畜牧兽医学报  2020, Vol. 51 Issue (9): 2302-2311. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2020.09.028    PDF    
引用本文
朱燕丽, 李博, 张雨, 孙璐, 黄恩霞, 莫重辉, 赵宝玉, 路浩. 翠雀内生真菌分离鉴定及分布特性研究[J]. 畜牧兽医学报, 2020, 51(9): 2302-2311.  
ZHU Yanli, LI Bo, ZHANG Yu, SUN Lu, HUANG Enxia, MO Chonghui, ZHAO Baoyu, LU Hao. Isolation, Identification and Distribution Characteristics of Fungal Endophyte in Delphinium grandiflorum L.[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2020, 51(9): 2302-2311.  
翠雀内生真菌分离鉴定及分布特性研究
朱燕丽1, 李博1, 张雨1, 孙璐1, 黄恩霞1, 莫重辉2, 赵宝玉1, 路浩1     
1. 西北农林科技大学动物医学院, 杨凌 712100;
2. 青海大学农牧学院, 西宁 810016
收稿日期：2020-03-02
基金项目：陕西省自然科学基金重点项目（2017JZ004）；青海省科技援青专项（2020-QY-210）
作者简介：朱燕丽(1998-), 女, 陕西宝鸡人, 主要从事植物内生真菌研究, E-mail:zyl18220721309@163.com.
通信作者：路浩, 主要从事有毒植物中毒病致病机理与防控研究, E-mail:luhao@nwsuaf.edu.cn.
摘要：旨在探明有毒植物翠雀的内生真菌种类，作者采用表面消毒法分离，运用形态学鉴定，采用ITS序列构建系统进化树，确定了其内生真菌的种类。结果显示，从翠雀植物中分离得到22种内生真菌，将其根据亲缘关系进行系统进化分析，主要分为Ⅰ和Ⅱ两大种群，分属于6纲、6目、6科、7属，其中，链格孢属真菌（Alternaria sp.）为优势菌（占分离菌株数的31.82%，主要分布于花和叶中），内生真菌在花中分布最普遍（占分离菌株数的40.91%），其次，为叶（31.82%）、根（22.73%）和茎（4.55%）。结果表明，翠雀内生真菌在不同组织中的分布普遍性不同。
关键词：翠雀    内生真菌    分离鉴定    分布特性    链格孢菌属    
Isolation, Identification and Distribution Characteristics of Fungal Endophyte in Delphinium grandiflorum L.
ZHU Yanli1, LI Bo1, ZHANG Yu1, SUN Lu1, HUANG Enxia1, MO Chonghui2, ZHAO Baoyu1, LU Hao1     
1. College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;
2. College of Agriculture and Animal Husbandry, Qinghai University, Xining 810016, China
Corresponding author: LU Hao, E-mail:luhao@nwsuaf.edu.cn.
Abstract: In order to explore the species of endophytic fungi from a poisonous plant, Delphinium grandiflorum L. In this experiment, surface disinfection was used for separation, morphological identification was used, and phylogenetic tree was constructed using ITS sequence to determine the species of endophytic fungi. The results showed that 22 species of endophytic fungi were isolated from D.grandiflorum L., they were mainly divided into two groups according to their phylogenetic relationship, belonging to 6 classes, 6 orders, 6 families, and 7 genera. Among them, Alternaria sp. was the dominant species (accounting for 31.82% of the isolated strains, mainly distributed in flowers and leaves), endophytic fungi are most commonly distributed in flowers (accounting for 40.91% of the isolates), followed by leaves (31.82%), roots (22.73%) and stems (4.55%). The results indicated that the distribution of endophytic fungi in D.grandiflorum L. is different in different tissues.
Key words: Delphinium grandiflorum L.    endophytic fungus    isolation and identification    distribution characteristics    Alternaria sp.    

翠雀属(Delphinium)植物属毛茛科(Ranunculaceae)一年生或多年生草本植物，花色多为蓝色[1]。其多分布于北温带地区，全世界约有300多种。我国翠雀属植物种类丰富，约有113种，除台湾省和海南岛以外广泛分布于其他各省区，并以西北高原地区分布的种类最为丰富[2]。翠雀属植物全草有毒，其中，代表性种类有翠雀(D. grandiflorum L.)、裂瓣翠雀[D. grandiflorum var. mosoynense(Fr.)Huth]、飞燕草(D. Consolida ajacis L.Schur)、短距翠雀花(D. forrestii Diels)等[3]。翠雀作为优势种主要分布于我国黑龙江、河北、甘肃、四川、云南及西藏等地，适宜在海拔500~2 800 m的丘陵沙地和山坡草地的环境中生长，生长过程有花期和果期，全株有柔毛被覆，茎分枝，叶互生，花瓣状，呈蓝色或蓝紫色[4]。翠雀的主要毒性成分为二萜类生物碱，动物采食过量可引起以呼吸困难、流涎、全身痉挛、肌肉无力和剧烈腹痛为特征的中毒表现[5-6]。此外，该类化合物还具有抗菌消炎、抗肿瘤、镇痛麻醉等药理作用[7-9]。但在民间和人医临床上，翠雀常以花或根入药，治疗肠炎、腹泻、风湿、跌打损伤等病症[10]。

内生真菌(endophyte)是生活在地上部分活的植物组织内并不引起明显病害症状的一类真菌[11]。内生真菌在植物生长发育过程中发挥重要作用，不仅能够提高植物抗虫害和抗旱能力，而且其产生的次生代谢产物有助于保护植物免受食草动物采食。例如，疯草作为我国西部草原的主要有毒植物，其主要毒素——苦马豆素(swainsonine)即是由疯草内生真菌——棘豆链格孢菌(Alternaria oxytropis)产生[12-14]，苦马豆素能引起采食动物发生以神经系统紊乱为特征的中毒表现[15-17]，但同时，它又具有很好的抗癌抗肿瘤和免疫增强作用[18]。刘志明等[19-20]从南方红豆杉中分离得到多株产紫杉醇内生真菌，有研究发现[21-22]，分离自喜树的部分内生真菌能产喜树碱，而紫杉醇和喜树碱均是天然的抗癌抗肿瘤药物，东建丽[23]从翠雀中分离得到8株内生真菌，但只对其中1株菌株(CQ-17)进行了鉴定(镰刀菌属)，并对其次生代谢产物进行初步分析，筛选出1种具有抗癌活性的化合物(alternariol 4-methyl ether)。由此可见，植物内生真菌及其次生代谢产物具有重要药用价值和开发应用潜力。

目前国内外有关翠雀内生真菌的研究报道较少，特别是其种类及种群分布特点尚不清楚。鉴于此，本试验以采自青海省湟源县的翠雀为研究对象，采用表面消毒法分离翠雀内生真菌，运用形态学观察和ITS序列分析技术进行翠雀内生真菌种属鉴定，并对其进行系统进化分析。本研究可进一步丰富翠雀属有毒植物内生真菌种类及种群多样性，也为翠雀内生真菌次生代谢产物的毒理学和药理学研究奠定理论基础。

1 材料与方法 1.1 植物材料采集和处理

本试验所用翠雀植物于2019年8月采自青海省湟源县日月乡本炕村(东经101°11′12″，北纬36°26′15″，海拔3 340 m)；除去植物表面杂物，将其干燥处理后带回实验室。所采集样品包含根、茎、叶和花。

1.2 主要设备和试剂

高压蒸汽灭菌锅(上海博讯)、超净工作台(苏州净化)、霉菌培养箱(中仪国科)、冷冻离心机(德国Sigma)、PCR扩增仪(美国Biorad)、冰箱(TCL)、光学显微镜(厦门麦克奥迪)、水浴锅(天津市泰斯特)、无菌去离子水、无水乙醇、75%乙醇、2%NaClO、2% CTAB缓冲液、植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化)、巯基乙醇、三氯甲烷、苯酚、真菌通用引物ITS1和ITS4、2×Es Taq Msater Mix、中性树胶、马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL等。

1.3 翠雀内生真菌的分离

1.3.1 翠雀样品的表面消毒 　　将干燥处理后的翠雀样品用无菌去离子水漂洗干净，除去表面的污物，再使用无菌剪刀将样品的根、茎、叶和花分别剪为长约3 cm的小段，置于无菌培养皿中用无菌去离子水浸泡2~3 h，然后，在超净工作台中按照以下步骤进行表面消毒：75%乙醇溶液消毒30 s，无菌去离子水漂洗1 min，2%NaClO溶液消毒2 min，无菌去离子水漂洗1 min，重复4次。由于NaClO的消毒作用比较强，需根据不同组织的耐受能力筛选消毒时间，即将最后1次漂洗后的无菌水涂抹于PDA培养基上，作对照处理，培养3~4 d后，观察培养基表面是否有微生物生长，以此确定表面消毒的彻底性。最终筛选出根的消毒时间为2.5、2.0 min，茎和叶为2.0、1.5和1.0 min，花为1.5、1.0 min和50、40 s。

1.3.2 翠雀内生真菌的分离 　　用高压灭菌过的无菌滤纸包裹漂洗后的植物组织小块，吸干其表面的水分，用无菌剪刀和镊子将直接与消毒液接触的两断端剪去，然后，将根、茎剪成2 mm左右的小块，叶、花剪成2 mm×2 mm左右的小块，新鲜创面插入PDA培养基。为防止不同组织真菌的交叉污染，应在分剪不同组织时用酒精棉球对剪刀镊子进行消毒并迅速过火干燥。接种好的平板培养基贴上封口膜，置于22 ℃霉菌培养箱中培养，每天定时观察真菌生长状况，挑取的形态特征不同的菌落的菌丝接种于新的PDA培养基上，仔细观察，重复分离培养，直至将分离出的真菌纯化为单一菌落。

1.4 翠雀内生真菌的形态学鉴定

每天固定时间观察单一菌落的生长状况，主要包括菌落大小、颜色、形态，并记录其生长速度。接种单个菌落的菌丝于PDA平板培养基上，待其菌落半径达2 cm左右进行菌丝插片，制作菌丝玻片，于光学显微镜下观察菌丝形态、有无横隔、孢子结构等，做好记录。将菌落菌丝形态与《真菌鉴定手册》等书籍中真菌形态进行对照，初步确定分离到的内生真菌种属。

1.5 翠雀内生真菌的ITS序列测定

1.5.1 翠雀内生真菌DNA的提取 　　采用植物基因组DNA提取试剂盒操作步骤提取分离到的内生真菌DNA[24-25]。

1.5.2 5.8S rDNA-ITS片段扩增 　　利用PCR扩增技术对提取的真菌DNA保守序列进行复制扩增，采用20 μL的反应体系：真菌通用引物ITS1和ITS2各4 μL，模板2 μL，2×Es Taq Master Mix 10 μL；PCR反应条件：94 ℃预变性1.5 min；94 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，循环33次；72 ℃终延伸5 min；4 ℃保温15 min。

1.5.3 核酸序列的测定和结果比对 　　将PCR产物送杨凌奥科公司测序，测序结果与NCBI的DNA数据库进行比对，结合形态学观察进行内生真菌的种属鉴定。

1.6 翠雀内生真菌的系统进化分析

将菌株鉴定结果导入MEGA软件中，采用邻接法(neighbor-joining, NJ)，以1 000次的自展开次数构建系统发育树，对结果进行系统分析，确定各菌株亲缘关系。

1.7 数据统计与处理

在试验过程中, 记录接种的组织块数以及分离到的菌落总数，对鉴定结果进行统计处理，确定分离出最多的菌属和各组织分布最广的菌株，计算分离率(IR)和相对分离率(RF)。

分离率(IR)=分离到的总菌落数/插入培养基的组织块数×100%。

相对分离率(RF)=分离到的某一种菌的株数/分离到所有菌的总株数×100%。

2 结果 2.1 翠雀内生真菌分离结果

针对翠雀植物各组织部位对NaClO消毒液的敏感度和各种内生真菌对消毒液的耐受力不同，在进行表面消毒时按梯度设置了多个消毒时间。从表 1可以看出，翠雀植物不同组织部位适宜的消毒时间跨度较大，根的最佳消毒时间为2.5 min，茎的最佳消毒时间为2.0 min，叶的最佳消毒时间为2.0 min，花的最佳消毒时间为1.0 min。并且花的分离率最高(为86.25%)，根、叶次之，茎最少(表 1)。

表 1 各组织内生真菌分离结果 Table 1 Endophytic fungi isolated from each tissue
2.2 翠雀内生真菌的形态特征

通过对翠雀不同组织内生真菌进行分离和纯化，最终获得24株内生真菌，并对这些内生真菌的菌落菌丝形态特征进行了详细记录(表 2)，部分优势菌的菌落照片如图 1所示。

表 2 翠雀内生真菌菌落菌丝形态特征 Table 2 Morphological characteristics of colonies and hyphae of endophytic fungi from Delphinium grandiflorum L.
a.G3的菌落形态；b.Y7的菌落形态；c.H3的菌落形态；d.H9的菌落形态 a.The colony of G3;b.The colony of Y7;c.The colony of H3;d.The colony of H9 图 1 翠雀内生真菌菌落形态 Fig. 1 Morphology of colonies of endophytic fungi from Delphinium grandiflorum L.
2.3 翠雀内生真菌种属鉴定

将分离到的菌株测序结果与NCBI的DNA数据库比对，并结合《真菌鉴定手册》的相关内容得到如表 3所示的鉴定结果。共得到22种菌株，分属于6纲、6目、6科、7属，其中有6株未定属。

表 3 翠雀内生真菌鉴定结果 Table 3 The identification results of endophytic fungi from Delphinium grandiflorum L.
2.4 翠雀不同组织内生真菌相对分离率

对翠雀内生真菌鉴定结果进行统计处理，计算不同组织以及不同种属的相对分离率(RF)，得到如表 4所示结果，从不同组织的相对分离率分析可知，花的相对分离率最高，为40.91%；叶次之，为31.82%；茎最少，为4.55%，可见花和叶为翠雀内生真菌富集的组织，虽然根的相对分离率较低，但属的种类数较高，即从根中分离到的5种菌分属于4属4科4目4纲，还有1种未定属，所以根为其内生真菌分布多样性最高的组织。从不同种属的相对分离率分析可知，链格孢菌属(Alternaria sp.)的相对分离率最高，为31.82%，成为翠雀内生真菌的优势菌属(图 2)，链格孢菌属(Alternaria sp.)、多尾孢菌属(Podospora sp.)和光黑壳菌属(Preussia sp.)在花和叶中都有分布，花中较多，但没有广泛分布于根、茎、叶、花的属。

表 4 翠雀内生真菌相对分离频率(RF) Table 4 The relative frequency (RF) of endophytic fungi from Delphinium grandiflorum L.
图 2 基于5.8S rDNA-ITS序列由邻近法构建的系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic tree constructed with the program neighbor-joining based on 5.8S rDNA-ITS sequences
2.5 翠雀内生真菌系统进化分析

将翠雀内生真菌的5.8S rDNA-ITS序列在MEGA软件中进行系统进化分析，得到如图 2所示的结果，可以看出，除去族外菌株Uncultured fungus(ZXZ7-9)和Fungal sp.(J), 其余菌株可依据亲缘关系的远近分为种群Ⅰ和Ⅱ，自检支持率分别为94%和92%；种群Ⅰ中多尾孢菌属(Podospora sp.)与木霉属(Trichoderma sp.)的亲缘关系较近，种群Ⅱ中除了链格孢菌属(Alternaria sp.)的菌株自成亲缘关系很近的一群外，多孢菌属(Pleosporales sp.)、蛇孢腔菌属(Ophiobolus sp.)、异茎点霉属(Paraphom sp.)具有较近的亲缘关系。

3 讨论

本研究采用表面消毒法和PDA培养基对翠雀内生真菌进行了分离培养，其中，合适的表面消毒时间对于植物内生真菌分离至关重要。消毒时间过长，消毒液通过渗透作用进入植物组织内杀死部分内生真菌；消毒时间过短，表面消毒不彻底，既导致植物表面的细菌污染，又有可能分离到植物表面的真菌[26-27]。从本试验结果可以看出，随着2% NaClO对不同组织消毒时间逐渐缩短，除茎外，各组织中分离到的内生真菌数呈现先增加后减少，因此，以内生真菌最大分离率所对应的消毒时间作为最佳消毒时间。曹丹丹等[28]在变异黄芪内生真菌分离鉴定时发现叶、花的最佳消毒时间均为2.5 min，而孙璐等[29]分离毛序棘豆内生真菌时观察到根、叶、花的最佳消毒时间均为2 min，但翠雀不同组织间(特别是根和花)的最佳消毒时间差异明显，这可能与翠雀根粗短和花薄小的组织特点有关。

从翠雀不同组织的分离率和相对分离率结果可以看出，在植物的地上部分，花和叶是内生真菌最易浸染的组织部位，其相对分离率均较高，分别为40.91%和31.82%，这可能与花、叶平面扁薄的结构以及相对较大的表面积有关。地下部分即根的相对分离率为22.73%，虽然相比于花和叶较低，但其内生真菌的多样性很高，分离到的5种真菌，除了1种未定属外，其余4种分属于4纲4目4科4属，这与根处于含有丰富真菌的地下环境有密切关系。而翠雀主要的药用组织部位是花和根[30]，其中，所含的药用活性成分很可能与分布的内生真菌有关，也就是翠雀中内生真菌最高相对分离率的花和内生真菌最高多样性的根作为药用可能是其中分布的内生真菌产生的次生代谢产物作用的结果，这也为后续翠雀花和根内生真菌的次生代谢产物的研究提供了思路。

本试验中通过形态学和ITS序列分析方法对分离到的24株内生真菌菌株进行鉴定，共得到7个不同属、22个不同种的真菌，其中，6株未定属，相对分离率最高(31.82%)的链格孢菌属(Alternaria sp.)是其优势菌属，主要分布于花中。此外，链格孢菌属(Alternaria sp.)、多尾孢菌属(Podospora sp.)和光黑壳菌属(Preussia sp.)在花和叶中均有分布，花中较多，但没有广泛分布于根、叶、花的属。目前，国内外对翠雀内生真菌的报道较少，东建丽[23]从翠雀中分离到8株菌株，但只对其中1株进行了鉴定，为镰刀菌属(Fusarium sp.)，本试验从翠雀中未分离到镰刀菌属真菌，这可能与材料的采集地和植物种类不同有关，即使是同一种植物的内生真菌分布特性也会因其所生长地区自然环境的不同而有差异[31-33]。而同科的乌头属植物研究较多，李治滢等[34]从乌头中分离得到木霉属(Trichoderma sp.)、球壳孢属( Sphaeropsis sp.)、链格孢菌属(Alternaria sp.)等23个属的内生真菌，其中以毛霉属(Mucor sp.)、黑孢属(Nigrosporas sp.)、头孢霉属(Cephalosporium sp.)、芽枝霉属(Cladosporium sp.)和链格孢菌属(Alternaria sp.)为优势菌属，本试验从翠雀中也分离到了木霉属(Trichoderma sp.)和链格孢菌属(Alternaria sp.)内生真菌，可见同科不同属植物间内生真菌种类虽差异较大，但也有一定相似性。链格孢菌属(Alternaria sp.)是翠雀的优势菌属，而该菌在其他有毒植物中的分布十分广泛，如变异黄芪[28]、毛序棘豆[29]、小花棘豆[35]、茎直黄芪[36]、苦马豆[37]、瑞香狼毒[38]等，这是由于链格孢菌属(Alternaria sp.)菌株种类较多，且极易变异，易侵染各种植物[39]。此外，Meena等[40]研究发现链格孢菌属的致病菌株产生次生代谢产物可通过不同途径对宿主植物产生毒性作用，由此可见，翠雀的毒性可能与其内生优势菌属链格孢菌属的次生代谢产物密切相关，但这需要后续对翠雀内生真菌(特别是优势菌属)次生代谢产物种类及主要化合物(如二萜类生物碱)生物学活性进行深入研究，以期为翠雀属有毒植物中毒病防控和资源化利用奠定基础。

4 结论

通过对翠雀内生真菌的分离与鉴定，共获得22种菌株，分属于6纲、6目、6科、7属，其中，6株未定属；在翠雀各组织中，花的内生真菌分离率最高，而根的内生真菌多样性最高；链格孢菌属是翠雀内生真菌的优势菌属。

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