流行性乙型脑炎由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染引起^[1]，是人畜共患传染病，会导致严重的神经系统炎症^[2]，危害动物及人类的健康。包膜蛋白E是JEV基因组最主要的结构蛋白^[3]，能够与机体针对JEV感染产生的中和抗体特异性结合^[4]。目前，未见JEV与原代神经元细胞在miRNA调控水平的报道，本研究以miRNA为切入点，探究JEV和宿主细胞中基因的相互作用关系，推动新型JEV防治措施的研究。

1 材料与方法 1.1 试验材料

实验动物为BALB/c小鼠，JEV毒株为NJ2008强毒株，由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室提供。JEV-E基因实时定量PCR试剂盒、miRNA实时定量PCR试剂盒购自大连宝生物工程公司；引物和miRNA模拟物及对照由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 JEV感染小鼠原代神经元细胞及高通量测序

取出生24 h内的BALB/c乳小鼠脑神经元细胞体外培养，以MOI为0.1感染JEV，收集感染48 h的神经元细胞，用TRIzol提取总RNA并分离提纯，构建染毒组与对照组sRNA文库。以|Fold Change|>1和FDR < 0.05为标准，用EB-Seq筛选出在染毒组和对照组差异表达的miRNA，并进行实时定量PCR验证。

1.3 qRT-PCR验证miRNA差异表达

试验按miRNA实时定量PCR试剂盒说明书进行，所需引物见表 1。构建50 μL DNase I反应体系：8 μL RNA；5 μL 10×DNase I Buffer；0.5 μL DNase I (5 U·μL^-1)；35 μL RNase Free ddH₂O。混匀后, 37 ℃水浴30 min；加入1 μL 0.5 mol·L^-1 EDTA后, 80 ℃水浴2 min。构建10 μL反转录反应体系：5 μL 2×mRQ Buffer；3.75 μL RNA；1.25 μL mRQ Enzyme。混匀后, 37 ℃水浴60 min；85 ℃水浴5 min。构建25 μL qPCR反应体系：12.5 μL 2×SYBR Advantage；0.5 μL 50×ROX Dye；0.5 μL miRNA forward primers；0.5 μL Uni-Reverse Primer；2 μL cDNA；9 μL RNase Free ddH₂O。

设置PCR反应条件：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s, 60 ℃ 22 s，循环40次；95 ℃ 60 s, 55 ℃ 30 s, 95 ℃ 30 s，循环1次。2^-ΔΔCt法分析miRNA的相对表达水平。

1.4 miRNA模拟物转染小鼠原代神经元细胞

选差异表达的26个miRNA转染目的miRNA模拟物。分离处理原代神经元细胞，计数细胞控制终浓度为(4~5)×10⁶·(100 μL)^-1；取两支1.5 mL无RNA酶的Ep管，分别加入1 μL miRNA模拟物和1 μL Trans-EZ，用Opti-MEM培养基补齐30 μL。将Trans-EZ稀释液滴加到miRNA模拟物中，静置20 min，使其充分结合形成转染复合体；加入转染杯中放入转染仪，选择原代神经元转染程序，将得到的转染复合体加入细胞板中培养。

收集JEV感染的原代神经元细胞、miRNA模拟物转染组及其对照组，提取RNA，以β-actin为内参，qRT-PCR检测神经元细胞中JEV-E基因水平。

2 结果 2.1 高通量测序

染毒组和对照组中高质量的sRNA序列达到了97.94%和98.15%，长度分布的峰值在20~24 nt，染毒组与对照组各有532 732与563 707种sRNA序列，共有的为188 802种，数量分布有较高一致性，sRNA的文库构建符合要求。筛选得到26个差异表达的miRNA，其中，18条相对表达上调，8条下调。

2.2 qRT-PCR验证miRNA差异表达

选择26个差异表达的miRNA的平行样品进行qRT-PCR，结果显示, 这26个表达差异显著的miRNA表达谱变化与高通量测序结果相符(图 1)。

2.3 JEV感染神经元细胞中JEV-E基因的qRT-PCR检测

26种miRNA模拟物转染小鼠原代神经元细胞后，对应miRNA的表达均有提高。对比图 2结果：mmu-miR-21a-3p、mmu-miR-223-5p、mmu-miR-147-3p、mmu-miR-155-5p和mmu- miR-146a-5p表达量增加导致JEV-E基因水平上调，mmu-miR-301a的表达量增加导致JEV-E基因水平显著下调，其余miRNA过表达未引起JEV-E基因水平明显变化。各miRNA的模拟物转染对照组JEV-E基因水平相较未转染组未出现明显差异。

3 讨论

JEV的感染引起宿主细胞内环境变化，利于JEV复制增殖。miRNAs参与细胞进程及宿主免疫和病毒感染等^[5]。Sharma等^[6]发现JEV感染导致mmu-miR-146a-5p表达上调，抑制NF-κB活性并阻断抗病毒通路。Deng等^[7]证实JEV感染促进C8-B4细胞中miR-146a-5p表达，并产生IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-β和IFN-α促炎因子。本研究中，感染JEV后神经元细胞mmu-miR-146a-5p表达上调1.95倍，JEV可能影响宿主细胞炎症因子的释放, 从而逃避宿主免疫反应。Ma等^[8]证实miR-21a-3p在小鼠心肌梗死后的细胞凋亡模型中表达明显下调。本研究中，感染JEV后神经元细胞mmu-miR-21a-3p的表达相对升高94倍，但mmu-miR-21a-3p过表达3倍后, 细胞中JEV-E基因水平仅升高2.65倍。可能是JEV感染神经元细胞后上调mmu-miR-21a-3p的表达抑制细胞凋亡通路，保证自身复制增殖。本研究探索JEV感染小鼠原代脑神经元细胞的miRNA差异表达谱，为进一步从miRNA水平研究JEV致神经功能异常机制提供可能的方向。

4 结论

乙型脑炎病毒感染小鼠原代神经元细胞，筛选出26个差异表达显著的miRNA，其中, 18个表达上调，8个表达下调。神经元细胞中miRNA的表达影响JEV的复制。