2. 中国农业科学院特产研究所, 长春 130112;
3. 大连海关技术中心, 大连 116001
2. Institute of Special Animal and Plant Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130112, China;
3. Dalian Customs Technical Center, Dalian 116001, China
水貂(Neovison vison)属于鼬科鼬属，肉食性珍贵毛皮动物，貂皮为其主要产品，被称作“软黄金”，是水貂经济价值的重要体现，用作貂皮服装及服饰制品的主要原料[1]。随着人们生活水平和消费质量的不断提高与改善，越来越多的消费者转向需求优质、绿色和环保的毛皮产品，不经过化学染色的纯天然彩色毛皮产品逐渐受到更多消费者的关注[2-3]。因此，生产优质、绿色和环保的毛皮产品已成为水貂新品种培育的前提，更是产业需要紧迫解决的核心问题[4]。毛色是关联水貂毛皮品质及价值的重要质量性状，也是其优良品种培育过程中需要制定的一项关键育种目标，要求具有本品种的毛色特征，全身一致，无杂色毛，颌下或腹部白斑不超过1.0 cm2或无白斑，并且个体间色调均匀[5]。因此，探明水貂毛色性状分子遗传机理，进而培育具有天然色彩的优异个体对其品种推广利用工作尤为重要，具有较大的科研与经济价值。
已有研究表明，脊椎动物肤色、毛色及羽色主要取决于皮肤、毛发及羽毛中黑色素种类、数量及比例，目前，研究相对清楚的有真黑色素(黑与褐)和褐黑色素(红与黄)[6]。在黑色素形成过程中，酪氨酸酶的活性决定了黑色素合成量的多少，因此，编码该酶的酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)基因已成为解析色素沉积性状分子机理的关键突破口。在TYR基因SNPs筛查方面，Anistoroaei等[7]研究发现，TYR基因编码区变异(138.TGT→TGA)可能导致蛋白结构功能域缩短，与丹麦水貂白化被毛性状相关。Blaszczyk等[8]利用Southern杂交表明，TYR基因外显子4缺失与雪貂白化相关。Damé等[9]研究表明，白化水牛TYR基因位点g.1403G>A引起终止密码子形成，导致无活性蛋白合成，与水牛被毛白化性状关联较大。在TYR基因mRNA与蛋白表达方面，Anello等[10]通过qPCR研究表明，白色被毛羊驼皮肤组织TYR基因mRNA表达量显著低于稀释和非稀释被毛个体(P < 0.05)，分析揭示，TYR基因表达水平在羊驼被毛色素沉积中具有重要调控功能。赵若阳等[11]利用qPCR和Western blot研究均表明，越背花毛蒙古马黑色被毛对应皮肤中TYR基因mRNA与蛋白表达量极显著高于白色毛对应皮肤(P < 0.001或P < 0.01)，综合推测，过量且具有活性的TYR是促进越背花毛蒙古马黑色被毛部位皮肤合成较多真黑色素的主要因素。目前，仅见水貂TYR基因部分cDNA序列报道[12]，而该基因完整编码区序列(coding sequence，CDS)的结构特性、SNPs及其皮肤组织mRNA表达规律与水貂毛色性状的关系尚不明晰。
为进一步解析水貂被毛色素沉积分子调控机制，本研究通过克隆水貂TYR基因完整编码区序列，分析CDS分子结构特性，筛查部分外显子SNPs及明确该基因在不同毛色水貂皮肤组织mRNA差异表达规律，探究变异位点和mRNA差异表达与毛色性状的关系，旨在深入解析TYR基因调控水貂毛色表型的功能，为加快分子标记辅助选择技术应用于优质毛色水貂品种的选育与改良提供新思路。
1 材料与方法 1.1 试验材料金州黑水貂(黑色，JZH，120只)、名威银蓝水貂(灰色，MWYL，95只)和红眼白水貂(白色，HYB，86只)共计301只7月龄雄性个体的血液取自中国农业科学院特产研究所特种畜禽实验基地(吉林，左家)和大连名威貂业有限公司(辽宁，金州)。于毛皮成熟期(12月初)，选择黑、灰与白色被毛水貂各3只，采集背中部皮肤1 cm2左右，液氮保存。
1.2 主要试剂全血DNA提取试剂盒、Ex Taq DNA聚合酶、Trizol Reagent和反转录试剂盒均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；SYBR® Select Master Mix购自Thermo Fisher公司。
1.3 水貂血液基因组DNA与皮肤RNA的提取利用全血DNA提取试剂盒获得水貂基因组DNA，采用Trizol法提取皮肤RNA，参考反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，保存于－20 ℃冰箱。
1.4 引物设计、PCR扩增与克隆测序参考GenBank数据库中雪貂(EF405957)、海豹(XM_004412938)、绵羊(HQ875337)和家兔(NM_ 001082077)等哺乳动物的TYR基因编码区全序列，经过BioEdit 7.2软件进行比对后，利用Primer Primier 5.0软件在5个外显子两端的保守区域分别设计5对扩增完整外显子的引物，以TYR-1、TYR-4和TYR-5作为检测SNPs的引物，根据前期获得的水貂皮肤转录组测序数据中TYR基因mRNA序列[13]设计qRT-PCR引物T-1，选取β-actin作为qRT-PCR内参基因。引物由上海生工生物工程有限公司合成，相关信息见表 1。
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表 1 水貂TYR基因克隆、SNPs筛查及qRT-PCR引物 Table 1 Primers for CDS clone, SNPs detection and qRT-PCR of mink TYR gene |
PCR体系为25 μL：模板DNA 1.0 μL，Ex Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.25 μL，dNTPs 2.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，上、下游引物(10 pmol·μL-1)各1.0 μL，灭菌超纯水17.25 μL。PCR程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火(温度见表 1)30 s，72 ℃延伸(时间见表 1)，共38个循环；72 ℃延伸8 min；4 ℃保存。利用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并送上海生工生物工程有限公司进行克隆、测序。
1.5 水貂TYR基因编码区序列生物信息学分析测序数据经NCBI在线BLAST比对，以确定是否为目标序列；参照GenBank数据库中雪貂TYR基因信息确定水貂该基因序列结构；参考莫家远等[14]、杜鹏飞等[15]、周志楠等[16]和王斌等[17]的方法，通过BioEdit 7.2软件统计TYR基因编码序列核苷酸含量；利用SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/)和TMHMM Server 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测水貂TYR蛋白信号肽与跨膜区，采用SMART(http://smart.embl.de/)和Motif Scan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)在线软件分别分析TYR蛋白结构功能域和潜在功能基序。
1.6 水貂TYR基因SNPs筛查SNPs筛查选用的PCR体系及程序同1.4。采用BioEdit 7.2软件ClustalW Multiple alignment程序分析水貂TYR基因外显子1、4和5的序列，筛查SNPs；通过测序峰图软件Chromas 5.0定义SNPs位点的基因型：单峰表示纯合基因型，套峰表示杂合基因型。
1.7 皮肤组织TYR基因mRNA差异表达分析以不同毛色水貂皮肤组织cDNA为模板进行qRT-PCR，根据SYBR® Select Master Mix说明书优化qRT-PCR体系，利用Step One PlusTM系统设置反应程序。反应体系20.0 μL：cDNA 2.0 μL，上、下游引物各1.5 μL，SYBR® Select Master Mix 10.0 μL，灭菌超纯水5.0 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性20 s，退火(温度见表 1)30 s，72 ℃延伸1 min，40个循环；95 ℃ 1 min；退火(温度见表 1)30 s；95 ℃ 30 s。每个样品设置3个重复，β-actin基因为内参，白色被毛个体表达水平标定为1，作为对照组，参考2-ΔΔCt分析方法[18]进行TYR基因相对表达量计算，以“平均数±标准差”表示，采用SAS 9.0进行单因素方差(One-way ANOVA)分析和多重比较(LSD)。
2 结果 2.1 水貂TYR基因克隆及序列分析2.1.1 TYR基因鉴定及分析 由图 1可知，扩增产物大小与设计长度一致，可进行后续克隆。扩增产物经纯化、克隆及酶切鉴定、测序并拼接后获得的序列长度为2 391 bp，以雪貂及其他物种TYR基因结构为参照，水貂TYR基因(登录号：KJ716783)外显子1、2、3、4和5大小分别为：819、217、148、182和230 bp，编码区序列长1 596 bp，编码531个氨基酸。利用BLAST软件进行同源性检索表明，克隆序列与雪貂、海豹、犬及猫同源性分别为98%、94%、93%和92%，说明获得序列为水貂TYR基因序列。碱基序列组成显示，A=24.87%，C=25.75%，G=23.43%，T=25.94%，A+T含量与G+C基本一致，表明水貂TYR基因CDS区DNA双链较稳定。
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M1、M2. DNA相对分子质量标准; 1~2、3~5、6~7、8~9和10~12分别为引物TYR-1、TYR-2、TYR-3、TYR-4和TYR-5扩增产物 M1 and M2. DL 2000 and 1000 DNA marker; 1-2, 3-5, 6-7, 8-9 and 10-12 are the amplified products by primer TYR-1, TYR-2, TYR-3, TYR-4 and TYR-5 图 1 水貂TYR基因扩增结果 Fig. 1 Amplification result of TYR gene in mink |
2.1.2 TYR蛋白信号肽与跨膜结构预测 利用在线软件SignalP-5.0 Server基于深度神经网络(deep neural network)预测分析水貂TYR蛋白信号肽(图 2)表明，该蛋白的氨基末端至第18个氨基酸之间存在一段信号肽，属于一种分泌型蛋白，剪切位点(cleavage site：CS)为18G-19H。采用TMHMM Server 2.0对TYR蛋白进行跨膜结构预测(图 3)显示，水貂TYR蛋白第1~473位氨基酸位于膜外(outside)，497~531位氨基酸位于膜内(inside)，474~496位氨基酸为跨膜蛋白(TMhelix)。
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图 2 水貂TYR蛋白信号肽预测分析 Fig. 2 Prediction analysis of the signal peptide of mink TYR protein |
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横坐标表示氨基酸位点；纵坐标表示跨膜区概率 Abscissa coordinate represents the position of amino acids; Longitudinal coordinate represent the probability of transmembrane domain 图 3 水貂TYR蛋白跨膜结构分析 Fig. 3 Transmembrane domain analysis of mink TYR protein |
2.1.3 TYR蛋白关键功能域及位点 通过Simple modular architecture research tool(SMART)预测蛋白关键功能域(图 4)表明，水貂TYR蛋白包含1个信号肽(signal peptide)，1个EGF结构域(EGF domain)，1个酪氨酸酶家族共有核心结构域(tyrosinase)，1个跨膜结构域(transmembrane region)和1个低复杂度结构域(low complexity region)，分别位于1~18、84~113、171~ 403、474~496和497~506位氨基酸，其中，信号肽和跨膜结构域与2.1.2预测结果相符。利用NCBI蛋白保守结构域在线分析软件发现，克隆的水貂TYR基因也具有酪氨酸酶超家族(tyrosinase superfamily)结构域。基于MyHits在线软件中Motif Scan程序预测关键功能位点表明，水貂TYR蛋白包括41个潜在的功能基序位点，6个N-糖基化位点：86~89(NRTC)、111~114(NCTE)、161~164(NGST)、230~233(NFTI)、337~340(NFSF)和371~374(NGTM)位氨基酸；13个Ⅱ型酪蛋白激酶磷酸化位点(casein kinase Ⅱ phosphorylation site，CK2)：29~32(SLME)、72~75(TGVD)、127~130(SVPE)、145~148(TSPD)、226~229(TGDE)、277~280(TRLE)、314~317(SSAD)、325~328(TQYE)、380~383(SAND)、391~394(TFVD)、395~398(SIFE)、441~444(SSRD)和455~458(SERD)位氨基酸；7个豆蔻酰化位点(N- myristoylation site，MYRISTYL)：43~48 (GSPCGQ)、53~58(GACQNI)、93~98(GNFMGF)、157~162(GQMNNG)、243~248(GCDICT)、353~358(GIADAS)和485~490(GSVLTL)位氨基酸；9个蛋白激酶C磷酸化位点(protein kinase C phosphorylation site，PKC)：12~14(SFR)、26~28(SSK)、38~40(TWR)、50~52(SGR)、113~115(TEK)、309~311(TPR)、339~341(SFR)、441~443(SSR)和455~ 457(SER)位氨基酸；1个微体细胞C端靶向信号：529~531(THL)位氨基酸；1个细胞辅助序列位点：40~42(RGD)位氨基酸；1个表皮生长因子样结构域信号I(EGF-like domain signature I，EGF-I)：89~100位氨基酸(CHCFGNFMGFNC)；1个层粘连蛋白型表皮生长因子样结构域信号(laminin-type EGF-like domain signature，EGF_LAM_1)：89~112位氨基酸(CHCFGNFMGFNCGNCKFGFWGPNC)；1个酪氨酸酶铜-A结合位点信号因子(tyrosinase CuA-binding region signature，TYROSINASE 1)：202~219位氨基酸(HEAPGFLPWHRLFLLLWE)；1个酪氨酸酶铜-B结合位点信号因子(tyrosinase CuB-binding region signature，TYROSINASE 2)：383~394位氨基酸(DPIFLLHHTFVD)；170~403位氨基酸为1个酪氨酸酶家族共有核心结构域(common central domain of tyrosinase)。
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图 4 水貂TYR蛋白关键功能域分析 Fig. 4 Key functional domains analysis of mink TYR protein |
利用BioEdit 7.2软件ClustalW multiple alignment程序将不同毛色水貂TYR基因外显子1、4和5的PCR产物直接测序结果进行比对，筛查SNPs。SNPs命名原则：每个外显子的第1个起始碱基标记为“1”。结果表明，301个样本外显子4和5序列不存在变异位点，外显子1存在2个SNPs位点(图 5)，分别命名为：c.138T>A和c.441G>A，c.138T>A仅存在于名威银蓝水貂和红眼白水貂群体中，形成3种基因型：TT、TA和AA，该位点为无义突变，由TGT编码的半胱氨酸突变为终止密码子TGA。c.441G>A位点仅存在于金州黑水貂群体中，为沉默突变，发生在密码子第3位碱基，CCG和CCA均编码脯氨酸(Pro)。
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A. c.138T>A位点测序峰图：a.纯合子TT基因型；b.杂合子TA基因型；c.纯合子AA基因型。B. c.441G>A位点测序峰图：d.纯合子GG基因型；e.杂合子GA基因型；f.纯合子AA基因型。突变位点用箭头标明 A.DNA sequencing map of c.138T>A site:a. homozygote TT; b. heterozygote TA; c. homozygote AA. B. DNA sequencing map of c.441G>A site:d. homozygote GG; e. heterozygote GA; f. homozygote AA. Arrows indicate muataion sites 图 5 水貂TYR基因外显子1的2个突变位点 Fig. 5 Two mutation sites of the mink TYR gene exon 1 |
由图 6可知，TYR基因mRNA在3种毛色水貂皮肤中均存在表达，其表达量趋势为：金州黑水貂>名威银蓝水貂>红眼白水貂，金州黑水貂、银蓝水貂皮肤TYR基因mRNA相对表达量分别是红眼白水貂的3.25和1.89倍，在金州黑水貂皮肤中的表达量极显著高于名威银蓝水貂和红眼白水貂(P < 0.01)，在银蓝水貂皮肤中的表达量显著高于红眼白水貂(P < 0.05)。
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不同大写字母表示差异极显著(P < 0.01)，不同小写字母表示差异显著(P < 0.05) Different capital letters represent extremely significant difference (P < 0.01), and different lowercase letters represent significant difference (P < 0.05) 图 6 不同毛色水貂皮肤组织TYR基因mRNA相对表达量 Fig. 6 Relative expression of TYR gene mRNA in mink skin with different coat colors |
本研究通过比较基因组学方法，以雪貂和海豹等动物同源基因序列为模板，设计了5对特异性引物进行PCR扩增，成功克隆出水貂TYR基因。随着基因组学和蛋白质组学研究的逐渐深入，特别是当今大数据组学的迅速发展，生物信息学理论及分析方法也得到了进一步的更新[19-21]。通过系统生物信息学分析，本研究获得的水貂TYR基因长2 391 bp，包含5个完整外显子，编码区长1 596 bp，编码531个氨基酸，由信号肽(18个氨基酸)和成熟肽(513个氨基酸)组成。信号肽预测表明，水貂TYR蛋白属分泌型蛋白，可以在细胞外发挥作用。研究表明，人[22]、食蟹猴[23]、犬[24]、山羊[25]和猪[26]等哺乳动物TYR蛋白编码序列N端均含有信号肽，本研究结果与前人研究一致。研究发现，新合成蛋白在其N端信号肽的指引下到达细胞特定区域进行跨膜转运[27]，TYR蛋白形成后只有与细胞膜中特定受体结合才发挥其调控作用，水貂TYR蛋白信号肽的存在可保证其功能正常发挥。信号肽一般存在于氨基酸序列的N端，是引导新生蛋白向分泌通路转移的短肽链，长度为5~30个氨基酸不等[28]。不同物种的TYR蛋白信号肽在进化过程中剪切位点非常保守(18G…H19)，同时，拓扑结构域在线预测软件也预测到水貂TYR蛋白C端存在一段包括23个氨基酸(474~496位)的跨膜结构域。研究表明，脊椎动物山羊[25]、朱鹮[29]和蛙[30]等物种均包括一个跨膜结构片段，暗示酪氨酸酶在色素合成过程中可能具有重要功能。除此之外，EGF结构域、酪氨酸酶家族共有核心结构域、酪氨酸酶铜-A和酪氨酸酶铜-B结合位点信号因子的关键功能结构域的预测结果再次证明了水貂TYR蛋白在调控色素沉积方面的重要作用。对于SNPs筛查结果，本研究发现了1个关键突变位点c.138T>A，具有白色被毛的红眼白水貂在该位点全部为AA型，该无义突变导致TYR基因编码蛋白结构域缺少了EGF domain、酪氨酸酶铜-A和酪氨酸酶铜-B结合位点，最终导致酪氨酸酶家族共有核心结构域缺失，黑色素合成生物学过程中断，产生白色被毛。这一结果与Anistoroaei等[7]对美洲白化水貂和Blaszczyk等[8]对白化雪貂的研究结果一致。其中，丹麦白化水貂个体TYR基因外显子1存在无义突变(138.TGT→TGA)位点，这与本研究中c.138T>A位点完全吻合，宋兴超等[31]也发现，T138A位点的PCR-RFLP多态性与水貂毛色表型显著关联，表明红眼白水貂与白化水貂毛色决定基因均为TYR基因。同时，Ito和Wakamatsu[32]研究也表明，若黑色素细胞中酪氨酸酶含量和活性降低，酪氨酸会经多巴和多巴醌生成半胱酰多巴，褐黑色素浓度增高，动物被毛表现为浅色或白色。上述研究结果提示，TYR基因c.138T>A位点是导致水貂白色被色表型形成的关联SNPs。
3.2 TYR基因皮肤组织mRNA表达量与水貂毛色性状的关联性迄今为止，编码酪氨酸酶蛋白的TYR基因已成为探究动物色素沉积分子机制的核心基因。TYR基因表达量升高会促进黑色素细胞生成并分泌更多的真黑色素，动物的毛色、羽色和肤色也就相应越深，若酪氨酸酶活性或表达量过低将阻断黑色素合成，动物毛色、羽色和肤色将会变浅甚至呈现白化表型[33]。Paterson等[34]研究发现，小鼠黑色素细胞中TYR基因高表达会导致酪氨酸酶活性增强。Zhang等[35]利用qRT-PCR技术研究发现，体色正常的黄颡鱼皮肤组织TYR基因mRNA表达量显著高于白化个体(P < 0.05)，且该基因表达具有时空与组织特异性，表明TYR基因在色素沉积过程中具有重要功能，可在某种程度上决定体色的变异。高莉等[36]研究表明，棕色被毛羊驼皮肤TYR基因mRNA表达量极显著高于白色个体，可进一步导致不同程度的色素沉积及多样化毛色表型的形成。姜俊兵等[37]研究也发现，有色被毛羊驼TYR基因mRNA表达量显著高于白色个体。Xu等[38]利用转录组测序获得了五指山猪黑色与白色皮肤组织比较表达谱，其中，TYR基因mRNA表达水平在两种皮肤中存在显著差异(P < 0.01)。Yao等[39]研究也表明，不同毛色绵羊皮肤TYR基因的相对表达量具有显著差异。本研究结果表明，TYR基因在黑色、灰色和白色被毛水貂皮肤中均存在一定的表达，但其mRNA表达量则呈现一定的差异，该基因在黑色、灰色被毛水貂皮肤中的表达量分别是白色个体的3.25(P < 0.01)和1.89(P < 0.05)倍，该结果与羊驼[10, 36-37]、马[11]、黄颡鱼[35]等脊椎动物获得的相关结果一致，也与本研究筛查到的白色被毛水貂TYR基因外显子1中c.138T>A突变相符合，推测该SNPs的存在导致终止密码子的提前出现，形成一段截短蛋白，终止水貂TYR基因mRNA的合成，最终中断真黑色素合成，从而形成白色被毛表型，有待于进一步通过细胞或动物水平RNA干扰或过表达试验开展具体的分子调控机理研究，或者通过检测水貂不同胚胎时期该基因的表达水平以进一步解析TYR基因的调控功能。前期研究发现，水貂作为一种典型季节性被毛脱换动物，其毛囊在换毛期间会有生长期、退行期与休止期等过程[40]，本研究中，试验样品采集时间在12月初，毛囊稳定在退行期或即将进入静止期，毛色关联基因也可能会存在表达量的差异，因此，有必要检测换毛期TYR基因的差异表达量来进一步完善水貂毛色性状形成的分子调控机制。
4 结论本研究克隆获得了水貂TYR基因完整编码区，序列全长2 391 bp。生物信息学分析表明，水貂TYR蛋白共编码531个氨基酸，关键功能结构域(EGF结构域、酪氨酸酶家族共有核心结构域、酪氨酸酶铜-A和酪氨酸酶铜-B结合位点信号因子)及外显子1中SNPs(c.138T>A)对水貂被毛色素沉积具有重要调控功能；TYR基因皮肤组织mRNA差异表达水平与水貂毛色显著关联。
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