畜牧兽医学报  2020, Vol. 51 Issue (9): 2275-2283. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2020.09.025    PDF    
引用本文
邵琪, 屈阳, 朱子晨, 孟春春, 仇旭升, 廖瑛, 谭磊, 宋翠萍, 刘炜玮, 孙英杰, 丁铲. 应用G3BP1稳转细胞系监测应激状态下的应激颗粒形成[J]. 畜牧兽医学报, 2020, 51(9): 2275-2283.  
SHAO Qi, QU Yang, ZHU Zichen, MENG Chunchun, QIU Xusheng, LIAO Ying, TAN Lei, SONG Cuiping, LIU Weiwei, SUN Yingjie, DING Chan. Monitoring of Stress Granule Formation under Stress by G3BP1 Stable Expressing Cell Line[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2020, 51(9): 2275-2283.  
应用G3BP1稳转细胞系监测应激状态下的应激颗粒形成
邵琪1, 屈阳2, 朱子晨3, 孟春春1, 仇旭升1, 廖瑛1, 谭磊1, 宋翠萍1, 刘炜玮1, 孙英杰1, 丁铲1     
1. 中国农业科学院上海兽医研究所, 上海 200241;
2. 西北农林科技大学动物医学院, 杨凌 712100;
3. 山东农业大学动物科技学院, 泰安 271018
收稿日期：2020-03-02
基金项目：国家自然科学基金面上项目（31872453）；国家重点研发计划项目（2017YFD0500800；2018YFD0500100）
作者简介：邵琪(1996-), 女, 江西九江人, 硕士生, 主要从事动物病毒分子生物学研究, E-mail:2052394856@qq.com.
通信作者：孙英杰, 主要从事抗病毒先天性免疫及应激反应研究, E-mail:sunyingjie@shvri.ac.cn; 丁铲, 主要从事家禽病毒性传染病基础研究与防控技术研究, E-mail:shoveldeen@shvri.ac.cn.
摘要：哺乳动物细胞受到应激刺激后，会在细胞中形成致密的颗粒状结构，该结构被称为应激颗粒（stress granules，SG），其中G3BP1是应激颗粒重要的组成成分和标志蛋白。为了动态监测SG的形成情况，构建稳定表达GFP-G3BP1蛋白的HeLa细胞系。首先，扩增G3BP1基因，并将其克隆到慢病毒载体中，从而获得重组质粒Lenti-GFP-G3BP1，利用三质粒慢病毒包装系统包装为表达GFP-G3BP1蛋白的慢病毒颗粒，并感染HeLa细胞，通过嘌呤霉素初步筛选阳性细胞，随后，采用有限稀释法筛选出稳定表达GFP-G3BP1蛋白的HeLa单克隆细胞系，并采用Western blot和直接免疫荧光方法检测细胞系中GFP-G3BP1蛋白的表达及功能。结果发现，在荧光显微镜下可以观察到明显的G3BP1细胞质特异性荧光，Western blot结果显示GFP-G3BP1特异性条带，说明稳定表达GFP-G3BP1的HeLa细胞系构建成功。最后，作者利用亚砷酸钠/热休克/新城疫病毒处理细胞系后对GFP-G3BP1表达形态进行动态监测，证实了细胞受到刺激后，SG逐渐积累的过程。该细胞和相关动态监测方法为后续SG和新城疫病毒的相关研究奠定了基础。
关键词：G3BP1    应激颗粒    新城疫病毒    病毒感染    
Monitoring of Stress Granule Formation under Stress by G3BP1 Stable Expressing Cell Line
SHAO Qi1, QU Yang2, ZHU Zichen3, MENG Chunchun1, QIU Xusheng1, LIAO Ying1, TAN Lei1, SONG Cuiping1, LIU Weiwei1, SUN Yingjie1, DING Chan1     
1. Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 200241, China;
2. College of Veterinary Medicine, Northwest A & F University, Yangling 712100, China;
3. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Tai'an 271018, China
Corresponding author: SUN Yingjie, E-mail:sunyingjie@shvri.ac.cn; DING Chan, E-mail:shoveldeen@shvri.ac.cn.
Abstract: When mammalian cells are stimulated by stress, multiple dense granular structures form in cells. These structures are called stress granules (SGs). G3BP1 is an important component and marker protein of stress granules. To dynamically monitor the formation of SG, the HeLa cell line stably expressing GFP-G3BP1 was constructed. The G3BP1 gene was amplified and cloned into a lentiviral vector to obtain a recombinant plasmid Lenti-GFP-G3BP1. The three-plasmid lentiviral packaging system was used to package the lentiviral particles expressing GFP-G3BP1, which were used to infect HeLa cells. The positive cells were initially selected by puromycin, and further selected by limited dilution to get the monoclonal cells stably expressing GFP-G3BP1. The function and expression of GFP-G3BP1 in the cell line were detected by Western blot and immunofluorescence assays. The obvious cytoplasm-specific fluorescence of G3BP1 was observed. Western blot results show a GFP-G3BP1 specific band, indicating that the HeLa cell line stably expressing GFP-G3BP1 was constructed successfully. Finally, the formation of SG in response to ARS/heatshock/Newcastle disease virus treatment were dynamically monitored. The results showed the gradual accumulation of SGs in response to these treatments. The specific cell line and method we established have laid the foundation for subsequent research on SG and Newcastle disease virus.
Key words: G3BP1    stress granule    Newcastle disease virus    virus infection    

细胞受到病毒感染、砷酸盐刺激、热休克、氧化应激时，细胞中均会形成致密的颗粒状结构，被称为应激颗粒(stress granules，SG)[1]。有研究表明：这些外源刺激抑制细胞蛋白翻译的启动，导致mRNAs从核糖体中释放，这些非翻译mRNAs和RNA结合蛋白聚集形成SG[2-3]。应激状态下，抑制细胞内SG的形成会促进细胞死亡。这表明SG的形成有助于细胞应对外界刺激。SG中有大量翻译起始成分的存在，包括40S核糖体亚基、poly(A)结合蛋白以及翻译起始因子等，但不包含核糖体大亚基，因为翻译终止发生在大亚基进入翻译复合体之前[2, 4]。形成SG的主要标志蛋白：RNA结合蛋白(RBPs)、胞内蛋白TIA-1、TIA-1相关蛋白1(TIAR)和Ras-GTPase活化蛋白SH3结构域结合蛋白(Ras-Gap-SH3 domain-binding protein，G3BP)，这些蛋白主要是通过分子内和分子间的作用聚集形成SG[5-6]。G3BP1特异性分布于细胞质中，与TIA-1/R类似，在细胞应激后招募之SG中，且都是SG形成关键蛋白[7]。TIA-1/R为细胞核定位蛋白，应激之后部分迁移至细胞质中，但大部分仍位于细胞核内。G3BP1未应激状态下弥散分布于细胞质中，细胞受到应激后，G3BP1形成的点状荧光特异性分布于细胞质中[8]。与TIA-1/R相比，G3BP1的荧光更特异，因此，更适合作为SG的标志物。

G3BP1蛋白是高度保守的多结构域蛋白，G3BP可分为G3BP1和G3BP2两个亚型，均含有几个结构域：NTF2样结构域、RNA识别基序(RNA recognition motif，RRM)、酸性区域以及C端的精氨酸富集区(RGG)，其中，C端的RRM和RGG具有DNA/RNA解旋酶活性并参与识别RNA[9]。近年来，有研究表明G3BP1对环鸟苷酸-腺苷酸合酶(cGAS)活化并识别DNA非常重要，它通过促进cGAS复合物的形成来促进cGAS与DNA结合。G3BP1缺失会导致cGAS不能有效结合DNA，从而抑制cGAS介导的IFN的产生[10]。除此之外，G3BP1还是RIG-I信号通路中的重要组分，G3BP1有助于RIG-I诱导抗病毒细胞因子IFN-β产生[11]。这些报道说明G3BP1在抗病毒先天性免疫中发挥重要作用。

SG是宿主应对外界应激的方式，因此，对于多数病毒而言，SG能够抑制病毒复制，而许多病毒通过改变细胞内SG成分或抑制细胞内SG形成来逃逸SG的抗病毒作用[8, 12, 13]。根据病毒与SG互作的机制不同，大致分成3类：1)病毒对PKR-eIF2α通路的调控：汉坦病毒感染抑制依赖于PKR活化的SG形成，这可能是该病毒能够持续感染的关键[14]。2)病毒“挟持”SG核心蛋白：塞姆里斯森林病毒(SFV)感染早期使eIF2α磷酸化，从而诱导SG形成，在感染后期，G3BP1蛋白被SFV的非结构蛋白P3(nsP3)包裹在病毒复制复合物中, SG的形成被抑制[15]；3)病毒切割SG的组分。已有研究证实，脊髓灰质炎病毒能利用自身编码的3C蛋白酶切割SG成核蛋白G3BP1，从而抑制SG的形成[16]。以上这些结果说明，病毒通过多种方式调控SG的形成，逃逸SG介导的抗病毒作用。

不同于其他病毒，新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是少数几个能稳定诱导SG形成，还能在细胞中高效复制的病毒[8]，但其中的机制尚不清楚，为了进一步研究NDV诱导SG形成的机制，本研究应用慢病毒包装系统构建稳定表达GFP-G3BP1的HeLa细胞系，并验证SG刺激物亚砷酸钠(ARS)、热休克处理以及新城疫病毒感染细胞导致GFP-G3BP1形态的变化，以说明细胞形成SG的动态过程，为进一步探索新城疫病毒感染调控SG机制奠定基础。

1 材料与方法 1.1 质粒、菌株、病毒和细胞

质粒psPAX2(#12260)、pMD2.G(#12259)购自Addgene质粒平台，pLenti-CMV-GFP-Puro质粒由上海兽医研究所赵款博士馈赠。NDV Herts/33标准强毒株购自中国兽医药品监察所，由本实验室保存。HeLa细胞购自美国ATCC生物标准品资源中心，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)，于5% CO2、37 ℃条件下培养。DH5α为天根生物科技有限公司产品。

1.2 抗体与试剂

Anti-GFP抗体为美国Abcam公司产品，anti-β-actin抗体为美国Sigma公司产品，anti-TIAR抗体为美国Santa Cruz公司产品。新城疫病毒抗核蛋白(NP)单克隆抗体由本实验室制备。DMEM培养基、Opti-MEM培养基、胎牛血清FBS为美国Thermo公司产品。PEI为美国Polyscience公司产品。嘌呤霉素为美国Merck Millipore公司产品。T4 DNA连接酶，限制性核酸内切酶为美国NEB公司产品。Western细胞裂解液为碧云天生物公司产品。ECL化学发光试剂为Thermo公司产品。

1.3 重组慢病毒质粒的构建

参考GenBank中人G3BP1基因序列(Gene ID：10146)和慢病毒载体pLenti-CMV-GFP-Puro的基因组序列设计特异性引物1对，pLenti-CMV-GFP-Puro-F：5′-TGCTCTAGATATGGTGATGGAGAAGCCT-3′，pLenti-CMV-GFP-Puro-R：5′-TATGCGGCCGCTCACTGCCGTGGCGCAA-3′, 下划线为内切酶识别位点。提取人HeLa细胞的总RNA，以此为模板通过RT-PCR扩增G3BP1序列。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后纯化回收，将慢病毒载体pLenti-CMV-GFP-Puro及回收产物均用XbaⅠ和NotⅠ双酶切，经凝胶电泳鉴定正确后纯化回收，回收产物用T4 DNA连接酶连接。连接产物使用DH5α感受态细胞进行转化，而后涂于氨苄抗性的琼脂平板，挑取7个单个菌落测序，测序正确的菌液扩大培养，提取质粒，并命名为Lenti-GFP-G3BP1。

1.4 慢病毒包装

取状态良好的293T细胞悬液计数，确定细胞数及细胞活力(细胞活力>95%)。取106个细胞接种于10 cm2培皿中培养，待细胞密度达到75%左右时，将质粒Lenti-GFP-G3BP1(22 μg)以及空载体Lenti-GFP(22 μg)分别与psPAX2(10 μg)和pMD2G(12 μg)共转染293T细胞，60 h后观察并收取细胞上清液，1 000 r·min-1离心5 min，0.45 μm过滤器过滤，滤液保存于-80 ℃。

1.5 慢病毒感染和单克隆的制备及生长

取状态良好的对数生长期Hela细胞悬液计数，确定细胞数及细胞活力(细胞活力>95%)。取106个细胞接种于六孔板，细胞密度达到75%时，取“1.4”中60 h慢病毒包装上清感染细胞，孵育1 h后，弃去感染液，PBS清洗3遍后，加入新鲜2% FBS DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱培养。待细胞密度达到90%时，弃去原有细胞上清，PBS清洗3遍后，0.25%胰酶消化，用含嘌呤霉素(1.25 μg·μL-1)的新鲜10% FBS DMEM培养基悬浮细胞，重新接种于六孔板中，每天观察，待阴性对照全部死亡，0.25%胰酶消化阳性细胞，含嘌呤霉素(1.25 μg·μL-1)的新鲜10%FBS DMEM培养基悬浮细胞，重新接种于六孔板中。重复筛选3次。梯度稀释法稀释阳性细胞至96孔板中，培养1周后观察单克隆生长情况，约两周后将单克隆转移至48孔板中扩大培养，长满后转移至六孔板中继续培养。

1.6 Western blot

收集Lenti-GFP和Lenti-GFP-G3BP1单克隆细胞，裂解细胞后进行SDS-PAGE电泳，转印至硝酸纤维素膜，5%脱脂乳封闭，兔源GFP多克隆抗体作为一抗4 ℃过夜孵育，TBST洗涤后，加入HRP标记羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h，ECL化学发光试剂盒显影。β-actin作为内参。

1.7 间接免疫荧光

将5×105个Lenti-GFP和Lenti-GFP-G3BP1单克隆细胞接种于六孔细胞培养板(培养皿中事先放置已灭菌的细胞飞片)，待细胞密度达到60%后，PBS清洗3次，分别以ARS(500 μm)处理30 min，热休克(52 ℃)处理30 min，NDV(1个感染复数，1 MOI)感染18 h，阴性对照以PBS处理30 min。弃去原有培养基，PBS清洗3次，加入4%多聚甲醛固定10 min，0.1% Triton X-100透化10 min，5% BSA室温封闭1 h，TIAR一抗孵育1 h，二抗孵育1 h，DAPI孵育10 min，以上每步均在37 ℃孵育，且孵育间隔用PBS清洗3次。封片剂封片，置于激光共聚焦显微镜避光观察结果。

1.8 活细胞成像技术

将5×105个Lenti-GFP-G3BP1细胞接种于六孔细胞培养板，待细胞密度达到60%后，PBS清洗3次，分别以ARS(500 μm)处理，热休克(52 ℃)处理，NDV(1 MOI)感染。处理后立马将培养板置于Cytation 5细胞成像多功能检测仪(BioTek)中，ARS和热休克处理组，每隔30 s拍摄1张；病毒感染组，每隔1 h拍摄1张。获得图片流以Image J软件分析，获得Stack动态图像，Montage处理后，导出图片。

2 结果 2.1 Lenti-GFP-G3BP1质粒鉴定

为了获得稳定表达GFP-G3BP1的慢病毒质粒，通过XbaⅠ和NotⅠ两个酶切位点，将G3BP1插入pLenti-CMV-GFP-Puro质粒的GFP序列后的多克隆位点，质粒扩增后PCR鉴定，产物大小约1 400 bp左右(图 1)，与预期结果一致，阳性克隆送生工生物测序，测序结果正确(图 2)，测序正确的质粒命名为Lenti-GFP-G3BP1。

M.DL 2 000 DNA相对分子质量标准；1~6.Lenti-GFP-G3BP1 M.DL 2 000 DNA marker; 1-6.Lenti-GFP-G3BP1 图 1 Lenti-GFP-G3BP1质粒PCR鉴定 Fig. 1 PCR identification of the plasmid Lenti-GFP-G3BP1
图 2 Lenti-GFP-G3BP1质粒测序鉴定 Fig. 2 Identification of the plasmid Lenti-GFP-G3BP1 by sequencing
2.2 单克隆细胞系荧光和Western blot鉴定

为了检验筛选出的单克隆细胞系是否特异性表达Lenti-GFP-G3BP1蛋白，以荧光试验和Western blot进行双重验证：G3BP1是1种胞质蛋白，直接免疫荧光试验可以看出Lenti-GFP-G3BP1蛋白特异性表达于细胞质中，而对照组GFP蛋白在细胞中均匀表达，细胞核中表达居多(图 3A)。Western blot结果显示，GFP-G3BP融合蛋白和对照组GFP均符合目的条带大小(图 3B)，证明稳定表达GFP-G3BP1蛋白的HeLa细胞系构建成功。

A.荧光鉴定细胞系GFP-G3BP1蛋白的表达；B. Western blot鉴定细胞系GFP-G3BP1蛋白的表达（一抗：兔源GFP多克隆抗体；二抗：HRP标记羊抗免抗体） A. Identification of GFP-G3BP1 expression by fluorescence assay; B. Identification of GFP-G3BP1 expression by Western blot (the primary antibody: rabbit polyclonal anti-GFP; secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody) 图 3 Lenti-GFP-G3BP1单克隆细胞系荧光和Western blot鉴定 Fig. 3 Identification of Lenti-GFP-G3BP1 cell lines by fluorescence and Western blot assay
2.3 SG特异性荧光验证

为了验证Lenti-GFP-G3BP1细胞系是否能形成SG特异性荧光，笔者用ARS、热休克处理和NDV分别刺激Lenti-GFP-G3BP1和对照Lenti-GFP细胞，以TIAR作为SG指标，观察细胞应激后GFP-G3BP1是否形成SG点状荧光并且与内源性TIAR共定位。结果显示：ARS、热休克处理以及NDV感染后GFP细胞以及GFP-G3BP1细胞中TIAR均呈现点状聚集(图 4A、B)，但仅在Lenti-GFP-G3BP1细胞中观察到外源G3BP1与内源TIAR有明显的共定位现象(图 4B)。通过对10个随机视野中SG阳性细胞(GFP-G3BP1)与所有细胞(DAPI)的计数，结果显示，阳性刺激组(ARS、热休克、NDV感染)中阳性SG细胞比值显著多于对照组(图 4C)；而对照Lenti-GFP细胞中GFP弥散分布在细胞中，与TIAR没有明显的共定位现象(图 4A)，这说明NDV感染后诱导的GFP-G3BP1点状聚集为SG特异性聚集，细胞系功能正常，可用于下一步研究。

A. ARS、热休克处理和病毒感染Lenti-GFP细胞检测SG形成；B. ARS、热休克处理和病毒感染Lenti-GFP-G3BP1细胞检测SG形成；C.每个视野中GFP-G3BP1点状荧光细胞与所有细胞比值 A. Detection of SG formation in Lenti-GFP cells after ARS, heat shock treatment and virus infection; B. Detection of SG formation in Lenti-GFP-G3BP1 cells after ARS, heat shock treatment and virus infection; C. The ratio of GFP-G3BP1 dot fluorescent cells to all cells per high-powered fields (HPF) were quantified 图 4 Lenti-GFP-G3BP1细胞SG特异性验证 Fig. 4 SG specific verification of Lenti-GFP-G3BP1 cells
2.4 NDV感染诱导稳定SG形成

为了研究NDV感染后不同时间点SG的形成情况，以1 MOI NDV感染Lenti-GFP-G3BP1细胞，不同时间点(6、12、18 h)固定细胞，直接免疫荧光法染色观察病毒蛋白NP与SG的特异性标志物G3BP1。结果显示：在NDV感染后6 h，细胞中基本没有SG形成，在12 h后，感染的细胞中(以病毒蛋白NP荧光为标志)有明显SG形成，随着感染时间的增加形成的SG的数目逐渐增加，说明NDV感染诱导形成稳定的SG(图 5)。

A. NDV感染Lenti-GFP细胞不同时间点检测SG形成；B.每个视野中GFP-G3BP1点状荧光细胞与所有细胞比值 A. Detection of SG formation at different time points post NDV infection; B. The ratio of GFP-G3BP1 dot fluorescent cells to all cells per high-powered fields (HPF) were quantified 图 5 NDV感染诱导稳定SG形成 Fig. 5 NDV infection induces stable information of SG
2.5 活细胞成像仪监测NDV感染诱导的SG形成

为了深入观察NDV感染诱导的SG形成过程，以1 MOI NDV感染Lenti-GFP-G3BP1细胞，在Cytation 5细胞成像多功能检测仪中进行观察和拍摄，每隔1 h拍摄1张GFP绿色荧光图像；阳性对照以ARS和热休克处理细胞，每隔30 s拍摄1张GFP绿色荧光图像。结果显示：ARS刺激后，13 min时，SG开始形成，15 min后，明显形成SG，20 min后，绝大多数细胞都形成SG(图 6A，movie S1)。热休克处理后，12 min时，少数细胞中开始出现少量SG聚集，15 min后，绝大多数细胞中形成明显的SG(图 6B, movie S2)。两者结果均与IFA结果基本保持一致。NDV Herts/33感染后11 h少数细胞中出现少量SG聚集，12 h后，多数细胞中有明显的SG聚集，随着感染时间的增加，最先形成SG的细胞产生细胞病变，具体表现为皱缩，细胞裂解(图 6C, movie S3)。ARS，热休克和新城疫病毒感染后的SG动态监测结果与IFA结果基本一致，说明本研究中以稳定表达GFP-G3BP1和检测方法建立成功，可用于后续新城疫病毒感染后SG的动态监测。

A. ARS处理Lenti-GFP-G3BP1细胞监测SG形成；B.热休克处理Lenti-GFP-G3BP1细胞监测SG形成；C. NDV感染Lenti-GFP-G3BP1细胞监测SG形成 A. Monitoring of SG formation in Lenti-GFP-G3BP1 cells treated with ARS; B. Monitoring of SG formation in Lenti-GFP-G3BP1 cells treated with heat shock; C. Monitoring of SG formation in Lenti-GFP-G3BP1 cells infected with NDV 图 6 ARS、热休克处理和NDV感染后SG形成动态监测 Fig. 6 Live cell imaging of SG formation in Lenti-GFP-G3BP1 cells after ARS, heat shock treatment and virus infection
3 讨论

慢病毒载体是通过对慢病毒进行重组而得到的一类载体，其类似于逆转录病毒载体，和逆转录病毒载体的不同之处在于：逆转录病毒只能感染分裂的细胞，而慢病毒载体则能感染非分裂细胞[17]。慢病毒载体是一种常用的研究工具，它有着比较高且稳定的转染率，能在细胞内稳定、持续、高效地表达[18-19]。本研究用到的pLenti-CMV-GFP-EF1a-Puro载体具有GFP绿色荧光标记，并且含有嘌呤霉素筛选标记，当GFP基因整合进入宿主细胞基因组DNA表达后，通过嘌呤霉素抗性筛选，亚克隆之后可获得稳定表达GFP-G3BP1的细胞系。G3BP1特异性分布于细胞质中，与TIA-1/R类似，在细胞应激后招募至SG中，且都是SG形成关键蛋白[7, 20]，与TIA-1/R相比，G3BP1形成的细胞质点状荧光更特异。而TIA-1/R应激后除了在细胞质中形成点状荧光，大部分还位于细胞核中，不易与空载体GFP区分开。因此，本研究选取G3BP1作为的特异性标志用以监测SG的形成。有研究表明：ARS、热休克处理和NDV感染诱导内源性G3BP1形成点状荧光，并且与TIA-1有共定位现象[8]。因此，利用ARS、热休克和NDV感染作为阳性刺激建立试验模型，对GFP-G3BP1细胞系进行评价。

目前, 针对病毒感染后SG的检测主要还是应用IFA方法[4, 8, 21]，但病毒调控SG的形成有多种方式，例如NDV诱导稳定SG形成[8]；流感病毒和日本脑炎病毒抑制SG形成[4, 21]；脊髓灰质炎病毒感染初期形成经典SG，后期其3C蛋白切割G3BP1，抑制SG形成[16]；丙肝病毒诱导SG呈现“动态振荡”，即病毒感染后反复历经多次SG形成和降解过程[22]。由于病毒感染后形成SG的复杂性，利用IFA选取感染后特定时间点收样检测SG就有很大弊端，因此，利用本试验建立的Lenti-GFP-G3BP1细胞核活细胞成像是检测病毒感染后SG形成的最优方案，能够作为研究病毒调控SG机制的工具。

近年来，越来越多证据表明，SG在动物病毒的致病过程中发挥关键作用。流感病毒抑制SG形成，而NS1是其抑制SG的关键蛋白[21]。传染性支气管炎病毒能够通过eIF-2α非依赖方式诱导SG形成[23]。猪繁殖与呼吸综合征病毒通过PERK依赖通路诱导SG形成[24]。机制方面，口蹄疫病毒的内部核糖体进入位点是重要的病毒翻译调控元件，SG关键蛋白G3BP1能够通过调控与IRES直接互作负调控翻译进程[25]。但总体来看，大部分研究还基于现象水平。为了进一步阐述SG调控病毒复制的机制，首先需要做到细胞水平对SG的监测。本研究丰富了SG研究手段，为病毒调控SG机制的研究奠定了基础。

4 结论

利用慢病毒系统构建了稳定表达GFP-G3BP1的单克隆细胞株，利用活细胞成像技术监测细胞在受到ARS、热休克处理和病毒感染后SG形成的动态变化。

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