2. 重庆市畜牧科学院, 重庆 402460
, ZHAO Wei1, PENG Guorui1, LI Qianlin1, YIN Chunsheng1, YAO Wensheng1, ZHANG Xiukun1, YANG Liu2, FU Lizhi2, CHEN Xiaoyun1, LIU Ying1
2. Chongqing Academy of Animal Sciences, Chongqing 402460, China
腐败梭菌是一种严重危害人类健康和畜禽养殖业的厌氧菌，可引起多种动物的恶性水肿、肌肉坏死、以及羊快疫(braxy)等疾病[1-6]。特别是羊快疫，其病程短促，如不及时对症治疗，动物会迅速死亡[2, 5]。因此，免疫接种是预防该类疫病最有效的途径。目前，通过灭活腐败梭菌培养物而制备的天然类毒素疫苗是预防该菌感染的主要疫苗。但该类疫苗制备过程不仅存在一定的安全隐患，而且有效抗原含量较低，免疫效果不尽理想[7]。因此，筛选安全、有效、纯净的抗原，对于研制新型腐败梭菌病疫苗具有重要意义。已有的研究表明，腐败梭菌的主要致病因子是其产生的外毒素。其中，具有细胞毒性的α毒素是一种关键的致死性毒力因子[8-9]，与致病性有直接的关系[10-14]。陈小云等[15]通过原核表达系统获得了具有良好免疫保护性的重组α毒素，但该蛋白具有很强的毒力，存在较高的安全隐患。杜吉革等[16]通过突变α毒素的4个氨基酸位点，虽然获得了无毒重组α毒素，但该重组蛋白在原核表达系统中主要以非可溶形式表达，且免疫保护性较低。为此，获得无毒性的、以可溶形式表达的、免疫保护性优良的重组α毒素是研制腐败梭菌基因工程亚单位疫苗的重要条件。
α毒素由440或443个氨基酸构成，主要分为D1、D2和D3 3个结构域[17-18]。经蛋白酶水解活化后，前肽从毒素上脱落[19]，并作为分子伴侣促使毒素在细胞膜上作穿梭运动并识别结合受体。与受体结合后，α毒素能与膜相互作用形成膜穿孔复合物，双亲性的β发夹插入细胞膜，在细胞膜上形成离子渗透性孔道，导致细胞内离子和胶质的大量渗出，致使细胞快速死亡[20-21]。Kennedy等[22]研究发现，删除位于D2区的双亲性β发夹跨膜区内的11个氨基酸(第212—222位)不会明显改变毒素分子的正常折叠，但完全丧失了α毒素的细胞毒性和其在腐败梭菌病中的作用。然而，Kennedy等[22]并未验证其免疫保护性。为此，本文通过人工合成的方法删除腐败梭菌C55-1株α毒素的第212—222位氨基酸的编码序列，并通过原核系统进行表达、纯化和鉴定，最后对重组α毒素的毒力和免疫保护性进行了研究。
1 材料与方法 1.1 实验动物、菌株、质粒和试剂1.5~2.0 kg普通级健康日本大耳白兔和16~18 g ICR小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；pET-30a(+)(简称pET)、腐败梭菌C55-1株、腐败梭菌天然毒素、腐败梭菌天然抗血清均为本实验室保存；限制性内切酶NdeⅠ和Hind Ⅲ购自NEB公司；Ni-IDA亲和层析介质试剂盒、蛋白Marker、Western blot Marker均购自南京金斯瑞生物科技有限公司；感受态细胞Top10和BL21(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司；Montanide ISA 201佐剂购自法国赛彼科(seppic)公司；高保真PCR酶(KFX-401S)购自东洋坊；premix Taq version 2.0、DNA Marker购自TaKaRa公司。T4连接酶、DNA凝胶回收试剂盒购自Promaga公司；抗His标签单抗、Bradford蛋白浓度测定试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司；HRP标记的山羊抗鼠IgG以及山羊抗兔IgG均购自索莱宝公司。
1.2 基因合成及密码子优化以已知的腐败梭菌C55-1株的α毒素编码基因为模板，删去毒素的第212—222位(VGLEAIADSKV)共11个氨基酸的编码基因，并在突变基因3′端添加6*His标签蛋白的编码序列，经密码子优化后，人工合成基因片段GCSAΔ11。
1.3 α毒素突变体原核表达载体的构建以GCSAΔ11为模板，采用引物对CSAΔ11-F/CSAΔ11-R进行PCR扩增。其中, 上游引物CSAΔ11-F序列：5′-CGC CATATGACTAATCTGGAG-3′，其5′端引入限制性内切酶NdeⅠ位点(下划线部分)及保护性碱基；下游引物CSAΔ11-R序列：5′- CCG AAGCTTTTAGTGGTGATGATG-3′，其5′端引入限制性内切酶HindⅢ位点(下划线部分)及保护性碱基。将扩增获得的目的片段经NdeⅠ/HindⅢ双酶切消化后，构建至pET-30a(+)中，并对连接后的质粒进行双酶切鉴定和序列测定，最终获得阳性质粒pGCSAΔ11。
1.4 重组蛋白的表达将质粒pGCSAΔ11转化BL21(DE3)感受态细胞，选用IPTG进行诱导表达，诱导温度选择15和37 ℃，诱导时间分别是16和4 h。诱导表达结束后，收集菌体，利用超声破碎的方法分别获得上清和沉淀，并以BSA蛋白为标准，采用SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况，随后，利用灰度扫描的方法对重组蛋白(rCSAΔ11)进行相对表达量和可溶性比例的统计。最后，以抗His标签蛋白抗体为一抗(1:2 000稀释)采用Western blot方法对rCSAΔ11的表达做进一步鉴定。
1.5 重组蛋白的纯化及Western blot鉴定采用Ni-IDA亲和层析介质试剂盒对表达菌裂解上清中的rCSAΔ11进行纯化，用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，-80 ℃保存备用。以腐败梭菌抗血清为一抗(1:5 00稀释)，HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗(1:5 000稀释)对纯化后的rCSAΔ11进行Western blot鉴定。
1.6 重组蛋白的毒力测定已有的研究发现，CSA对小鼠的致死剂量可低至10 μg·kg-1 [23]。为此，本研究按照陈小云等[15]所述方法，将16~18 g ICR小鼠随机分为5组，每组5只。分别以1、10以及100 μg 3个注射剂量注射，同时，设置腐败梭菌培养液作为阴性对照，设置1个MLD的腐败梭菌天然毒素作为阳性对照。其中，样品均用明胶缓冲液进行稀释，注射的液体总体积为200 μL，观察3 d，记录小鼠的存活状态。
1.7 免疫原性分析1.7.1 动物免疫 用Montanide ISA 201佐剂将纯化的rCSAΔ11配制成终浓度为50 μg·mL-1的疫苗，另取灭菌PBS与Montanide ISA 201佐剂以1:1的比例制备对照疫苗，置4 ℃保存备用。选用对腐败梭菌天然毒素血清中和效价为0且体重1.5~2.0 kg健康家兔8只，其中，4只颈部皮下注射疫苗，另外4只作为对照组，注射疫苗对照，剂量均为2.0 mL·只-1。免疫14 d后，对所有家兔进行采血，制备血清备用。同时，进行第二次免疫，二免21 d后，对所有家兔进行采血，制备血清。
1.7.2 血清中和效价测定 将一免14 d后和二免21 d后获得的血清按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)三部中规定的方法[20]测定对腐败梭菌天然毒素的中和抗体效价。
1.7.3 毒素攻毒试验 二免21 d后，按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)三部中规定的方法[24]，对4只对照组家兔和4只免疫组家兔同时进行攻毒保护试验，攻毒剂量为1个家兔最小致死量(MLD)的腐败梭菌天然毒素[15]，攻毒途径为耳缘静脉注射，连续观察5 d。
2 结果 2.1 腐败梭菌α毒素突变体原核表达载体的构建重组质粒的双酶切电泳结果如图 1所示，酶切后出现约为5 kb的载体DNA片段，以及约1 227 bp的目的基因片段，与预期相符。测序结果表明，插入的外源基因序列正确，将此质粒命名为pGCSAΔ11。
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1.DL5000 DNA相对分子质量标准; 2.重组质粒pGCSAΔ11Nde Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切鉴定 1. DL5000 DNA marker; 2. pGCSAΔ11 digested with Nde Ⅰ/Hind Ⅲ 图 1 重组原核表达质粒pGCSAΔ11的酶切鉴定 Fig. 1 Identification of recombinant prokaryotic expression plasmids pGCSAΔ11 |
重组蛋白的SDS-PAGE和Western blot检测结果显示，在15和37 ℃的诱导条件下，rCSAΔ11均以可溶性的形式表达(图 2a)，相对分子质量约为50 ku，大小与预期相符，且能与抗His标签抗体发生反应(图 2b)。进一步的灰度扫描结果显示，37 ℃、诱导4 h后，重组蛋白的表达量以及可溶性(46%)均优于其他诱导条件(图 2a*)。因此，确定目的蛋白最适诱导表达条件为37 ℃，诱导表达4 h。
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a.重组蛋白表达的SDS-PAGE鉴定；b.重组蛋白与抗His单抗反应的Western blot；M1.蛋白相对分子质量标准；M2. Western blot蛋白相对分子质量标准；1. BSA (1 μg)；2. BSA (2 μg)；3. pET 37 ℃诱导的细胞裂解物；4. pGCSAΔ11 15 ℃诱导的细胞裂解物；5. pGCSAΔ11 37 ℃诱导的细胞裂解物；6. pET 37 ℃诱导的细胞裂解上清；7. pET 37 ℃诱导的细胞裂解沉淀；8. pGCSAΔ11 15 ℃诱导的细胞裂解上清；9. pGCSAΔ11 15 ℃诱导的细胞裂解沉淀；10. pGCSAΔ11 37 ℃诱导的细胞裂解上清；11. pGCSAΔ11 37 ℃诱导的细胞裂解沉淀 a. The identification of recombinant protein expression by SDS-PAGE; b. The identification of recombinant protein with anti-His monoclonal antibody by Western blot; M1. Protein marker; M2. Western blot marker; 1. BSA (1 μg); 2. BSA (2 μg); 3. The cell lysates of pET induced with IPTG under 37 ℃; 4. The cell lysates of pGCSAΔ11 induced with IPTG under 15 ℃; 5. The cell lysates of pGCSAΔ11 induced with IPTG under 37 ℃; 6. The supernatant of cell lysates of pET induced with IPTG under 37 ℃; 7. The precipitation of cell lysates of pET induced with IPTG under 37 ℃; 8.The supernatant of cell lysates of pGCSAΔ11 induced with IPTG under 15 ℃; 9. The precipitation of cell lysates of pGCSAΔ11 induced with IPTG under 15 ℃; 10. The supernatant of cell lysates of pGCSAΔ11 induced with IPTG under 37 ℃; 11. The precipitation of cell lysates of pGCSAΔ11 induced with IPTG under 37 ℃ 图 2 rCSAΔ11的原核表达与鉴定 Fig. 2 Prokaryotic expression and identification of rCSAΔ11 |
如图 3所示，按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒说明书对rCSAΔ11进行纯化，收集纯度较高的洗脱液(图 3*)进行透析，采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定rCSAΔ11浓度，可达1.1 mg·mL-1。经SDS-PAGE和灰度扫描方法进行检测，rCSAΔ11的纯度可达90%以上。将纯化后的rCSAΔ11经SDS-PAGE后转移到PVDF膜上进行Western blot检测。结果如图 4箭头所示，rCSAΔ11能够与腐败梭菌天然毒素抗血清反应。
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M.蛋白相对分子质量标准; 1.诱导的细胞裂解物上清；2.上清与Ni-IDA孵育后流出液；3.20 mmol·L-1 Imidazole的洗脱液；4.50 mmol·L-1 Imidazole的洗脱液；5.500 mmol·L-1 Imidazole的洗脱液 M. Protein marker; 1. The supernatant of cell lysates after centrifugation; 2. The flow-through from Ni-IDA resin after incubated with supernatant; 3. The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer (contain 20 mmol·L-1 Imidazole); 4. The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer (contain 50 mmol·L-1 Imidazole); 5. The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer (contain 500 mmol·L-1 Imidazole) 图 3 rCSAΔ11的纯化 Fig. 3 Purification of rCSAΔ11 |
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M.蛋白相对分子质量标准；1. BSA；2.纯化后的rCSAΔ11 M. Protein marker; 1. BSA; 2. rCSAΔ11 after purification 图 4 rCSAΔ11与腐败梭菌抗毒素反应的Western blot鉴定 Fig. 4 The identification of rCSAΔ11 after purification with antitoxin serum of Clostridium septicum by Western blot |
结果如表 1所示，注射1个MLD的腐败梭菌天然毒素后，小鼠在72 h内全部死亡，rCSAΔ11注射组及阴性对照小鼠均存活，结果表明，100 μg rCSAΔ11对小鼠仍无致死性。
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表 1 样品的注射以及小鼠存活情况 Table 1 Injection of sample and the mouse survival |
利用腐败梭菌天然毒素测定家兔血清的中和效价，结果如表 2所示，每0.1 mL一免兔血清可中和8~12个小鼠MLD的腐败梭菌天然毒素；每0.1 mL二免兔血清可中和32~45个小鼠MLD的腐败梭菌天然毒素，而佐剂对照组的兔血清对腐败梭菌天然毒素无中和作用。
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表 2 rCSAΔ11的免疫保护结果及家兔血清中和抗体效价 Table 2 Immunoprotection of rCSAΔ11 and neutralizing titers of rabbit antiserum |
如表 2所示，经耳缘静脉注射1个家兔MLD的腐败梭菌天然毒素后，对照组家兔在攻毒后5 d内全部(4/4)死亡，疫苗免疫组家兔全部(4/4)健活。
3 讨论目前，用于预防腐败梭菌病的商品化疫苗主要有羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗，羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症四联灭活疫苗，以及羊梭菌病多联干粉灭活疫苗等，但该类疫苗中的有效抗原(腐败梭菌α毒素)较低，且生产过程中需采用含有动物脏器等天然成分较多的培养基，易导致产毒不稳定，难以保证批间一致性，导致疫苗抽检不合格的情况时有发生[7]，为此，抗原成分单一且纯净的基因工程亚单位疫苗的研制显得极为重要。
基因工程亚单位疫苗研制的关键是免疫原的研究与筛选。已有研究表明，虽然腐败梭菌菌株的α毒素基因序列不完全相同，但用上述α毒素制成类毒素免疫动物后，可以产生完全的交叉保护[25-26]，这说明α毒素是腐败梭菌重要的保护性抗原。因此，腐败梭菌α毒素成为众多学者的研究对象。彭国瑞等[5]分别将含有穿孔活性区的α毒素N末端和受体结合区的C末端进行表达，获得了rCSAN和rCSAC。进一步的分析结果表明，以上两种重组蛋白均失去了毒性但保留了反应原性，而免疫保护性丧失，这说明α毒素的完整性是确保其免疫保护性的重要因素。张燕等[27]及彭国瑞[28]从腐败梭菌中扩增获得α毒素的编码基因，并通过原核表达系统获得重组α毒素，但该蛋白大部分以包涵体的形式存在，不利于后期的生产纯化。陈小云等[15]及董令赢[29]对α毒素的编码基因按大肠杆菌偏爱的密码子进行了优化并合成，分别通过原核表达载体pET30a和pET28a成功获得了可溶性表达比例较高、免疫保护性良好的重组α毒素(rCSA)，但rCSA对小鼠的毒力可达1.302~1.465 μg·kg-1，具有很强的安全隐患。为此，本研究利用基因合成技术获得了缺失D2区双亲性β发夹结构中11个氨基酸编码序列的重组基因片段GCSAΔ11，并将其构建至原核表达载体pET30a中进行表达和纯化，从而获得了无毒性的、可溶性表达比例达46%的rCSAΔ11。与通过氨基酸点突变获得的无毒性重组α毒素相比[16, 30]，本研究获得的rCSAΔ11在实际使用过程中回复突变概率更低，安全性更高。进一步的研究结果显示，用rCSAΔ11对家兔进行一次免疫后，该组家兔对腐败梭菌天然毒素的血清中和效价可达8~12 MLD·0.1 mL-1，与rCSA的免疫保护效果没有显著差异(10~13 MLD·0.1 mL-1)[15]。以上结果表明，rCSAΔ11在失去毒力的同时，仍保留了良好的免疫保护性，从而为腐败梭菌亚单位疫苗的研制提供了重要的候选抗原。
4 结论获得腐败梭菌无毒性重组α毒素rCSAΔ11，它能与腐败梭菌天然毒素抗血清反应，丧失了对小鼠的毒力，免疫家兔可使兔耐过1个家兔MLD的腐败梭菌天然毒素攻毒，保留了良好的免疫保护性。
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