, BAN Fuguo, WANG Dongfang, LIU Ying, ZHAO Xueli, XIE Caihua, WANG Cui, MA Zhenyuan, YANG Haibo, CHAI Mao, YAN Ruoqian
非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种急性、高度接触性传染疫病[1]，可引起猪高热、精神沉郁、皮肤发绀、食欲废绝、出血性病变和共济失调，并伴有严重的血小板和淋巴细胞减少，感染动物通常在感染后10~14 d内死亡，病死率可达100%[2]。ASFV基因组为双链DNA，大小170~194 kb[3]。病毒基因可编码200多种蛋白质，其中，结构蛋白有54种，P72是一种结构蛋白，是病毒衣壳的主要组成部分，P72基因序列保守，不同毒株之间都有相同的保守序列[4]。
猪瘟(classical swine fever, CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高致死性、烈性传染病[5]，以稽留高热、出血、母猪流产为主要特征。该病主要通过呼吸道和消化道传染，传播速度快，发病率和死亡率都很高，给全球养猪业带来巨大的经济损失[6-7]。CSFV属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，为单股正链RNA病毒。CSFV基因组全长12.3 kb，主要由5′非编码区(5′UTR)、开放阅读框(ORF)和3′非编码区(3′UTR)3部分组成，5′UTR由360~374个碱基组成，具有很高的保守性，能够形成复杂稳定的二级结构[8]。
非洲猪瘟和猪瘟引起的临床症状极为相似，必须借助实验室检测进行鉴别诊断。目前，非洲猪瘟病毒的检测方法很多，血清学方法有间接ELISA、阻断ELISA和间接荧光抗体试验；病原学方法有病毒的细胞培养和分离、直接免疫荧光、双抗体夹心ELISA、普通PCR和荧光定量PCR (FQ-PCR)等，其中，OIE推荐的普通PCR和荧光定量PCR是最为常用的实验室检测方法[9]。现有的CSFV诊断方法有免疫荧光、ELISA、病毒分离、RT-PCR等，但这些方法都存在敏感性、特异性低及耗时等不足，且不能区分野毒株和疫苗株[10-12]。
在已有的研究基础上，作者根据ASFV的P72基因和CSFV的5′UTR非编码区序列保守的特点，分别设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针，可在一个反应体系内同时检测ASFV和CSFV野毒株，为ASFV和CSFV野毒株的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异的临床检测方法。
1 材料与方法 1.1 阳性物质和毒(菌)株ASFV目的基因由宝生物工程(大连)有限公司合成；猪瘟活疫苗购自广东永顺生物制药股份有限公司；灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、副猪嗜血杆菌(HPS)等均由河南省动物疫病预防控制中心实验室提供。
1.2 仪器设备与主要试剂全自动核酸提取仪，美国Thermo公司产品；荧光PCR仪，美国ABI公司产品；PCR扩增仪，德国Biometra公司产品；凝胶成像分析系统，美国Alpha Innotech公司产品；台式高速冷冻离心机，美国Heraeus公司产品；核酸提取试剂盒购自西安天隆科技有限公司；PrimeScript RT Master Mix、Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、酶抑制剂等均购自宝生物工程(大连)有限公司；M-MLV反转录酶、pGEM-T Easy载体等购自Promega公司。
1.3 标准品的制备利用全自动核酸提取仪从ASFV人工合成片段中提取核酸，即为ASFV DNA，-20 ℃冻存备用。利用全自动核酸提取仪从CSFV野毒株阳性样品中提取核酸，并用随机引物反转录成为cDNA，-20 ℃冻存备用。采用PCR方法分别扩增ASFV的P72基因和CSFV野毒株的5′UTR非编码区目的基因，并将阳性扩增产物分别克隆入pGEM-T Easy载体中，筛选阳性重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司，采用T7和SP6引物进行测序。测序正确的ASFV的P72基因和CSFV的5′UTR非编码区基因的阳性重组质粒(分别命名为pGEM-ASFV、pGEM-CSFV)，应用分光光度计测定其OD260 nm和OD280 nm值及OD260 nm/OD280 nm值，共重复5次，参考Kim等[13]介绍的方法计算其浓度，获得ASFV和CSFV阳性标准品，-20 ℃保存备用。
1.4 引物和探针的设计和合成根据ASFV的P72基因和CSFV的5′UTR非编码区序列保守的特点，分别比对GenBank中ASFV的P72基因和CSFV的5′UTR非编码区序列，应用Primer Premier6.0基因分析软件，设计两对特异性引物对和两条TaqMan MGB探针，分别命名为ASFV-P1、ASFV-P2、ASFV-Probe-P3、CSFV-P4、CSFV-P5、CSFV-Probe-P6，引物序列见表 1。引物和探针均由Invitrogen公司合成。
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表 1 二重TaqMan MGB FQ-PCR引物和探针序列 Table 1 The primers and probes sequences of duplex TaqMan MGB FQ-PCR |
pGEM-ASFV、pGEM-CSFV重组质粒分别稀释至终浓度1.0×105拷贝·μL-1作为检测模板，P1/P2、P4/P5引物对分别稀释至终浓度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和1.0 μmol·L-1，Probe-P3、Probe-P6探针分别稀释到终浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和1.0 μmol·L-1，应用荧光PCR仪采用矩阵法筛选不同浓度的针对pGEM-ASFV和pGEM-CSFV扩增的引物/探针组合；在56、57、58、59、60、61和62 ℃的退火温度下进行扩增。筛选鉴别ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR最佳引物浓度、探针浓度和最佳反应条件。
1.6 敏感性试验和标准曲线的建立将pGEM-ASFV和pGEM-CSFV阳性重组质粒分别进行10倍系列稀释，2种质粒按1:1比例混合，每种质粒终浓度调整为1.0×106~1.0×100拷贝·μL-1，共7个稀释度，以纯水为阴性对照，按优化好的FQ-PCR反应条件进行ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR敏感性试验。分别以pGEM-ASFV和pGEM-CSFV阳性重组质粒起始模板浓度的对数为X轴，以FQ-PCR循环次数Ct值为Y轴作回归曲线，建立ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR方法的标准曲线。
1.7 特异性试验对猪瘟病毒疫苗株(CSFV-Vac)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、副猪嗜血杆菌(HPS)、阴性对照等提取核酸并将CSFV-Vac、PRRSV、JEV核酸进行反转录，同时，以ASFV和CSFV阳性标准品为阳性对照，按优化好的反应条件进行二重FQ-PCR扩增以验证该方法的特异性。
1.8 重复性试验分别将3个浓度的10倍系列稀释的pGEM-ASFV和pGEM-CSFV阳性重组质粒等量混合物(每种质粒终浓度1.0×105~1.0×103)按照优化的FQ-PCR反应条件进行扩增，每个系列设定3个重复，分成3个批次进行验证该方法的重复性。
1.9 应用试验对20份疑似CSFV感染样品(样品编号：1~20)、10份临床疑似ASFV感染样品(样品编号：21~30)和20份健康猪样品(样品编号：31~50)分别采用本研究建立的鉴别ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR方法和猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法检测进行实验室检测，同时，以ASFV和CSFV阳性标准品为阳性对照，以纯水为阴性对照。对这些方法的检测结果进行比较分析。
2 结果 2.1 标准品浓度测定计算pGEM-ASFV、pGEM-CSFV质粒DNA溶液的浓度分别为8.75×1010、7.96×1010拷贝·μL-1，分别定量稀释至1.0×100~1.0×106拷贝·μL-1。
2.2 鉴别ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR方法反应体系与反应条件的优化本研究对引物与探针浓度进行优化，以提高反应的扩增效率与敏感度。优化出25 μL反应体系：ASFV-P1、ASFV-P2、CSFV-P4、CSFV-P5终浓度各为0.4 μmol·L-1，探针ASFV-Probe-P3终浓度为0.4 μmol·L-1，探针CSFV-Probe-P6终浓度为0.6 μmol·L-1，2.5 mmol·L-1 dNTPs 2 μL，10×Ex Taq酶缓冲液2.5 μL，5 U·μL-1 Ex Taq DNA聚合酶0.3 μL，1.0×105拷贝·μL-1的质粒模板各2 μL，去离子水补足至总体积25 μL。最佳反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，40个循环。最佳反应条件下的二重FQ-PCR结果见图 1。
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1.ASFV重组质粒; 2. CSFV重组质粒; 3.阴性对照; 4~10. CSFV-Vac、PRRSV、PRV、PCV2、PPV、JEV和HPS 1. Recombinant plasmid of ASFV; 2. Recombinant plasmid of CSFV; 3. Negative control; 4-10. CSFV-Vac, PRRSV, PRV, PCV2, PPV, JEV and HPS 图 1 鉴别ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR方法建立及特异性试验结果 Fig. 1 Establishment and specificity analysis of duplex TaqMan MGB FQ-PCR |
二重FQ-PCR对pGEM-ASFV和pGEM-CSFV阳性重组质粒的最低检出限均为1.0×101拷贝·μL-1(图 2)。由敏感性检测结果建立ASFV标准曲线，相关系数R2为0.996，斜率为-4.161，截距为39.17，从而得出拷贝数(x)与Ct值之间的线性关系表达式：y=-4.161lgx+39.17(图 3A)；由敏感性检测结果建立CSFV型标准曲线，相关系数R2为0.997，斜率为-3.582，截距为37.87，从而得出拷贝数(x)与Ct值之间的线性关系表达式：y=-3.582lgx+37.87(图 3B)。
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A. ASFV；B. CSFV；1~7.分别对应的质粒浓度1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100拷贝·μL-1；8、9.阴性对照 A. ASFV; B. CSFV; 1-7. The plasmid concentrations is 1.0×106, 1.0×105, 1.0×104, 1.0×103, 1.0×102, 1.0×101, 1.0×100copies·μL-1, respectively; 8, 9. Negative control 图 2 ASFV、CSFV FQ-PCR方法的敏感性试验 Fig. 2 Sensitivity tests of ASFV, CSFV FQ-PCR |
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A. ASFV；B. CSFV; x为拷贝数 A. ASFV; B. CSFV; x. Copies number 图 3 ASFV、CSFV FQ-PCR方法标准曲线 Fig. 3 The standard curve of ASFV, CSFV FQ-PCR |
根据标准曲线，初步将判定标准定为如果被检样本的PCR反应体系通道出现2条特定的扩增曲线，且Ct值≤33.0，则可判定为非洲猪瘟病毒及猪瘟野毒株核酸阳性；如果被检样本的PCR反应体系通道无特定的扩增曲线，且Ct值＞35.0或无，则判定为非洲猪瘟病毒及猪瘟野毒株核酸阴性；如果被检样本的PCR反应体系通道出现特定的扩增曲线，且33.0＜Ct值≤35.0，则判定为非洲猪瘟病毒核酸和/或猪瘟野毒株核酸检测可疑，需重复检验，重复检验Ct值≤35.0，则判定为阳性，反之为阴性；如果仅在“FAM”标记模式下出现特定的扩增曲线且Ct值≤33.0，则判定为非洲猪瘟病毒核酸阳性；如果仅在“VIC”标记模式下出现特定的扩增曲线且Ct值≤33.0，则判定为猪瘟野毒株核酸阳性。
2.4 特异性试验ASFV、CSFV阳性标准品FQ-PCR扩增Ct值分别为17.02和19.87且出现特定的扩增曲线；阴性对照和CSFV-Vac、PRRSV、PRV、PCV2、PPV、JEV、HPS等均未出现特定的扩增曲线(图 1)，说明本方法特异性良好。
2.5 稳定性和重复性试验ASFV FQ-PCR方法和CSFV FQ-PCR方法批内重复和批间重复试验变异系数(CV值)均在3%以下，扩增效率稳定，表明建立的鉴别ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR方法具有很好的稳定性和重复性。
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表 2 ASFV FQ-PCR方法稳定性和重复性试验 Table 2 The results of ASFV FQ-PCR stability and repeatability |
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表 3 CSFV FQ-PCR方法稳定性和重复性试验 Table 3 The results of CSFV FQ-PCR stability and repeatability |
采用本研究建立的鉴别ASFV、CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法对50份临床样品进行检测，共检测出17份CSFV阳性、3份ASFV阳性，检测结果与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法检测结果完全一致，表明本研究建立的鉴别ASFV、CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法具有较高的特异性和敏感性，可用于临床ASFV和CSFV野毒株的鉴别诊断。
3 讨论ASF最早于1921年在肯尼亚暴发，随后相继扩散至欧洲、中美洲、非洲和亚洲的多个国家[14]，该病病程短、发病率和死亡率几乎达100%，中国首例非洲猪瘟疫情于2018年8月在辽宁沈阳暴发[15]，随后疫情持续在我国迅速蔓延开来，严重威胁着我国养猪业的发展。CSF传播速度快，发病率和死亡率都很高，给全球养猪业带来巨大的经济损失。这两种疫病都被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告的动物疫病，也是中国动物病原微生物名录中规定的一类动物传染病[16-19]。
虽然距首次发现ASFV至今已将近百年，但目前世界上仍没有可有效预防ASFV感染的疫苗，也无有效的治疗药物，仅能依赖有限的抗原检测方法对ASFV感染开展早期诊断，进而通过扑杀感染动物来实现对ASF疫情的控制。目前, 我国也有针对猪瘟的疫苗，但疫苗生产企业众多，疫苗质量参差不齐，免疫失败时有发生，且CSF的临床表现趋于复杂化，典型性病例减少[20]，单凭临床症状很难确诊。且由于ASF与CSF等其他出血性猪病的发病症状非常相似，很难通过临床诊断的方法进行区分，只能依靠实验室方法进行鉴别诊断。因此，建立对ASFV和CSFV野毒株快速、特异、敏感的鉴别诊断方法对疫情防控尤为重要。
国内外很多学者建立了ASFV和CSFV的PCR或荧光定量PCR方法，Aguero等[21]根据ASFV VP72基因设计引物，建立了用于ASFV早期感染的快速诊断方法；Basto等[22]建立了可用于检测蜱虫体内ASFV的套氏PCR方法；崔尚金等[23]建立了ASFV的高效纳米PCR检测方法；King等[24]、黄萍等[25]、Tignon等[26]多个研究团队先后以ASFV VP72基因为靶基因建立基于TaqMan的ASFV实时荧光定量PCR检测方法；Mckillen等[27]根据9GL基因建立MGB探针实时荧光定量PCR检测方法。Risatti等[28]首次建立了CSFV的FQ-PCR方法；Liu等[29]将CSFV检测一步RT-PCR方法与FQ-PCR方法进行了比较，认为前者适合低成本检测，后者能实现高通量；Ciglenecki等[30]对染料法和MGB探针法进行了比较，认为MGB探针法定量优于前者。但是这些PCR检测方法的灵敏度和特异性均相对偏低，且不能实现ASFV和CSFV的鉴别检测。
本研究建立的鉴别ASFV、CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法是在同一反应体系中进行ASFV和CSFV的扩增反应，同时收集不同的荧光信号，对扩增产物进行实时检测，从而实现ASFV和CSFV野毒株的鉴别检测。本研究建立的FQ-PCR方法采用TaqMan MGB探针，与传统的TaqMan探针相比，TaqMan MGB探针缩短了探针的长度，大大提高了探针的Tm值，也降低了探针的合成成本，TaqMan MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，其本身不产生荧光信号，可大大降低本底信号的强度，使扩增结果更加特异、敏感。本研究建立的方法操作简便、速度快，可在1 h内完成ASFV和CSFV野毒株的鉴别检测。
本研究建立的鉴别ASFV、CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法是根据ASFV和CSFV野毒株基因序列保守区设计引物和探针，方法对ASFV和CSFV野毒株的最低检测模板浓度均为10拷贝·μL-1，特异性强，稳定性和重复性良好；对50份临床样品进行检测，检测结果与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法结果完全一致。因此，本研究建立的鉴别ASFV、CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法为ASFV和CSFV野毒株的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的新方法。
4 结论成功建立了可对非洲猪瘟病毒和猪瘟病毒野毒株鉴别检测的二重TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测方法，该方法敏感性高、特异性强、重复性好，对临床样品的检测结果与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法结果完全一致。该方法的建立为ASFV和CSFV野毒株的鉴别诊断提供了新的检测方法。
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