牛病毒性腹泻(bovine viral diarrhea，BVD)和牛传染性鼻气管炎(infectious bovine rhinotracheities，IBR)是危害牛等反刍动物的两类重要疫病，病原分别为牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)和牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheities virus，IBRV)。BVDV和IBRV常混合感染牛群，引起多种临床症状，对奶牛及肉牛养殖业造成了很大危害[1-3]。目前临床尚无有效治疗药物，国内早期通常采用接种猪瘟兔化弱毒疫苗来预防BVD的发生[4]。2016年，商品化的BVD疫苗出现，为BVD-IBR二联灭活苗，这也填补了国内IBR疫苗的空白[5]。传统疫苗的出现有效地降低了BVD和IBR的发病率和防治成本，但同时也带来一些无法避免的问题。灭活疫苗的优点在于安全性较高[6]，但他们通常诱导较弱的中和抗体反应和较短的保护期[7]。相较于灭活苗，弱毒疫苗虽然能产生较强的免疫力且免疫保护周期较长[8]，但其存在较大的安全隐患，可能会引起流产、胎儿感染等不良反应[9]。为了探究更具前瞻性的防治措施，具有免疫反应持续时间长、安全性高、容易改造、储存运输方便等优点的核酸疫苗[10-12]成为了当下的研究热点。虽然也有学者担心重组质粒有可能整合到宿主基因组，但迄今为止还没有试验数据来证实这种危险性[13]。
目前，国内外已经发表了较多针对BVD或IBR的核酸疫苗的研究，普遍利用其优势抗原基因作为核酸疫苗的靶基因且得到了较好的研究成果。国内石明[14]对作为核酸疫苗靶基因的BVDV囊膜蛋白E0和E2的疫苗免疫效果进行了综合评价，结果显示可分别诱导较好的体液免疫和细胞免疫。国外Deshpande等[15]发现利用携带IBRV gD基因的质粒表达gD蛋白，能诱导小鼠产生抵抗IBRV的细胞毒性T细胞，为机体提供保护力；除gD外，以gC和gE为靶基因的核酸疫苗也得到研究，国内张帆等[16-17]先后构建IBRV gC、IBRV gE真核表达载体，并对其反应原性进行了研究。但是，对能够同时防制BVD和IBR的二联核酸疫苗的研究却未见报道。因此，本试验计划扩增BVDV E0和IBRV gD目的基因，将两者插入pVAX1-IRES中，构建pVAX1-E0-IRES-gD重组质粒，转染293T细胞，利用间接免疫荧光试验检测E0和gD在293T细胞中的表达情况。此外，将pVAX1-E0-IRES-gD肌内注射免疫小鼠，研究其免疫效应。通过上述试验过程及结果，为BVD-IBR二联核酸疫苗的研究提供参考。
1 材料与方法 1.1 毒株、质粒、细胞和实验动物BVDV NADL病毒株、IBRV HVRI-002病毒株购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心；pVAX1质粒、MDBK细胞、BVDV和IBRV牛源阳性血清均由宁夏大学农学院预防兽医学实验室保存；大肠杆菌DH5α购自索莱宝生物科技有限公司；293T细胞株由宁夏大学农学院动物遗传育种实验室馈赠；18~22日龄SPF级小鼠，购自宁夏医科大学实验动物中心；BVD-IBR二联灭活苗(商品名：哞乐优)购自金宇保灵有限公司。
1.2 主要试剂及试剂盒PBST、BSA、TMB显色液、PEG6000(索莱宝)；限制性内切酶(NEB)；PrimeSTAR HS DNA聚合酶、rTaq DNA聚合酶、DNA T4连接酶(TaKaRa)；兔抗牛IgG-FITC荧光二抗、HRP标记的兔抗鼠IgG(Abcam)；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒、快速质粒小提试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒(Tigen)；Lipofectamine 3000转染试剂盒(Thermo Fisher)；小鼠γ干扰素(IFN-γ)酶联免疫吸附测定试剂盒、小鼠白细胞介素4(IL-4)酶联免疫吸附测定试剂盒(Elabscience)。
1.3 引物的设计与合成根据GenBank中的参考序列，利用Prime premier设计用于扩增BVDV E0、IBRV gD基因和IRES元件的引物(表 1)。在扩增BVDV E0基因和IBRV gD基因的5′端均引入了Kozak序列，这段序列的加入有助于后期重组质粒的表达等试验顺利进行。E0基因预期扩增大小为706 bp，包括684 bp的基因编码区和酶切位点及Kozak序列；gD基因预期扩增大小为1 275 bp，包括1 254 bp的基因编码区和酶切位点及Kozak序列。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
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表 1 试验所用引物序列 Table 1 Primers sequences |
取出-80 ℃保存的BVDV和IBRV细胞培养物，反复冻融3次，利用DNA/RNA提取试剂盒提取病毒基因组。以获得的IBRV DNA溶液为模板，对gD基因进行扩增，PCR反应体系：5× PrimeSTAR Buffer (Mg2+ Plus) 10 μL，dNTP Mixture 4 μL，上下游引物各0.2 μL，基因组1.5 μL，ddH2O 34.1 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s；55 ℃退火15 s；72 ℃延伸2 min；35个循环；72 ℃延伸10 min。以获得的BVDV RNA溶液为模板，按反转录试剂盒操作步骤合成cDNA。对E0基因进行扩增，PCR反应体系：10×Buffer (Mg2+ Plus) 5 μL，dNTP 4 μL，rTaq酶0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 3 μL，RNase free水36.5 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR反应后进行2%琼脂糖凝胶电泳，100 V 30 min，用凝胶成像仪观察结果并拍照。利用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化目的基因E0和gD。
1.5 真核表达载体的构建1.5.1 pVAX1-IRES载体的构建与鉴定 将本实验室保存的pIRES-AcGFP1质粒作为模板，扩增IRES序列。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s；60 ℃退火15 s；72 ℃延伸1 min；35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR反应体系：5× PrimeSTAR Buffer (Mg2+ Plus) 10 μL，dNTP Mixture 4 μL，上下游引物各0.2 μL，pIRES-AcGFP1质粒1 μL，ddH2O 34.6 μL，合计50 μL。PCR反应后进行2%琼脂糖凝胶电泳，110 V 30 min，用凝胶成像仪观察结果并拍照。利用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化IRES片段，利用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pVAX1和IRES后，进行连接与转化。产物经双酶切鉴定并送至上海生工生物工程公司测序。
1.5.2 pVAX1-E0-IRES-gD重组质粒的构建与鉴定 用AfIⅡ、BamHⅠ同时双酶切pVAX1-IRES和E0基因后，进行连接和转化。产物经双酶切鉴定，鉴定阳性者送往上海生工生物工程公司测序，得到重组质粒pVAX1-E0-IRES。将pVAX1-E0-IRES和gD基因均使用EcoRⅠ和PstⅠ双酶切后，进行连接和转化。产物经双酶切鉴定，鉴定阳性者送往上海生工生物工程公司测序，得到重组质粒pVAX1-E0-IRES-gD。
1.6 间接免疫荧光法检测目的基因的表达依照天根无内毒素质粒大提试剂盒操作步骤提取空载体pVAX1-IRES和重组质粒pVAX1-E0-IRES-gD，调整两者质量浓度为1.0 μg·μL-1。复苏293T细胞并将其接种至六孔板中培养至细胞贴壁75%~85%。将构建好的重组质粒pVAX1-E0-IRES-gD和空载体pVAX1-IRES按照Lipofectamine 3000试剂说明书分别转染293T细胞，另设空白对照。转染48 h后，利用一抗(BVDV、IBRV阳性血清)和二抗(兔抗牛IgG-FITC)进行间接免疫荧光试验(IFA)，检测E0和gD基因在293T细胞中的转录和表达情况。
1.7 小鼠免疫试验1.7.1 动物免疫试验设计 将108只SPF级小鼠分为6个试验组，Ⅰ~Ⅲ组为重组质粒pVAX1-E0-IRES-gD注射组，质粒注射量分别为50、100和200 μg·只-1；Ⅳ组为空载体pVAX1-IRES注射组(100 μg·只-1)；Ⅴ组为PBS对照组(0.2 mL)；Ⅵ组为BVD-IBR灭活苗注射组(0.2 mL)。免疫方式均为小鼠腿部肌内注射，初次免疫2周后加强免疫1次。各组小鼠分别于首免前0 d，首免后7、14、21、28、42 d进行颌下静脉采血，收集血清保存于-20 ℃备用；在0、14、28、42 d 4个时间点每组随机选取2只小鼠，颈椎脱臼法处死后无菌采取脾，用于随后的脾淋巴细胞增殖试验。所有动物试验均严格按照国家研究委员会实验动物护理和使用指南的要求进行，并已提交宁夏大学实验动物伦理与福利委员会批准(批准号：NXU-ACAU-2019-010)。
1.7.2 免疫小鼠血清中gD和E0抗体水平检测 采用ELISA方法分别检测两次免疫后的小鼠血清中gD和E0特异性抗体水平的变化。对BVDV和IBRV进行增殖，将病毒培养液反复冻融3次，利用PEG6000进行病毒的纯化。将纯化好的病毒按照1:100的比例包被酶标板，4 ℃过夜。PBST洗板3次，用含1% BSA的PBST作为封闭液，37 ℃作用2 h，洗去封闭液。加入1:200倍稀释的待检血清，37 ℃作用1 h后洗板5次。加入HRP标记的兔抗鼠IgG酶标二抗(1:8 000)，37 ℃作用1 h。最后依次加入TMB显色液和终止液(2 mol·L-1硫酸)。用酶标仪检测450 nm波长处各孔OD值。
1.7.3 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖试验 采用噻唑蓝比色法(MTT)检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况。无菌采取小鼠脾进行淋巴细胞分离并制备脾淋巴细胞悬液，用1640完全培养液调整悬液中细胞数至1×106个·mL-1。按每孔100 μL依次加入96孔板中，每个样品做3个重复。加入终质量浓度为10 μg·mL-1的ConA溶液，轻轻混匀后置于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养48 h。在结束培养前4 h取出细胞培养板，轻轻吸出上清液后加入5 mg·mL-1的MTT溶液10 μL·孔-1，继续培养4 h后每孔加入100 μL DMSO以终止反应。震荡15 min后测定各孔OD490 nm值。
1.7.4 免疫小鼠血清中细胞因子IFN-γ和IL-4检测 参照小鼠IFN-γ酶联免疫吸附测定试剂盒和小鼠IL-4酶联免疫吸附测定试剂盒说明书，检测小鼠首免后42 d采集的血清中细胞因子IFN-γ和IL-4的含量。
1.7.5 免疫小鼠血清中的中和抗体检测 依照微量血清中和试验(固定病毒-稀释血清法)对免疫小鼠血清中的中和抗体水平进行检测。将首免后42 d的小鼠血清60 ℃灭活30 min，自1:2开始进行2倍稀释。稀释好的血清分别与200 TCID50的BVDV NADL病毒株、IBRV HVRI-002病毒株等体积混合于96孔细胞培养板，置于37 ℃温箱中孵育1 h，每孔加入定量MDBK细胞悬液。同时设病毒回归试验作为参考。37 ℃、5% CO2培养箱中培养48~72 h，逐日观察细胞病变情况。采用Reed-Muench两氏法计算被检血清的中和抗体效价。
1.7.6 数据处理 使用EXCEL软件对数据进行整理；利用SPSS 20.0对各组内数据进行单因素方差分析；采用GraphPad Prism 8.0作图。
2 结果 2.1 目的基因的扩增以提取的BVDV cDNA溶液和IBRV DNA溶液为模板分别扩增E0和gD基因。取PCR产物各0.5 μL，进行2%的琼脂糖凝胶电泳(图 1)。电泳图显示E0片段约为706 bp，gD片段约为1 275 bp，与预期大小相符。
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M. DNA相对分子质量标准(2000)；1. BVDV阴性对照；2. BVDV NADL株；3. IBRV HVRI-002株；4. IBRV阴性对照 M. DNA marker (2000); 1. BVDV negative control; 2. BVDV NADL strain; 3. IBRV HVRI-002 strain; 4. IBRV negative control 图 1 BVDV E0基因(A)、IBRV gD基因(B)的PCR扩增 Fig. 1 PCR amplification of BVDV E0 (A), IBRV gD (B) |
对构建好的重组质粒进行双酶切鉴定(图 2)，双酶切鉴定阳性者送上海生工测序。结果显示，pVAX1-E0-IRES重组质粒中包含E0基因编码区684 bp，AfIⅡ和BamHⅠ酶切位点及Kozak序列均得到正确引入，说明E0序列正确插入pVAX1-IRES中IRES序列的上游区域；pVAX1-E0-IRES-gD中包含gD基因编码区1 254 bp，EcoRⅠ和PstⅠ酶切位点和Kozak序列均得到正确引入，说明gD序列正确插入pVAX1-E0-IRES中IRES片段的下游区域，成功构建pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体。
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M. DNA相对分子质量标准(8000)；A图中1、2、3分别为BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pVAX1-IRES、pVAX1、IRES的PCR产物；B图中1、2、3分别为AfIⅡ和BamHⅠ双酶切pVAX1-E0-IRES、pVAX1-IRES、E0的PCR产物；C图中1、2、3分别为EcoRⅠ和PstⅠ双酶切pVAX1-E0-IRES-gD、pVAX1-E0-IRES、gD的PCR产物 M. DNA marker (2000); in Fig.A, 1, 2, 3 represent enzyme digestion of pVAX1-IRES, pVAX1, IRES by BamHⅠand EcoRⅠ, respectively; in Fig.B, 1, 2, 3 represent enzyme digestion of pVAX1-E0-IRES, pVAX1-IRES, E0 by AfIⅡand BamHⅠ, respectively; in Fig.C, 1, 2, 3 represent enzyme digestion of pVAX1-E0-IRES-gD, pVAX1-E0-IRES, gD by EcoRⅠand PstⅠ, respectively 图 2 重组质粒的双酶切鉴定 Fig. 2 Enzyme digestion and identification of recombinant plasmid |
间接免疫荧光结果见图 3。质粒转染48 h后进行间接免疫荧光试验，在倒置显微镜下观察免疫荧光产生情况。结果显示，分别使用IBRV阳性血清和BVDV阳性血清作为一抗，使用兔抗牛IgG-FITC作为二抗，转染pVAX1-E0-IRES-gD重组质粒的细胞中有绿色荧光产生；而pVAX1-IRES空载体组和正常细胞组未见绿色荧光。
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A、C、E、G分别为pVAX1-E0-IRES-gD转染组(一抗BVDV阳性血清)、pVAX1-E0-IRES-gD转染组(一抗IBRV阳性血清)、pVAX1-IRES空载体转染组、正常细胞对照组在荧光激发下的状态；B、D、F、H分别为A、C、E、G各组细胞未被荧光激发的状态 A, C, E, G are cells transfected by pVAX1-E0-IRES-gD(Primary antibody added with BVDV positive serum), cells transfected by pVAX1-E0-IRES-gD(Primary antibody added with IBRV positive serum), cells transfected by no-carrier of pVAX1-IRES vector, the normal MDBK cells under fluorescence; B, D, F, H are negative control for A, C, E, G 图 3 重组质粒在293T细胞中的表达情况 Fig. 3 Expression of recombinant plasmid in 293T cells |
使用ELISA方法检测免疫小鼠血清中抗体产生情况，结果以各样品的OD450 nm值表示。试验结果显示，在首免后7 d，相较于空载体组及PBS对照组，不同剂量的pVAX1-E0-IRES-gD重组质粒组抗E0和gD IgG抗体水平均有所增长，且200 μg免疫组极显著性增加(P < 0.01)，提示高剂量免疫组能够迅速产生较高水平的抗体。自首免后14~42 d，高剂量免疫组抗E0和gD IgG抗体的增长水平持续极显著性高于其余两剂量组(P < 0.01)，而中低两剂量组抗体水平无显著性差异(P>0.05)。此外，自首免后28 d至试验结束，BVD-IBR灭活疫苗免疫组的抗E0和gD IgG抗体水平和200 μg免疫组无显著性差异(P>0.05)，且代表抗E0 IgG抗体水平的OD450 nm均值在试验最后1 d还略高于BVD-IBR灭活苗免疫组。
2.5 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖试验使用MTT法检测ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖情况。结果显示，自首免后14~42 d，相较于pVAX1-IRES空载体对照组和PBS组，pVAX1-E0-IRES-gD重组质粒组和BVD-IBR灭活苗免疫组的脾淋巴细胞增殖能力不断提高。其中，不同剂量的pVAX1-E0-IRES-gD重组质粒组中以200 μg剂量脾淋巴细胞增殖能力最强，极显著高于其余两组(P < 0.01)，100 μg剂量显著性高于50 μg剂量组(P < 0.01)。
2.6 免疫小鼠血清中细胞因子产生情况采用ELISA方法检测首免后42 d小鼠血清中IFN-γ和IL-4的含量。分析所得试验数据发现(表 2)，小鼠血清中细胞因子IFN-γ和IL-4含量均表现为200 μg剂量组最高，100 μg剂量组次之，50 μg剂量组最低，高剂量极显著高于其余两组(P < 0.01)，中剂量组和低剂量组无显著性差异(P>0.05)，且中高剂量组显著性高于空载体组和PBS组。高剂量组与BVD-IBR灭活苗免疫组无显著性差异(P>0.05)。将不同试验组的IFN-γ和IL-4含量单独比较发现，IL-4整体含量较高于IFN-γ。
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表 2 各试验组小鼠血清内IFN-γ、IL-4检测情况 Table 2 The results of IFN-γ and IL-4 in each experimental mice serum |
本试验对IgG抗体水平较高时期的血清进行体外的病毒中和试验，试验结果见表 3。首免后42 d的小鼠血清中，除空载体组和PBS组外，其余各试验组均检测到中和抗体。随着真核表达质粒免疫剂量的增加，被检血清中和抗体效价也呈现出增高的趋势。血清在1:64的稀释度时，200 μg高剂量组和灭活疫苗组的病毒抑制率仍在50%以上，均显著性高于50 μg低剂量组和100 μg中剂量组(P < 0.05)，但两者之间并无显著性差异(P>0.05)。
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表 3 各试验组小鼠血清内中和抗体水平 Table 3 Neutralizing antibody titers of serum in different groups |
目前，防控BVD和IBR疫病的主要途径是疫苗接种，针对这两类疫病的二联灭活苗和弱毒苗已在我国部分牛场得到应用。但从长远来看，传统疫苗的使用并不利于BVD和IBR的净化且制备工艺繁琐并存在安全隐患，所以高效、安全、易于大量制备的核酸疫苗便成为了当下的研究热点。本次试验选用BVDV、IBRV的主要保护性抗原E0、gD，由于抗原性较强，这二者常作为构建核酸疫苗的靶基因。E0基因高度保守，对病毒的感染具有重要的调控作用且有利于病毒的持续性感染，其所表达的蛋白病毒和细胞接触过程中的主要结构蛋白，是宿主中和抗体的主要靶标[18]。在IBRV的主要糖蛋白中，gD基因编码的糖蛋白免疫原性良好[19]，能够诱导最高水平的血清抗体应答，被认为是制备核酸疫苗的首选蛋白[20]。本试验构建了真核表达载体pVAX1-IRES，利用IRES元件将BVDV E0和IBRV gD连接到表达载体中，成功构建了重组质粒pVAX1-E0-IRES-gD。IRES元件的存在可以使E0和gD同时进行翻译，目前已广泛用于表达双目标基因的真核质粒的构建上，通常将其序列插入两个目标基因序列之间来行使功能[21-22]。pVAX1载体也已广泛用于重组质粒的构建，该载体含有多个克隆酶切位点，允许同时克隆多个大片段的目的基因[23-24]，本研究选用其中的AfIⅡ、PstⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ四个酶切位点来完成目的基因和其他序列的导入。此外，由于pVAX1载体属于非融合载体，在目的基因前插入Kozak序列能够增加其转录和翻译能力[25]。因此，在合成引物时给E0和gD序列前端突变了Kozak序列，以保证两段基因的高效表达。另外，pVAX1具有的强启动子pCMV和BGH poly A信号可以在哺乳动物细胞中高水平的表达重组蛋白，是其主要优势所在[26-27]。将重组质粒pVAX1-E0-IRES-gD转染至293T细胞，利用间接免疫荧光法检测其免疫原性，结果显示，pVAX1-E0-IRES-gD中的E0和gD蛋白均得到表达。
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同一时间大写字母无相同者为差异极显著(P < 0.01)；同一时间小写字母无相同者为差异显著(P < 0.05) The difference in capital letters at the same time is extremely significant (P < 0.01); the difference in lowercase capital letters at the same time is significant (P < 0.05) 图 4 不同免疫组E0抗体检测结果 Fig. 4 The results of E0 antibody test in different immune groups |
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同一时间大写字母无相同者为差异极显著(P < 0.01)；同一时间小写字母无相同者为差异显著(P < 0.05) The difference in capital letters at the same time is extremely significant (P < 0.01); the difference in lowercase letters at the same time is significant (P < 0.05) 图 5 不同免疫组gD抗体检测结果 Fig. 5 The results of gD antibody test in different immune groups |
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同一时间大写字母无相同者为差异极显著(P < 0.01)；同一时间小写字母无相同者为差异显著(P < 0.05) The difference in capital letters at the same time is extremely significant (P < 0.01); the difference in lowercase letters at the same time is significant (P < 0.05) 图 6 小鼠脾淋巴细胞增殖情况 Fig. 6 The proliferation of mouse spleen lymphocytes |
为了鉴定pVAX1-E0-IRES-gD重组质粒的免疫效应，我们采用肌内注射的方式免疫小鼠，进行小鼠免疫试验，通过采集小鼠血清和脾，检测血清内抗体水平、细胞因子含量及脾淋巴细胞增殖情况。试验数据表明，pVAX1-E0-IRES-gD可刺激小鼠同时产生抗E0和gD的IgG抗体，抗体水平随着免疫时间的延长而升高。国内梁霄勇[28]将E0插入到pVAX1真核表达载体上，构架重组质粒pVAX1-E0，一免后试验组与空载体抗体水平差异显著(P < 0.05)，二、三免后抗体水平依旧处于上升阶段；Toussaint等[29]外国学者构建了编码IBRV gD的核酸疫苗并将其注射至牛体内进行试验，结果发现，随着免疫时间的增加，诱导牛的体液免疫和细胞免疫逐渐增强。本研究结果与梁霄勇[28]、Toussaint等[29]的研究相符合。在体外病毒中和试验后，发现首免后42 d的小鼠血清中产生了分别针对BVDV和IBRV的中和抗体，且随着重组质粒免疫剂量的增加其抗体效价也有了显著提升。虽然BVD-IBR灭活疫苗组中和抗体效价略高于200 μg剂量组，但两者并无明显差异，试验结果与仝晓丹[30]的研究相符合。通过分析不同剂量组的抗体水平，发现本重组质粒具有剂量依赖性，即免疫剂量越高，其产生的抗体水平越高。细胞因子含量方面，首免后42 d的小鼠血清中均产生了IFN-γ和IL-4，说明重组质粒免疫小鼠后可刺激机体同时产生Th1和Th2型免疫应答。将不同试验组的IFN-γ和IL-4含量单独比较发现，IL-4整体含量较高于IFN-γ。另外，脾淋巴细胞增殖能力也随着免疫时间而持续增强。
多价核酸疫苗的出现不仅降低了疫苗的接种成本，还缓解了动物的接种压力，可谓一举两得。本试验构建的pVAX1-E0-IRES-gD可以刺激小鼠产生特异性抗体及细胞因子，为BVD-IBR二联核酸疫苗的研究提供了参考。同时，试验中也存在一些不足之处，在小鼠免疫试验中应该通过更准确的梯度试验来确定重组质粒用量；应该在不同时间点来分析细胞因子的含量变化；要应用于实际生产时还需通过宿主动物攻毒试验等来确定其免疫效应，以上问题还需要进一步研究解决。
4 结论构建同时表达牛病毒性腹泻病毒E0和牛传染性鼻气管炎病毒gD基因的重组质粒pVAX1-E0-IRES-gD，体外表达检测证明目的蛋白具有良好的反应原性，动物免疫试验证明其能刺激机体产生良好免疫应答。
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