置未经逆转录的模板作为阴性对照，同时，每个样品均设置相应的内参作为对照，得到各自的荧光阈值循环数(Ct值)，采用相对定量法2-ΔΔCt进行计算。
1.7 沙门菌引起IPEC-J2损伤将IPEC-J2细胞接种于12孔细胞培养板中，培养至细胞融合度达到80%，使用沙门菌(1×103 CFU·mL-1)刺激IPEC-J2细胞3、6、12和24 h，同时，设置未处理只加细胞培养液的对照组，每组3个重复。到达刺激时间后，用无菌管收集培养上清液，3 000 r·min-1离心20 min，仔细收集上清，用于分析LDH的含量。细胞的损伤程度通过检测细胞培养上清液中LDH的含量、贴壁细胞中LDH的含量以及漂浮培养液凋亡小体中LDH的含量而决定，细胞毒性(%)=培养上清液中LDH含量/总LDH含量×100，仔细收集细胞培养上清液和凋亡小体以及贴壁细胞，再严格按照LDH的ELISA检测试剂盒说明书进行LDH的检测。上清液收集完毕后，用PBS清洗两遍培养板中的细胞，每孔中加入200 μL的细胞裂解液，用于提取细胞中的RNA，采用上述qPCR方法分析ZO-1和Occludin的表达。
1.8 沙门菌感染IPEC-J2后对NF-κB/β-catenin信号通路的影响将IPEC-J2细胞接种于12孔细胞培养板中，培养细胞至融合度达到80%，按照上述“1.7”中方法用沙门菌处理细胞，并在刺激细胞3、6、12和24 h后收集培养上清液和细胞裂解液。严格按照猪白细胞介素-8(IL-8)和猪肿瘤坏死因子(TNF-α)ELISA检测试剂盒的说明书对细胞培养液中的促炎性细胞因子进行检测。采用“1.6”的方法检测细胞中NF-κB p65、β-catenin、cyclin D1和c-Myc的表达。
1.9 NF-κB信号通路在沙门菌引起IPEC-J2损伤中的作用将IPEC-J2细胞接种于12孔细胞培养板中，培养细胞融合度达到80%，使用10 μmol·L-1的NF-κB抑制剂BAY11-7082或二甲基亚砜(DMSO)处理细胞1 h，再用1 × 103 CFU·mL-1的沙门菌刺激IPEC-J2细胞，刺激6、12和18 h后收集细胞及其培养上清液。试验分组包括只加细胞培养液的空白对照组、DMSO单独处理组、抑制剂单独处理组、DMSO处理细胞后用沙门菌刺激组、抑制剂处理细胞后用沙门菌刺激组，每组3个重复。按照上述ELISA方法检测LDH、TNF-α和IL-8含量，以及qPCR方法检测细胞中NF-κB p65，ZO-1和Occludin的表达。
1.10 β-catenin信号通路在沙门菌引起IPEC-J2损伤中的作用根据猪β-catenin全基因序列，委托上海生工生物工程有限公司设计合成特异性的siRNA。siRNA- β-catenin序列：正向5′-GCAGCUGGAAUUCUUUCUATT-3′，反向5′-UAGAAAGAAUUCCAGCUGCTT-3′。阴性对照(siRNA-NC)序列：正向5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反向5′- ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。将IPEC-J2细胞接种于12孔细胞培养板中，培养细胞融合度达到80%，使用Lipofectamine 2000转染试剂按照说明书进行siRNA转染，转染后24 h收获细胞，按照上述qPCR方法分析β-catenin的表达。同时，设置阴性对照转染组。干扰效率分析表明，siRNA-β-catenin的干扰效率高达84.6%。
将IPEC-J2接种于12孔细胞培养板中，培养细胞融合度达到80%，用siRNA-β-catenin或siRNA-NC转染IPEC-J2细胞6 h后，再用沙门菌刺激细胞，分别在细菌刺激后6、12和18 h收集细胞及其培养上清液。试验分组包括只加细胞培养液的空白对照组、siRNA-NC单独转染组、siRNA-β-catenin单独转染组、siRNA-NC转染细胞后再用沙门菌刺激细胞组、siRNA-β-catenin转染细胞后再用沙门菌刺激细胞组，每组3个重复。按照ELISA方法检测培养上清液中LDH含量，以及qPCR方法检测细胞中β-catenin、cyclin D1和c-Myc的表达。
1.11 数据处理使用Excel和SPSS 20.0软件对数据进行整理和统计分析，采用单因素ANOVA法进行方差分析以及t检验进行组间差异显著性检验，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著，P>0.05表示无显著差异。另使用GraphPad Prism 5软件进行图像制作。
2 结果 2.1 沙门菌引起IPEC-J2损伤用沙门菌刺激IPEC-J2，分析沙门菌是否引起IPEC-J2损伤，结果见图 1。由图 1可知，试验组与对照组相比，ZO-1和Occludin mRNA表达量在6和24 h均极显著下调(P < 0.01)，并且在24 h表达量降低最多，表现为ZO-1和Occludin分别是对照组表达量的40%和45%；LDH的释放量在6 h时极显著高于对照组(P < 0.01)，并且随着沙门菌作用时间的延长，LDH的释放量呈现逐渐上升的趋势。此试验结果显示，沙门菌抑制了IPEC-J2紧密连接蛋白的表达，影响了细胞的屏障功能，导致细胞损伤。
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肩标不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)，肩标不同大写字母表示差异极显著(P < 0.01)，肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下同 Values with different small letter superscripts mean significant difference (P < 0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P < 0.01), while with the same letter superscript means no significant difference (P>0.05). The same as below 图 1 沙门菌引致IPEC-J2损伤 Fig. 1 Salmonella caused IPEC-J2 damage |
用沙门菌刺激IPEC-J2，分析沙门菌对NF-κB/β-catenin信号通路的影响，结果见图 2。由图 2A、2B和2C可知，与对照组相比，试验组TNF-α和IL-8的含量分别在感染后的3和6 h极显著升高(P < 0.01)，并且均随着感染时间的延长而呈极显著增加(P < 0.01)；而试验组NF-κB p65的表达水平在感染后1 h极显著高于对照组(P < 0.01)，并且随着感染时间的延长也呈极显著增加(P < 0.01)。由图 2D、2E和2F可知，与对照组相比，cyclin D1和c-Myc基因的表达量在3 h差异不显著(P>0.05)，在6和12 h差异显著(P < 0.05)，在24 h呈现极显著下降(P < 0.01)；β-catenin的表达水平在3、6和12 h差异不显著(P>0.05)，在24 h呈现极显著下降(P < 0.01)。这些数据表明，沙门菌激活了NF-κB信号通路，引发了细胞炎性反应，此炎症反应强度可能超过了细胞自身调节能力，使细胞出现了炎症损伤；与此同时，沙门菌抑制了β-catenin信号通路，细胞增殖相关蛋白表达下降，减慢了细胞修复的速度，因而细胞损伤速度大于细胞修复速度，最终呈现出细胞损伤。
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图 2 沙门菌对IPEC-J2中NF-κB/β-catenin信号通路的影响 Fig. 2 Effect of Salmonella on NF-κB/β-catenin signaling pathway in IPEC-J2 |
采用NF-κB抑制剂处理细胞，以确定NF-κB信号通路在沙门菌引致IPEC-J2损伤中的作用，结果见图 3。由图 3可知，与空白对照组相比，DMSO处理组的NF-κB p65的表达水平在各时间点无显著差异(P>0.05)，而抑制剂处理组的NF-κB p65表达水平在各时间点均呈现极显著下降(P < 0.01)；DMSO处理组和抑制剂处理组的ZO-1、Occludin、TNF-α、IL-8和LDH的含量在各时间点均无显著差异(P>0.05)，DMSO+沙门菌处理组的NF-κB p65、TNF-α、IL-8和LDH的含量在各时间点均极显著上升(P < 0.01)，ZO-1和Occludin在各时间点却均呈极显著下降(P < 0.01)；与DMSO+沙门菌处理组相比，抑制剂+沙门菌处理组的ZO-1的表达水平在各时间点均呈极显著升高(P < 0.01)，Occludin表达水平在12和18 h也均呈极显著增高(P < 0.01)，同时，伴随NF-κB p65、TNF-α和IL-8的表达以及LDH释放量在各时间点均呈极显著降低(P < 0.01)。此试验结果表明，抑制NF-κB信号通路可以减轻沙门菌引起的IPEC-J2损伤，NF-κB信号通路在沙门菌引致IPEC-J2损伤中发挥着一定的作用。
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图 3 NF-κB信号通路参与沙门菌引起IPEC-J2损伤 Fig. 3 NF-κB signaling pathway involved in Salmonella-induced IPEC-J2 damage |
采用小干扰RNA沉默IPEC-J2中β-catenin基因表达，以确定β-catenin信号通路在沙门菌引致IPEC-J2损伤中的作用，结果见图 4。由图 4可知，与空白对照组相比，阴性对照组(siRNA-NC组)的β-catenin、cyclin D1和c-Myc表达量以及LDH的释放量在各时间点均无显著差异(P>0.05)，siRNA-β-catenin单独处理组、siRNA-NC+沙门菌处理组和siRNA-β-catenin+沙门菌处理组的β-catenin、cyclin D1和c-Myc的表达量在各时间点均呈极显著降低(P < 0.01)；与空白对照组相比，siRNA-β-catenin组、siRNA-NC+沙门菌处理组和siRNA-β-catenin+沙门菌处理组的LDH释放量在各时间点均呈极显著增加(P < 0.01)；与siRNA-NC+沙门菌处理组相比，siRNA-β-catenin+沙门菌处理组的β-catenin、cyclin D1和c-Myc的表达量在各时间点均呈极显著降低(P < 0.01)，LDH释放量在6和12 h均呈极显著增加(P < 0.01)，在18 h呈增加趋势但差异不显著(P>0.05)。此试验结果表明，抑制β-catenin信号通路可以加重沙门菌引起的IPEC-J2损伤，β-catenin信号通路在沙门菌引致IPEC-J2损伤中的发挥着一定作用。
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图 4 β-catenin信号通路参与沙门菌引起IPEC-J2损伤 Fig. 4 β-catenin signaling pathway involved in Salmonella-induced IPEC-J2 damage |
紧密连接是由跨膜和膜相关蛋白组成的多蛋白复合物，在肠道上皮屏障中发挥着重要作用，多种生理、病理因素参与改变紧密连接结构的功能[9]。LDH是一种存在于机体所有组织细胞中胞质内的酶，一旦细胞被损伤破坏，LDH被释放且含量升高。LDH常用来反映组织细胞的损伤以及损伤程度。本试验利用沙门菌感染IPEC-J2细胞，细胞中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达量降低，培养上清液中LDH含量增加，表明紧密连接结构发生改变，细胞屏障功能受到破坏，IPEC-J2细胞受损。
NF-κB是一种多效转录调节因子，可以调控宿主细胞中细胞因子或炎症介质的基因转录，在炎症反应中起关键作用[10]。Lei等[11]利用体外巨噬细胞和体内小鼠模型，分析了鼠伤寒沙门菌毒力因子SrfA引起的炎症反应与NF-κB信号通路的关系，与野生型鼠伤寒沙门菌相比，SrfA缺陷型菌株能够抑制巨噬细胞中NF-κB的活化，降低小鼠炎症反应，提高小鼠存活率。这表明，鼠伤寒沙门菌引起的炎症反应与NF-κB信号通路的激活有一定的关系，并且这种炎性反应与毒力因子SrfA有关系。本试验所用的沙门菌分离株来自肠炎仔猪粪便，经生化试验和16S rRNA鉴定后，确定该菌株为猪霍乱沙门菌，并且该菌株对小鼠具有很强的致病性(数据待发表)。本试验发现，NF-κB信号通路被抑制后，猪霍乱沙门菌能够降低IPEC-J2中NF-κB p65的mRNA表达，以及促炎性细胞因子IL-8、TNF-α的表达和LDH的释放，减轻了细胞损伤。这说明，本试验所用的猪霍乱沙门菌引起的炎症反应与NF-κB信号通路的活化有关，但是本试验所用猪霍乱沙门菌分离株是否具有毒力因子SrfA暂时还不清楚，需要进一步深入研究。除了发现猪霍乱沙门菌分离株对小鼠具有致死性外，本研究还发现，该菌株对IPEC-J2也具有很强的致死性。在本研究前期试验中，分别用浓度为1 × 102 CFU·mL-1(低剂量)、1 × 103 CFU·mL-1(中剂量)和1 × 104 CFU·mL-1(高剂量)的猪霍乱沙门菌刺激IPEC-J2细胞，刺激细胞后6 h通过显微镜观察细胞形态和检测LDH的含量来分析该菌株对细胞的损伤。结果发现，与未刺激的对照组相比，3种剂量的沙门菌对细胞的毒性均显著增强，其中高剂量沙门菌作用细胞6 h后，可见大量细胞不再贴壁而是呈圆形漂浮在培养液中，而中剂量和低剂量沙门菌作用细胞6 h后，细胞仍可贴壁生长并且无可见的形态变化。这说明，分离株作用剂量为1×104 CFU·mL-1时能够严重损伤细胞，对IPEC-J2具有很强的致死性，故在本试验中，我们选择1×103 CFU·mL-1的作用剂量来研究沙门菌引致IPEC-J2细胞损伤。
在机体被细菌感染时，TLRs会通过不同机制激活相关的下游信号通路，NF-κB信号通路的激活和促炎细胞因子的表达与细胞中TLR4的激活有关[12]。以感染产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的仔猪为实验模型，分析嗜酸乳杆菌在NF-κB信号通路中的作用，试验结果为嗜酸乳杆菌通过抑制ETEC诱导的TLR4的表达来抑制NF-κB信号通路的激活，以此减轻ETEC引起的炎症反应[13]。在炎性肠病动物中也观察到NF-κB的表达增加，特别是在黏膜巨噬细胞和上皮细胞中，同时伴有促炎细胞因子(如IL-8、TNF-α)的增加[14]。前人以IPEC-J2为研究对象，验证环境中广泛分布的沙门菌菌株渗透和调节细胞先天免疫的能力，结果显示，有3种沙门菌具有独特的渗透IPEC-J2细胞的能力，且细胞因子IL-8、TNF-α的表达上调，与本试验结果一致，同时，此试验结果也证实了，IPEC-J2细胞是评估宿主-肠道-病原菌相互作用的一个实用模型，并表明，IL-8和TNF-α可能是沙门菌侵袭肠道细胞的预测指标[15]。
目前，与Wnt/β-catenin信号通路有关的研究较多，以沙门菌引起的结肠炎小鼠为试验模型，分析沙门菌对肠道干细胞的调节发现，沙门菌激活了Wnt/β-catenin信号通路，沙门菌蛋白AvrA调节Wnt信号，β-catenin的表达上调，激活了Wnt/β-catenin的转录活性[16]。本试验应用沙门菌感染IPEC-J2细胞，β-catenin的表达量与其调控的靶基因cyclin D1和c-Myc均下降，表示β-catenin信号通路的下调参与沙门菌引起IPEC-J2细胞的损伤。这一结果虽与上述研究结果不一致，但有前人阐述，对于β-catenin发挥抗炎或促炎作用取决于刺激细胞的类型以及与其他信号通路的串扰[17]。Wnt/β-catenin信号通路可以通过抑制或激活NF-κB信号通路，参与炎症反应[18]。敲除小鼠树突状细胞中的β-catenin，用LPS感染细胞，结果显示，激活了NF-κB信号通路和促炎细胞因子的表达，炎症反应增强；此研究揭示了β-catenin的抗炎作用，表明Wnt/β-catenin信号通路或许通过不同的机制对NF-κB的活性产生抑制作用[19]。
Wnt/β-catenin信号通路是生物体中普遍存在的调节细胞增殖和细胞分化的重要信号通路之一，在生长发育等生理过程和肿瘤等病理过程中发挥着重要作用。RNA干扰技术作为一种强大的反基因技术，已广泛应用于沉默相关基因的表达。应用siRNA沉默β-catenin基因来阻断Wnt/β-catenin信号通路，结果显示，下调β-catenin的表达抑制了肾小管上皮细胞转分化，减轻了肾小管上皮细胞组织纤维化[20]。本试验应用siRNA干扰IPEC-J2细胞中β-catenin的表达，再用沙门菌刺激细胞，结果显示，细胞增殖相关蛋白cyclin D1和c-Myc的表达量下降，可能减缓了损伤细胞的修复，致使LDH释放量增加，由此可见，猪霍乱沙门菌感染IPEC-J2后，β-catenin信号通路的下调加重了IPEC-J2细胞的损伤。本试验通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化证实，该信号通路在猪霍乱沙门菌致病性中发挥重要的作用。有相似研究利用痢疾志贺菌感染的大鼠回肠环模型，分析了β-catenin和NF-κB信号通路在炎症反应中的作用发现，痢疾志贺菌促进β-catenin降解和NF-κB信号通路的活化，从而促炎性细胞因子TNF-α和IL-8的生成，引致大鼠回肠炎症，此研究还表明，β-catenin是炎症反应的一个重要调节蛋白[21]。
4 小结本试验用沙门菌感染IPEC-J2后，细胞紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达量下降，细胞屏障功能受损，细胞培养液中LDH含量增高；激活了NF-κB信号通路，促进了TNF-α和IL-8表达，细胞发生炎症反应，造成IPEC-J2损伤，NF-κB信号通路被抑制后，能够降低NF-κB表达量，减轻细胞损伤；沙门菌抑制了Wnt/β-catenin信号通路，降低了β-catenin、cyclin D1和c-Myc表达，减缓了损伤细胞的修复，用siRNA沉默β-catenin的表达后，β-catenin信号通路的下调进一步加重细胞损伤。综上所述，沙门菌通过激活NF-κB信号通路和抑制β-catenin信号通路引致IPEC-J2损伤。
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