2. 华派生物工程集团有限公司, 成都 610000;
3. 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部/四川省重点实验室, 成都 610041
, ZHOU Qun1, FU Nengsheng1, CAO Hui1, HE Xinyi1, FANG Pengfei2, HU Chengzhe1, ZHANG Bin1,3*
2. Huapai Biological Engineering Group Co., Ltd, Chengdu 610000, China;
3. Key Laboratory of Animal Genetic Resources Protection and Utilization in Qinghai-Tibet Plateau, Ministry of Education/Sichuan Province, Chengdu 610041, China
猪捷申病又称塔尔凡病，是由猪捷申病毒(porcine teschovirus，PTV)引起的猪脊髓灰质炎、繁殖障碍、肺炎、痢疾、心包炎和心肌炎、皮肤破损等多种表现的病毒性传染病[1-2]。PTV只能够以猪作为宿主，隐性感染猪是非常重要的传染源，目前，该病已成为全球养猪业重要传染病之一[3-4]。2003年，哈尔滨兽医研究所在我国内蒙古自治区首次分离到了PTV[5]，目前，该病毒在我国多地已有报道[3]。
PTV在病毒分类学上属于小RNA病毒科捷申病毒属[6]，因广泛存在于猪肠道内而被归类于猪肠道病毒[7]。病毒粒子为球形，无囊膜，直径20~30 nm，内部核心是单股正链RNA，长约7.2 kb，含有1个完整的开放阅读框(ORF)，ORF经蛋白酶切割加工后形成P1、P2和P3 3种多肽前体，其中，P1为衣壳蛋白的前体，经过加工成熟后为PTV的衣壳蛋白；P2和P3均为非结构蛋白的前体，成熟后形成一些中间前体产物，这些产物都非常稳定，参与病毒复制的各项生命活动[8]。P1区编码VP1、VP2、VP3和VP4 4种结构蛋白[9-11]。VP1是PTV的主要结构蛋白之一，在VP1蛋白编码基因区域中设计的引物适用于血清型分型的评估[11-12]，PTV已鉴定13种血清型，依据所有血清型标准毒株的基因组序列，分别对应PTV-1~PTV-13[13-14]，各个地区流行的血清型不同[15]。PTV存在同源重组现象，PTV重组大多发生在不同血清型之间[16-17]，也存在同种血清型之间的PTV重组[15]。据报道不同血清型毒株的毒力也存在差异，导致的临床症状也不同。PTV-1的强毒株可导致严重的捷申病毒脑脊髓灰质炎，PTV-1的其他弱毒株及其他血清型能引起温和型或隐性感染[2]。为了初步调查四川藏猪PTV的流行情况及其分子特性，本研究对2017—2018年采集自四川省甘孜藏族自治州康定市的14个藏猪场共96份粪便样本进行了PTV的检测，并对其全基因序列进行遗传进化分析研究。
1 材料与方法 1.1 主要试剂KOD OneTM PCR Master Mix Blue和Quick Taq HS DyeMix购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；Trizol总RNA提取试剂、反转录试剂盒和DL2000TM DNA Marker购自TaKaRa生物技术有限公司；凝胶成像仪购自上海天能科技有限公司；TGL-16冷冻离心机购自四川蜀科仪器有限公司；PCR仪购自杭州博日科技有限公司。
1.2 病料采集与处理病料为2017—2018年采自四川省甘孜藏族自治州康定市的14个藏猪场共96份猪粪便样本，96份粪便样本中50份为正常粪便样本，46份为腹泻样本。按1:5加入PBS震荡混匀，反复冻融3次后，10 000 r·min-1离心5 min，取上清于-80 ℃冻存备用。
1.3 引物的设计与合成参考报道的PTV检测引物[18]进行合成，序列如下，上游引物：5′-TGTTGTGTTTAAACACAGAAAT-3′，下游引物：5′-TTCAACTGACTATACAAAGTAC -3′，扩增产物的大小约238 bp。参考GenBank上已经发表的13种PTV血清型全长基因组序列，根据保守区域，对20份PTV阳性的cDNA进行全基因的扩增，使用DNAStar软件分别设计7对引物(表 1)并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
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表 1 PTV全基因扩增引物 Table 1 Whole gene amplification primers of PTV |
用Trizol法抽提样本中总RNA。按照反转录试剂盒说明书制备cDNA。反应体系：总RNA4 μL，5×Buffer 2 μL，oligo (dT) 0.5 μL，反转录酶0.5 μL，RNase-Free Water 3 μL；反转录程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s，16 ℃保存。将反转录获得的cDNA放置-20 ℃保存备用。
1.5 藏猪腹泻样本中PTV阳性率的调查以“1.3”中合成的PTV检测引物对cDNA样本进行PCR扩增，PCR反应体系：Quick Taq HS DyeMix 5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 3 μL。反应程序：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环35次，72 ℃延伸8 min。
1.6 PTV全基因组序列的克隆及分析用RT-PCR法对PTV全基因进行分段扩增，KOD OneTM PCR Master Mix Blue 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1.5 μL，ddH2O 9 μL。PCR反应条件：98 ℃ 10 s、54 ℃/47 ℃/52 ℃/51 ℃/55 ℃/54 ℃/56 ℃ 5 s、68 ℃ 10 s，循环35次。PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。根据凝胶回收试剂盒说明书进行回收纯化，按照pMDTM19-T Vector Cloning Kit说明书进行连接，并转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆送生工生物工程(上海)有限公司进行测序。用DNAStar等分子生物学软件，将序列拼接，取VP1基因分别与GenBank不同血清型PTV毒株的VP1进行序列比对，绘制系统发生树，分析其遗传进化关系，最终确定其血清型。
1.7 PTV重组分析为了分析不同来源的PTV毒株之间的遗传关系和重组关系，以RDP4软件的Chimaera、MaxChi、RDP、GENECONV、SiScan和3Seq方法进行重组分析，利用SimPlot程序对每个簇分别进行相似性分析，对重组区和非重组区构建独立的进化树以验证重组。
1.8 PTV分歧时间估算以贝叶斯进化分析软件(BEAST v1.8.0)的BEAUti程序设置序列的采样时间、氨基酸置换模型、分子钟模型、马尔科夫链长和先验参数。以BEAST程序运算，通过MCMC方法进行树的重复抽样，获得具有最大后验概率的进化树。通过TreeAnnotator程序设置Burnin值。以FigTree v1.4.4软件对进化树进行修饰和分歧时间的标定，分析病毒序列的演化过程。
2 结果 2.1 PTV核酸阳性样本检出率利用PTV检测引物[18]，以RT-PCR方法对14个规模化藏猪场的96份粪便样本进行检测。结果显示：在粪便样本中，PTV核酸阳性率为20.8%(20/96，95%CI=13.2%~30.3%)；14个规模化藏猪场中，PTV猪场阳性率为57.1%(8/14，95%CI=28.9%~82.3%)，结果表明PTV在藏猪中存在且流行。阳性样本中腹泻样本为9份，正常样本为11份，说明健康猪带毒和隐性感染普遍存在。
2.2 两株PTV全基因扩增和序列分析对20份PTV检测阳性的样本均进行了全基因组扩增，最后获得了2条近似全基因组序列，PTV SWU-E5-2018全基因组扩增结果(图 2)。将序列命名并上传至GenBank，分别为SWU-E5-2018 (GenBank accession No. MT295503)、SWU-ZG2-2018 (No.MT295502)。SWU-E5-2018序列长度为6 760 bp，GC含量为44.3%；SWU-ZG2-2018序列长度为6 766 bp，GC含量为44.5%。
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M. DNA相对分子质量标准；泳道1~24.部分临床样品 M. DNA marker; Lanes 1-24. Some clinical samples 图 1 部分临床样本中PTV的RT-PCR检测 Fig. 1 RT-PCR assay of some clinical samples |
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M. DNA相对分子质量标准；泳道1~7.各引物片段扩增结果 M. DNA marker; Lanes 1-7. Amplification results of each primer fragment, respectively 图 2 PTV SWU-E5-2018全基因组扩增结果 Fig. 2 Complete genome amplification results of PTV SWU-E5-2018 strain |
通过MEGA7.0对本研究中2条藏猪源PTV序列与49条参考序列进行全基因组核苷酸序列遗传进化树分析(图 3A)。结果表明在核苷酸水平51条PTV全基因组序列可分为2个大的分支，血清1型、血清3型、血清10型和血清11型为一个大的分支；其他的血清型为一个大的分支。按进化树分析结果可知，SWU-E5-2018与HuN2亲缘关系最近，SWU-ZG2-2018与HuN16亲缘关系最近。运用MegAlign进行序列同源性分析，结果表明：2条PTV序列之间的全基因组核苷酸相似性为83.1%，与GenBank上已报道的69个毒株之间的全基因组核苷酸相似性为79.9%~91.3%。2条PTV序列之间ORF区的核苷酸相似性为82.8%，氨基酸序列相似性为86.3%；与GenBank上已报道的69株毒株之间ORF区核苷酸相似性为78.9%~91.2%，氨基酸序列相似性为82.8%~92.8%。为进一步研究藏猪源PTV的分子特征，对2条PTV序列ORF区各基因进行同源性分析(表 2)，发现VP1基因的遗传变异性较大，与NCBI中毒株相似性最低为60.8%。VP1基因系统进化分析结果表明(图 3B)，SWU-E5-2018属于PTV-3血清型。与HuN2遗传关系最近，其VP1核苷酸的相似性达到92.8%，氨基酸相似性达96.6%，与其他血清型的毒株之间亲缘关系较远，核苷酸的相似性只有63.8%~75.7%。SWU-ZG2-2018属于PTV-6血清型，与HuN16遗传关系最近，其VP1核苷酸相似性为93.7%，氨基酸相似性达97.7%，与国内PTV-6型毒株相似性为82.0%~89.9%，与德国PTV-6型Vir-3634/85株相似性为81.5%，与其他血清型毒株之间的核苷酸相似性为60.8%~ 80.1%。结果说明PTV不同血清型毒株之间VP1基因差异很大。
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A为全基因遗传进化树；B为VP1基因遗传进化树，●为本研究序列 A is the whole gene genetic evolutionary tree; B is the VP1 gene genetic evolutionary tree, ●stand for the sequences of this study 图 3 2条PTV核苷酸序列遗传进化树 Fig. 3 Genetic evolutionary tree of two PTV nucleotide sequences |
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表 2 两条PTV序列ORF基因相似性 Table 2 Gene homology of two PTV ORF sequences |
通过RDP4和SimPlot软件对2条PTV序列全基因组进行重组分析，结果显示，SWU-E5-2018其衣壳蛋白P1片段中存在重组，选取重组序列SWU-E5-2018、亲本序列JF613和一条序列JPN/Ishi-Im9/2016/G1，利用SimPlot软件进行相似性分析(图 4A)，以断点位置为界，将SWU-E5-2018序列划分成重组区域(552—3 082 bp)和两个非重组区域(1—551 bp、3 083 bp—3′end)。通过MEGA 7.0软件的Neighbour-Join法对3个区域的核苷酸序列分别构建进化树(图 4B、4C、4D)，基于重组区域构建的进化树较非重组区域显示出不一致的遗传系统发育关系，进一步支持了SWU-E5-2018中的重组事件。
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A为SimPlot相似性分析结果；B为非重组区核苷酸构建的进化树；C为重组区域构建的进化树；D为非重组区域构建的进化树 A is the SimPlot similarity analysis result; B is the evolutionary tree constructed by the nucleotide in the non-recombinant region; C is the evolutionary tree constructed by the recombinant region; D is the evolutionary tree constructed by the non-recombinant region 图 4 PTV全基因组重组分析 Fig. 4 Whole gene recombination analysis of PTV |
为进一步研究PTV的进化过程，通过BEAST v1.8.0软件对71条确定采样时间的PTV全基因序列进行分歧时间的估算。将fasta格式的序列导入BEAST软件中，先用BEAUti程序处理序列生成XML格式文件，采用贝叶斯马尔可夫链-蒙特卡罗(MCMC)算法进行分析，通过BEAUti输出模型的拓扑结构、分支长度和核苷酸替换模型等参数进行重复抽样，得到稳定的参数分布，输出最大后验概率值的贝叶斯进化树，用FigTree软件进行展示(图 5)。估算出SWU-E5-2018的分歧时间约为2010年，SWU-ZG2-2018的分歧时间约为2011年。使用不同符号标出PTV在我国主要流行的几个地区，可以看出大多数毒株的分歧时间都早于SWU-E5-2018、SWU-ZG2-2018，结果表明，PTV很有可能是由内地猪群传染给藏猪。BEAUti输出模型的拓扑结构、分支长度和核苷酸替换模型等参数进行重复抽样，得到稳定的参数分布，输出最大后验概率值的贝叶斯进化树，用FigTree软件进行展示(图 5)。估算出SWU-E5-2018的分歧时间约为2010年，SWU-ZG2-2018的分歧时间约为2011年。使用不同符号标出PTV在我国主要流行的几个地区，可以看出大多数毒株的分歧时间都早于SWU-E5-2019、SWU-ZG2-2018，结果表明, PTV很有可能是由其他地区猪群传染给藏猪。
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横坐标为时间刻度, 结点处示病毒分化的时间点; 不同符号示病毒采集地 The abscissa is the time points, the node shows the time point of virus differentiation, and different symbols indicate the collection place of virus 图 5 2条PTV序列的贝叶斯进化树 Fig. 5 Bayesian evolutionary tree of two PTV sequences |
目前，报道PTV至少有13个血清型，不同血清型毒株致病力不同，基因组也存在明显差异，严重感染可造成猪群大量死亡，轻微者也可无明显症状。1930—1950年，PTV毒株使欧洲养猪业蒙受了巨大的经济损失，但随后其毒力下降，高致病性的毒株被弱毒株所取代，虽然毒力不强，但此病毒的危害仍不容忽视[19]。藏猪是青藏高原特有的高原地方猪种，生活在青藏高原海拔2 500 ~ 4 300 m的农区和半农半牧区，是瘦肉型小型猪，放牧饲养较为原始，对高海拔恶劣气候有极强的适应能力，抗病力强，藏猪常年在田间放牧，牛羊混群饲养过程中相互接触，在一定程度上为病毒的交叉感染提供了机会[20-21]，但关于PTV在藏猪中的感染及流行并不清楚。本研究通过对2017—2018年采集自四川省甘孜藏族自治州康定市的14个藏猪场共96份藏猪粪便样本进行PTV的检测，流行病学初步调查结果表明，在粪便样本中，PTV阳性率为20.8%(20/96，95%CI=13.2%~30.3%)；14个规模化藏猪场中，PTV检出率为57.1%(8/14，95%CI=28.9%~82.3%)，说明PTV在藏猪中已存在且具有流行性。
本研究对20份PTV检测阳性的样本均进行了全基因组扩增，最后只获得了2条近似全基因组序列，长度分别为6 760和6 766 bp，全基因组扩增成功率较低，仅为10%，可能是因为不同血清型之间VP1基因差异很大。运用MegAlign进行序列同源性分析，结果表明：2条PTV序列之间的全基因核苷酸相似性为83.1%，与GenBank上已登录毒株之间的全基因核苷酸相似性为79.9%~91.3%。2条PTV序列之间ORF区的核苷酸相似性为82.8%，氨基酸序列相似性为86.3%；与GenBank上已登录毒株之间ORF区核苷酸相似性为78.9%~ 91.2%，氨基酸序列相似性为82.8%~92.8%。2条PTV序列之间的VP1基因核苷酸相似性为65.9%，氨基酸序列相似性为72.1%，说明不同血清型之间VP1基因差异很大，PTV的VP1基因平均进化速率为每个位点每年2.46×103个替换[9]，高于目前研究中获得的多聚蛋白基因，VP1氨基酸的变异是不同血清型PTV毒株毒力不同的主要原因[22]。国内外41株PTV主要结构蛋白VP1构建系统发育树，结果表明2条PTV序列的血清型分别为3型和6型。国内主要报道的血清型为1型、2型、4型、8型、9型和10型[7-17]，对3型和6型毒株的报道较少，致病性有待进一步研究。
通过RDP4和SimPlot软件对2条PTV序列全基因组进行重组分析，结果显示SWU-E5-2018存在重组现象，重组位点位于衣壳蛋白P1区，本研究中SWU-E5-2018的重组来源于不同血清型之间。大多数关于PTV重组的报道都发生在不同血清型之间，Yang等[15]首次报道了PTV的重组也可来自同种血清型。表明PTV具有高度的遗传多样性。对于PTV的氨基酸替换，特别是对于结构蛋白P1和ORF区的变异，可能影响PTV的复制、抗原表位和毒力，这些病毒蛋白质变化的生物学意义还需要进一步研究。“分子钟”是遗传学和分子生物学建立的一种模型，能够通过分析遗传数据解决大量流行病学问题[23-25]。本研究利用BEAST v1.8.0对71株PTV的全基因进行了分歧时间的估算，估算出SWU-E5-2018的分歧时间约为2010年，SWU-ZG2-2018的分歧时间约为2011年，说明PTV可能是于2010年由其他地区猪群传染给藏猪的。由于本研究是四川首次报道PTV，之前国内也并没有藏猪PTV相关报道，所以有关藏猪PTV在四川藏区的遗传变异规律需进一步研究。
猪是PTV的唯一宿主，病毒主要分布在猪的神经组织中，成年猪在自然条件下感染PTV后，呈隐性感染状态，可能不表现出任何临床症状，但猪体可长期带毒和排毒。PTV在其演化过程中极易发生重组，藏区放牧饲养在一定程度上为病毒的交叉感染提供了机会，因此加强饲养管理以预防PTV在藏猪之间的交叉感染尤为重要。
4 结论对采集自四川省甘孜藏族自治州康定市的14个藏猪场共96份藏猪粪便样本进行PTV检测，并对部分阳性样品进行全基因组的序列分析和基因分型，获得了2条近似PTV全基因组序列；通过重组分析发现SWU-E5-2018存在重组现象；遗传进化研究表明，藏猪PTV很有可能是由其他地区感染猪群传染给藏猪。
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