胎儿三毛滴虫(Tritrichomonas foetus，T. foetus)是毛滴虫目毛滴虫属的一种肠道寄生性原虫，主要寄生于牛的生殖系统，可导致子宫积脓和妊娠早期流产，严重影响牛的生育力，在世界范围内对养牛业影响较大^[1-2]。目前，T.foetus导致的疾病已被世界动物卫生组织列为法定报告疾病。T. foetus亦可感染猪，主要寄生于猪的鼻腔、胃、盲肠和母猪生殖道^[3-4]，可引起仔猪下痢，母猪阴道炎，屡配不孕，严重时会导致母猪流产，在国内猪感染三毛滴虫的病例时有发生。近年来，又陆续出现T. foetus感染鼠、犬和猫的报道^[5]，甚至在人类患者的肺部也发现有T. foetus的存在^[6]。这些研究结果表明，T. foetus是一种宿主范围和寄生部位广泛的人畜共患寄生虫。

T. foetus可侵袭猫的回肠、盲肠、结肠，导致肠炎，感染的典型临床症状是慢性或间歇性腹泻，平均持续期长达135 d，其他临床症状还包括厌食、抑郁、体重减轻或不增加、呕吐等^[7]。国外很多国家出现了猫感染T. foetus的研究报道^[8]。意大利、日本、法国、英国的猫体内T. foetus感染率分别为2.0%、8.8%、14.3%、18.8%^[9-12]。但是国内，猫感染T. foetus仅有少数的病例报道^[13]。这种寄生虫长5.7~13.0 μm，宽3.9~5.5 μm，呈梨形、梭形和圆形^[14]。本研究首次从1例长期慢性腹泻患病猫粪便中分离得到了1株毛滴虫，经过形态学和分子生物学鉴定，确定其为猫源T. foetus，为该猫长期腹泻的病原体。

1 材料与方法 1.1 样品来源

虫株分离自河北保定市某宠物医院长期慢性腹泻斯芬克斯猫的粪便。12月龄，临床症状为食欲不振，迅速消瘦，排软便后变为稀便，并伴有呕吐现象，该症状持续一月有余，反复发作。主要细菌和病毒病检测均为阴性。粪便经涂片镜检发现有大量滴虫。

1.2 主要试剂

2×PCR Master Mix、DNA Marker、粪便基因组提取试剂盒均购于天根生化科技北京有限公司，1640培养基、胎牛血清、青链霉素混合液均购于北京索莱宝科技有限公司。伊红染液、瑞氏-吉姆萨染液、孔雀绿染液为实验室保存。

1.3 虫体的体外培养

粪便经稀释过滤后，离心收集沉淀，转至1640培养基中，放入37 ℃培养箱连续培养，第一次间隔60 h传代，以后每隔18 h传代，直至虫体生长趋于稳定。

1.4 形态结构观察

采用直接涂片法和染色法于显微镜下观察虫体的基本形态特征。

1.5 PCR扩增与序列分析

根据T. foetus 18S rRNA基因设计引物，序列为TFR1 (5′-TGCTTCAGTTCAGCGGGTCTTCC-3′)和TFR2 (5′-CGGTAGGTGAACCTGCCGTTGG-3′)。用试剂盒方法提取虫体DNA后，进行PCR。阳性对照为实验室保存的牛T. foetus基因组。扩增体系为2×PCR MasterMix 10 μL；上、下游引物各1 μL；DNA模板1 μL；加ddH₂O补至20 μL。反应条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，67 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共40个循环；72 ℃延伸15 min。

上述PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，回收阳性PCR产物测序。测序结果提交至GenBank，在NCBI上进行BLAST比对分析，从NCBI下载相关参考序列(具体见结果部分)，采用软件MEGA7.0中邻接法(N-J)构建系统发育进化树。

2 结果 2.1 虫体的形态结构观察

采用直接涂片法可以在低倍镜下观察到大量快速游动的虫体，高倍镜下可见虫体呈半透明卵圆形，有时可见鞭毛，随体外培养时间延长，鞭毛消失，虫体接近圆形(图 1A)。

伊红染色后，虫体结构模糊，鞭毛不着色，无法看清其形态特征(图 1B)。碘液染色后的毛滴虫可清晰呈现3根等长的前鞭毛和1根后鞭毛，有时可见波动膜(图 1C)。

2.2 PCR扩增及序列分析结果

经PCR检测，阳性产物在339 bp处有明显目的条带，如图 2。将测序序列提交至GenBank(登录号为MT392685)。系统发育进化树显示，本研究中分离的猫源毛滴虫序列与胎儿三毛滴虫MH400076.1处于同一分支，且相似性达到了99%(图 3)，确定该虫株为T. foetus。

3 讨论

本研究从猫体内分离出的毛滴虫，具有胎儿三毛滴虫特征，3根前鞭毛和1根后鞭毛，与文献报道相符^[15]。试验中，笔者分别采用了不同染色液对其进行了染色，伊红染色后的毛滴虫鞭毛不明显，整体形态模糊；孔雀绿染色后的毛滴虫形态接近透明，且鞭毛不着色，很难分辨；改良后的鞭毛染色液，虽能染出形态较好的毛滴虫，但是需要现用现配，染色时间较长，不利于临床检验。碘液染色法可清晰完整地显示虫体形态结构，用于临床快速检验，但需要专业人士对其种类进行鉴别。笔者将粪便染色涂片法与PCR分子鉴定相结合，通过对其18S rRNA基因进行序列分析，对毛滴虫进行种属鉴别，结果确定其腹泻病原体为猫源T. foetus。

猫与人生活密切，当饮水、饮食及粪便处理不当，会造成T. foetus的传播。T. foetus生活史简单，只有一种滋养体形态，当其进入到肠道以纵二分裂式增殖，由于其临床症状为慢性腹泻或无症状^{[7, 16-18]}，很难看到明显的发病症状而及时治疗，给T. foetus的繁殖及传播提供了充分的条件。迄今为止，对这种存在较大人兽共患潜力的病原体^[19]如何引起腹泻仍然知之甚少，在没有表现出临床症状的猫中，T. foetus感染有多常见?这些无症状猫将T. foetus传染给其他猫和人或其他动物的风险有多大?对其他动物是否有致病性？这些问题还有待进一步研究证实。

4 结论

从1例长期慢性腹泻猫粪便中分离到的1株毛滴虫，通过形态学观察及18S rRNA基因序列相似性分析鉴定为猫源T. foetus，为其腹泻病原体。