2. 宁夏大学生命科学学院, 银川 750021
2. College of Life Science, Ningxia University, Yinchuan 750021, China
结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染所引起的传染性疾病。根据世界卫生组织全球结核病报告，2018年全球新增结核病例1 000万，死亡病例124万。同时由于多耐药结核菌株的出现和与人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)共感染情况的发生，结核病的防控难度大幅增加，人类公共卫生健康正面临巨大威胁[1]。
巨噬细胞作为Mtb的主要宿主细胞与靶细胞，当Mtb入侵时，巨噬细胞会主动吞噬病原菌并在内部与其发生复杂的相互作用[2]。在这一过程中，巨噬细胞会通过自噬等方式，控制病原体在体内的扩散[3]。自噬作为细胞的一种“清洁”进程，在引发时将需要被清除的胞内大分子，如错误折叠蛋白质、入侵的病原菌等标记，随后在多种蛋白因子的协助下，经过成膜、延伸和融合等过程，将大分子物质运送至溶酶体中，并使其完全降解。研究表明，巨噬细胞自噬是机体杀灭入侵的病原菌，并抑制其扩散的重要方式[4]。但是，作为一种胞内寄生菌，Mtb也演化出了多种策略，如下调自噬相关因子的表达、抑制自噬体酸化等方式逃避自噬对自身的杀伤作用[5-6]。这一博弈过程十分复杂，至今尚未完全阐明。
Mtb感染除了会引起巨噬细胞自噬的发生，还会导致胞内脂肪酸代谢的紊乱[7]。研究表明，Mtb感染会诱导巨噬细胞大量摄入脂质并形成泡沫细胞，摄入的脂质有助于Mtb的生存与生长[8]。同时，越来越多的研究发现，脂肪酸代谢与细胞自噬间存在相互联系。首先，自噬作为细胞能量代谢的重要组成部分，在细胞饥饿状态会被激活，通过降解三酰甘油等脂质分子，从而促进脂肪酸代谢通路的激活并提升细胞内ATP水平[9]。而在能量充裕的情况下，自噬进程则被抑制[10]。同时，某些脂肪酸分子作为信号通路的配体，能影响巨噬细胞的免疫应答，如棕榈酸等饱和脂肪酸可抑制自噬的发生[11]。脂肪酸结合蛋白4(FABP4)是巨噬细胞内的小分子载脂蛋白，在泡沫细胞形成的过程中大量表达，且能通过与脂肪酸结合进而调节细胞内部代谢进程和免疫反应[12]。研究表明，FABP4能调控膜转运蛋白（如CD36）的表达，控制脂肪酸的摄入[13]。在细胞内，FABP4可以与脂肪酸分子相互结合，降低游离脂肪酸分子脂毒性的同时还能稳定其含量。FABP4还能通过减弱核受体PPARγ的活性从而调控脂肪酸的分解代谢与合成[14]。同时，FABP4也可调控细胞的众多免疫反应，在心肌缺血再灌注损伤模型中研究发现，敲减FABP4会激活PI3K/AKT信号通路，进而影响细胞的免疫应答[15-16]。
综上所述，Mtb感染后，可通过调控细胞内某些因子的表达抑制细胞自噬，从而在细胞内长期存活。同时，作为胞内寄生菌，调控巨噬细胞的脂肪酸代谢对Mtb的存活也有重要作用。然而，在结核病中，FABP4作为脂肪酸代谢过程中的重要组成分子和信号通路中的重要传导分子与细胞自噬间的关系，尚未阐明。因此，本研究采用牛分枝杆菌疫苗株卡介苗(bacillus calmette-guérin，BCG)感染小鼠巨噬细胞RAW264.7引发自噬，通过小干扰RNA技术敲减FABP4蛋白的表达，并利用Western blot和免疫荧光等技术，检测自噬相关因子表达情况，从而明确FABP4对BCG诱导的巨噬细胞RAW264.7自噬与脂肪酸代谢的调控作用，并探讨其具体机制。上述研究对阐明结核病的发病机制，及其预防和治疗具有深远意义。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与抗体如非特殊说明，所有试剂均来自Sigma-Aldrich公司。高糖培养基(DMEM)购自Gibco公司，特级胎牛血清与磷酸盐缓冲溶液(PBS)购自BI公司，胰酶购自北京索莱宝科技有限公司，Middlebrook 7H9肉汤培养基购自BD公司，OADC添加剂购自青岛海博公司，OPTI-MEM购自Gibco公司，LipofectamineTM RNAiMAX购自美国Invitrogen公司，小干扰RNA购自上海吉玛制药技术有限公司，全蛋白提取试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，蛋白定量(BCA)试剂盒与蛋白Marker购自美国Thermo Fisher公司，增强型ATP检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液购自上海百赛生物技术股份有限公司。兔抗鼠β-actin单克隆抗体(货号60008-1-Ig)、兔抗鼠LC3多克隆抗体(货号14600-1-AP)、兔抗鼠mTOR多克隆抗体(货号20657-1-AP)、兔抗鼠CPT1A多克隆抗体（货号15184-1-AP）和HRP偶联的羊抗兔IgG抗体(货号SA00001-2)购自Proteintech公司，兔抗鼠ATG5单克隆抗体(货号#12994)、兔抗鼠ATG7单克隆抗体(货号#8558)、兔抗鼠ATG12单克隆抗体(货号#4180)、兔抗鼠p-ULK1单克隆抗体(Ser 555，货号#5869)和兔抗鼠AMPK单克隆抗体(货号#2535)购自Cell Signal Technology(CST)公司，兔抗鼠FABP4单克隆抗体(货号701158)与荧光素偶联的羊抗兔IgG抗体(货号A-11059)购自Invitrogen公司，细胞爬片、六孔板与十二孔板购自NEST公司，含DAPI防淬灭荧光封片剂购自中杉金桥公司，脂滴染料BODIPY-488 nm购自美国Invitrogen公司。
1.2 RAW264.7细胞培养RAW264.7细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，培养步骤：当细胞培养密度达90%时，吸弃培养液，加入胰酶消化3 min，800 r·min-1离心5 min；离心结束后，吸弃上清，重悬细胞，根据细胞数量，将细胞悬液平均分配到2~3个10 cm培养皿中，静置于37 ℃、饱和湿度、5% CO2浓度的细胞培养箱中继续培养，隔天观察细胞生长情况。
1.3 BCG培养牛结核分枝杆菌疫苗株BCG购自上海生物制品研究所，培养步骤：按培养基说明书提前配制Middlebrook 7H9培养基，并加入适量Tween-80(0.5%)，高压灭菌后，加入增菌剂(OADC)混匀，随后BCG培养斜面上挑取菌落，接种于培养液中，在37 ℃培养箱中静置培养，待BCG培养至合适浓度(OD600 nm=1.5)后进行传代操作。
1.4 小干扰RNA的构建根据FABP4 mRNA(NM_024406.3)序列设计合成小干扰RNA，干扰序列：Sense 5′-GACUUCCACAAGAGUUUAUTT-3′，Antisense 5′-AU-AAACUCUUGUGGAAGUCTT-3′；并设计合成Negative control(NC)，序列：Sense 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，Antisense 5′-AC-GUGACACGUUCGGAGAATT-3′。
1.5 小干扰RNA的转染取生长至对数期的RAW 264.7细胞接种到六孔细胞培养板中，每孔接入1×106个细胞；贴壁后进行转染操作，转染按照RNAiMAX试剂说明书进行，每孔加入转染试剂7~10 μL，20 μmol·L-1小干扰RNA 3~5 μL，24 h后，观察荧光强度以确定转染比例。
1.6 荧光酶标仪检测细胞内ATP水平RAW264.7细胞与六孔板中培养(1×106个·孔-1)，按照实验设计处理细胞，处理结束后裂解细胞，在4 ℃ 12 000 r·min-1离心细胞5 min，取上清备用。取黑色酶标板，每孔加入100 μL ATP检测工作液，室温孵育5 min, 去除本底ATP。每孔加入20 μL待测样品或稀释过的ATP标准液，常温孵育2 min后使用全波段酶标仪检测各孔荧光。
1.7 免疫荧光检测提前将细胞爬片置入12孔板中，每孔接种5×104个细胞，贴壁后按照试验组设计处理细胞。处理结束后，用4%多聚甲醛固定20 min，随后使用BODIPY-488染色15 min，最后，使用含DAPI的封片剂封片。或固定后加入0.5% TritonX-100室温通透30 min，3% BSA室温封闭1 h。封闭完成后，37 ℃孵育一抗(用3% BSA按照1:200比例稀释LC3或FABP4抗体)2 h，37 ℃孵育二抗(用PBS稀释)，最后用含DAPI的封片剂封片，使用激光共聚焦显微镜观察。
1.8 Western blot检测RAW264.7细胞以1×106个·孔-1接种于6孔板培养皿中，按试验设计处理后，使用南京凯基全蛋白提取试剂盒提取蛋白(按说明书操作)，并用BCA法试剂盒检测蛋白浓度后(按说明书操作)进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜后分别过夜孵育FABP4(1:2 000稀释)、AMPK(1:1 000稀释)、p-ULK1(1:1 000稀释)、ATG5(1:2 000稀释)、ATG7(1:2 000稀释)、ATG12(1:2 000稀释)、LC3(1:2 000稀释)、CPT1A（1:2 000稀释）以及β-actin(1:5 000稀释)蛋白抗体。
1.9 试验分组设计试验共分4组，分别为阴性对照组(NC)、BCG感染组(BCG)、FABP4敲减组(siRNA)和FABP4敲减结合BCG感染组(siRNA+BCG)；NC组和BCG组均转染小干扰RNA NC，FABP4敲减和siRNA+BCG组转染小干扰RNA FABP4，转染24 h后，BCG组和siRNA+BCG组感染BCG(MOI=10)12 h。
1.10 统计学分析所有试验数据均经过3次独立试验的验证，试验数据采用GraphPad Prism 9.0软件中的T-test或One Way ANOVA进行统计学分析，并经过Bonferroni校正，数据均使用均数±标准误(x±sx)表示。图中标注*代表显著差异(P < 0.05), **代表差异极显著(P < 0.01), ***代表差异极显著(P < 0.001)。
2 结果 2.1 小干扰RNA敲减细胞内FABP4表达FABP4是巨噬细胞内重要的载脂分子，在代谢类疾病中被认作是脂肪酸代谢紊乱的标记物。为研究BCG感染对巨噬细胞脂肪酸代谢的影响，通过Western blot检测BCG感染后FABP4的表达情况，结果表明，BCG感染显著上调FABP4的表达。为进一步研究FABP4在BCG感染巨噬细胞过程中的作用，笔者设计合成了FABP4小干扰RNA，转染细胞后通过免疫荧光检测FAPB4的表达情况，结果如图 1A，BCG感染显著增加细胞内FABP4的绿色荧光斑点，而FABP4小干扰RNA处理后，无论是否结合BCG感染，RAW264.7细胞中的绿色荧光均显著减少。随后，通过Western blot检测各处理组中FABP4表达差异，结果显示，与免疫荧光结果相同，FABP4小干扰RNA处理极显著下调BCG感染的巨噬细胞内FABP4的表达(P < 0.001)。
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A.免疫荧光检测细胞内FABP4的表达，FABP4为绿色，DAPI为蓝色(400×); B.Western blot检测各组FABP4表达差异。***. P < 0.001 A. Immunofluorescence was used to detect the expression level of FABP4. Green dots represent FABP4 protein and blue dots represent nucleus (400×); B. The expression of FABP4 were detected by Western blot. The results were analyzed by Image J. ***. P < 0.001 图 1 FABP4敲减效率的验证 Fig. 1 The verification of FABP4 knockdown efficiency |
结核分枝杆菌感染会促进巨噬细胞大量摄入脂肪酸并在细胞内累积成脂滴，FABP4在多种疾病模型中已被证实可调控脂肪酸的代谢与累积，然而FABP4在结核分枝杆菌感染过程中的作用尚不明晰。为检测FABP4敲减对BCG感染的巨噬细胞脂肪酸代谢的影响，本研究通过免疫荧光检测了细胞内脂肪酸的累积情况。结果如图 2A，BCG感染后细胞内绿色荧光斑点显著增加，代表细胞内脂肪酸含量上升，而FABP4小感染RNA可以显著减少细胞内绿色荧光斑点，即抑制了脂肪酸的累积。
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A.脂滴染色，绿色斑点为脂滴，蓝色斑点为细胞核(400×); B.ATP检测试剂盒检测各组ATP含量，随后用ATP产量除以细胞蛋白含量; C. Western blot检测各组FABP4表达差异; D.利用Image J对Western blot结果进行灰度值分析。*. P < 0.05, ***. P < 0.001 A. Lipid droplet dyed by Bodipy-488. Green dots represent lipid droplet and blue dots represent nucleus (400×); B. The level of ATP was detected by ATP assay kit; C. The expression of CPT1A were detected by Western blot; D. Semi-quantification of CPT1A. *. P < 0.05, ***. P < 0.001 图 2 敲减FABP4对脂肪酸代谢的影响 Fig. 2 The effect of FABP4 knockdown on fatty acid metabolism |
脂肪酸进入细胞后，会在线粒体膜蛋白肉毒碱棕榈酰移位酶1A(CPT1A)的作用下进入线粒体，通过脂肪酸β氧化被代谢产生ATP。因此，为检测细胞内的脂肪酸β氧化水平，本研究首先通过ATP生物荧光检测法，检测了细胞中ATP的变化，结果表明, BCG感染极显著上调了RAW264.7细胞内ATP的水平(P < 0.001)，而敲减FABP4进一步增加了BCG感染的巨噬细胞内ATP的产量(P < 0.05)。随后，本研究通过Western blot检测了CPT1A的表达差异，结果如图 2C、D，BCG感染显著上调了CPT1A的表达(P < 0.05)，而敲减FABP4进一步上调了CPT1A的水平(P < 0.05)。上述结果表明，敲减FABP4促进了BCG感染的巨噬细胞脂肪酸β氧化的进行，并抑制了脂肪酸的累积。
2.3 敲减FABP4抑制了BCG感染的巨噬细胞自噬LC3作为自噬重要标志蛋白，当自噬发生时LC3-I可跟PE结合转变为LC3-II(LC3B)并参与到自噬溶酶体的形成过程中。同时，本课题组的前期工作也已证实BCG感染可促进巨噬细胞自噬的发生[17]。为检测敲减FABP4对BCG感染的巨噬细胞RAW264.7自噬的影响，本研究利用免疫荧光技术检测了各处理组中LC3的表达情况，结果（图 3A）表明BCG感染后，细胞中的LC3斑点(绿色)数量与荧光强度均显著增加，而敲减FABP4后，细胞中绿色荧光斑点数量显著下降。同时Western blot检测结果（图 3B）显示，FABP4敲减显著降低了BCG感染的巨噬细胞内LC3B的水平(P < 0.05)。推测FABP4敲减抑制BCG感染的巨噬细胞RAW264.7自噬的发生。
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A.利用兔抗鼠LCB抗体进行免疫荧光染色，细胞核用DAPI(蓝色)进行复染(400×); B.Western blot检测各组LC3表达差异。*. P < 0.05, **. P < 0.01 A. The expression of LC3B was detect by Immunofluorescence. Green dots represent lipid droplet and blue dots represent nucleus (400×); B. The expression of LC3 were detected by Western blot. *. P < 0.05, **. P < 0.01 图 3 敲减FABP4对LC3B表达的影响 Fig. 3 The effect of FABP4 knockdown on regulating LC3B expression |
自噬发生过程包括前自噬体的形成、自噬体延伸与自噬溶酶体的成熟，此过程受到多种因子的调控，其中ATG蛋白家族作为自噬体延伸的重要参与蛋白，其表达量变化会直接影响自噬的发生进程。为进一步探讨敲减FABP4对BCG感染的巨噬细胞自噬的调控作用，笔者通过Western blot检测了巨噬细胞中ATG5、ATG7和ATG12的表达差异。如图 4所示，BCG感染后，巨噬细胞中ATG5、ATG7和ATG12的表达均极显著上调(P < 0.001, P < 0.001, P < 0.01)；然而，下调FABP4极显著抑制了BCG感染的巨噬细胞中ATG5、ATG7和ATG12的表达(P < 0.001)。综合上述结果，证实BCG感染显著促进了巨噬细胞自噬的发生，而敲减FABP4抑制了这一进程。
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A. Western blot检测自噬相关蛋白表达差异；B~D. ATG5/7/12灰度值分析。**. P < 0.01, ***. P < 0.001 A. The expression of autophagy related factors; B-D. Semi-quantification of ATG5/7/12. **. P < 0.01, ***. P < 0.001 图 4 敲减FABP4对自噬相关蛋白表达的影响 Fig. 4 The effect of FABP4 on regulating autophagy related factors |
研究表明，腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)通过磷酸化自噬起始关键蛋白ULK1激活自噬进程。为探讨敲减FABP4对巨噬细胞自噬的调控机制，本研究通过Western blot检测了AMPK与p-ULK1(Ser555)的表达变化，结果如图 5所示，BCG感染极显著上调了巨噬细胞中AMPK的表达水平(P < 0.01)，并显著增加ULK1的磷酸化水平(P < 0.05)；而敲减FABP4极显著下调了AMPK蛋白的表达(P < 0.01)，同时抑制了ULK1 Ser555位点的磷酸化(P < 0.01)。以上研究结果表明，敲减FABP4通过抑制AMPK-ULK1信号通路的激活抑制了BCG感染的巨噬细胞自噬的发生。
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A. Western blot检测AMPK通路相关蛋白表达差异; B~D. AMPK、p-ULK1 Western blot检测结果灰度值分析*.P < 0.05, **. P < 0.01, ***. P < 0.001 A. The expression of autophagy related factors; B-D.Semi-quantification of AMPK and p-ULK1. *. P < 0.05, **. P < 0.01, ***. P < 0.001 图 5 敲减FABP4对AMPK/ULK1表达的影响 Fig. 5 The effect of FABP4 on regulating AMPK/ULK1 expression |
Mtb作为一种胞内寄生菌，在感染巨噬细胞后会导致细胞自噬的发生[17]。大量研究表明，自噬的激活有助于巨噬细胞清除胞内寄生菌，从而抵抗感染[18-19]。此外，Mtb为了在巨噬细胞内长期存活，亦会通过多种方式抑制自噬进程，如有研究表明Mtb感染会促进巨噬细胞MIR144*的表达，进而抑制细胞自噬的发生[20]。最终自噬发生与否、病菌能否存活是众多调控因子博弈的结果，其间机制繁复，迄今尚不完全明晰。
Mtb感染除了会引起巨噬细胞自噬的发生，还会引起代谢通路的改变。Kim等[21]研究发现，结核分枝杆菌感染会刺激巨噬细胞大量摄入脂质，摄入的脂质以三酰甘油的形式存储在脂滴中并促使巨噬细胞形成泡沫细胞。笔者通过BODIPY染色，发现BCG感染后巨噬细胞内脂肪酸含量增加，这与前人研究相符。大量摄入的脂肪酸，一方面经CPT1A转运入线粒体，经脂肪酸β氧化进程产生ATP，为巨噬细胞免疫功能的执行提供能量支持[22]。另一方面，摄入的脂肪酸以脂滴的形式储存在巨噬细胞中，结核分枝杆菌可直接摄入这些脂肪酸分子，用以维持自身的物质与能量需求[23]。
巨噬细胞中参与调控自噬与脂肪酸代谢的因子众多，本研究发现，BCG感染巨噬细胞后会上调FABP4的表达。FABP4作为巨噬细胞内部的载脂蛋白，可以与多种脂肪酸分子结合，并调控糖代谢、脂代谢等多条代谢通路[24]。在卵巢癌的研究中发现，敲减FABP4会抑制内皮细胞中脂肪酸合成与累积，并促进脂肪酸的氧化，增加细胞内的ROS水平与氧化应激压力[25]。此外，FABP4对细胞的免疫应答也有重要作用。在心肌缺血再灌注损伤模型中研究发现，敲减FABP4的表达会促进PI3K/Akt通路的激活，进而影响细胞的免疫功能的执行[15, 26]。本研究发现，在BCG感染巨噬细胞过程中，敲减FABP4会促进脂肪酸氧化，并抑制细胞内脂肪酸的累积与细胞自噬的发生。
近年来研究发现，细胞自噬与脂肪酸代谢间存在复杂的相互作用关系[27]，而AMPK作为自噬和能量代谢的重要调控因子在此过程中发挥重要作用[28]。AMPK的激活受到细胞内ATP水平的影响，当细胞能量匮乏时被激活，进而促进自噬的发生。Singh等[9]证实，自噬可以将三酰甘油分解为脂肪酸，从而促进脂肪酸的β氧化。另一方面，AMPK也受到ATP的负反馈调节，当细胞因代谢旺盛导致产能过剩时，AMPK活性被抑制，进而关闭各代谢通路，并抑制细胞自噬的发生[29]。本研究发现，敲减FABP4促进了脂肪酸氧化的关键酶CPT1A的表达，上调了巨噬细胞ATP产量，并抑制了AMPK的表达。细胞自噬可分为自噬体的成膜、延伸与自噬溶酶体成熟3个阶段，其中ULK1是成膜阶段的关键调控元件。ULK1蛋白序列中有多个磷酸化位点，在正常情况下，mTOR磷酸化Ser757位点，抑制ULK1与AMPK的相互结合，而当AMPK被激活时，会磷酸化mTOR从而解除其抑制作用，同时磷酸化ULK1的Ser317、Ser555和Ser77等多个位点并激活自噬[30]。进一步p-ULK1与ATG5、ATG7和ATG12相互作用诱导自噬体膜的延伸，最终在LC3的作用下与溶酶体融合并成熟为自噬溶酶体[31-32]。因此，为进一步验证敲减FABP4对细胞自噬的调控作用，本研究检测了自噬相关因子的表达情况，研究结果表明，敲减FAPB4不仅抑制了BCG感染的巨噬细胞中AMPK的激活，还下调了p-ULK1(Ser555)、ATG5、ATG7、ATG12和LC3B的表达。综上所述，本研究认为在BCG感染巨噬细胞过程中，敲减FABP4通过抑制AMPK通路的激活从而阻止了自噬的发生。
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图 6 脂肪酸结合蛋白4对BCG诱导的巨噬细胞自噬的可能机制 Fig. 6 Proposed model for functional mechanism of FABP4 in regulating BCG induced RAW264.7 cell autophagy |
本研究尝试从代谢角度解释结核分枝杆菌感染诱导巨噬细胞自噬的作用机制（图 6），首次证实了脂肪酸结合蛋白4在BCG感染巨噬细胞中对脂肪酸代谢和细胞自噬的调控作用，研究结果将为Mtb致病机制的解读提供新的视角与理论依据。
4 结论BCG感染促进了巨噬细胞脂肪酸的摄入与FABP4的表达。在此过程中，敲减FABP4促进了脂肪酸的β氧化，从而下调了细胞内的脂肪酸含量并上调了ATP产量，进而抑制了AMPK通路的激活与细胞自噬的发生。
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